不同凍融次數下牦牛肉蛋白質氧化與保水性的關系

李婉竹，梁 琪*，張 炎，文鵬程

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

不同凍融次數下牦牛肉蛋白質氧化與保水性的關系

李婉竹，梁 琪*，張 炎，文鵬程

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

探討不同凍融次數下牦牛肉中的蛋白質氧化對其保水性的影響。選取3 歲左右的甘南牦牛背最長肌，經過7 次凍融循環，分別測定樣品的pH值、解凍損失率、蒸煮損失率、加壓失水率、羰基含量、巰基含量以及蛋白質溶解度。結果表明，隨著凍融次數的增加，pH值顯著降低（P＜0.05），解凍損失率、加壓失水率和蒸煮損失率反映的保水性也顯著降低（P＜0.05），羰基、巰基含量反映的蛋白質氧化程度顯著增加（P＜0.05），蛋白質溶解度中全蛋白、肌原纖維蛋白以及肌漿蛋白均呈現顯著下降（P＜0.05）。pH值、保水性和蛋白質氧化之間相關性顯著（P＜0.05），在7 次凍融過程中，pH值下降速率趨勢與保水性下降速率趨勢一致，并且后期保水性下降速率減緩的同時蛋白質氧化速率上升。表明多次凍融循環會引起牦牛肉蛋白質氧化程度顯著升高，造成保水性顯著下降，貯運體系中通過有效地控制蛋白質氧化可以更好地提高牦牛肉品質。

牦牛肉；凍融；保水性；蛋白質氧化

在全球肉類出口市場中，冷凍是肉類貯運優先選擇的方法[1]。牦牛放牧于海拔3 000 m以上的青藏高原高寒草地，由于交通及環境因素的制約，對于胴體的運輸，冷凍技術被應用最為廣泛，然而，在運輸、貯藏及銷售過程中的溫度波動會導致牦牛肉發生反復的冷凍和解凍，影響其肉的品質。

國內外研究人員已經注意到多次凍融對肌肉品質會產生不利的影響，造成持水性降低，而低持水性是引起產品品質下降的主要因素。Kim等[2]研究表明肌肉經反復凍融，形成的冰晶引起水分滲透和機械損傷，造成色澤、嫩度等肌肉品質的下降等。在凍融循環過程中環境中的氧氣加速了脂肪和蛋白質的氧化，Jeong等[3]研究發現新鮮牛肉中的硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）（0.387 mg/kg）顯著低于5 次凍融循環。此前關于凍融大多數集中在用不同濃度的氧化劑迫使肌肉發生氧化反應，對于了解實際機制存在局限性，而蛋白質氧化對肌肉汁液流失與品質劣變的影響機制不完全清楚[4]。

目前針對牦牛肉冷凍貯藏特性的研究極少，關于牦牛肉在凍融過程期間的蛋白質氧化特性的研究鮮見報道。基于以上研究，本實驗著重探討甘南牦牛肉在不同凍融次數條件下發生的蛋白質氧化對保水性的影響，通過多次凍融揭示蛋白質氧化與保水性的相關性，了解凍融次數對牦牛肉品質劣變的影響機制，以期為產業化有效提高牦牛肉的品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛背最長肌采自甘肅甘南藏族自治州瑪曲縣的3 歲左右健康放牧牦牛20 頭。

乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethyl ether) tetraacetic acid，EGTA）、二硝基苯肼 上海中秦化學試劑有限公司；鹽酸胍 天津市光復精細化工研究所；尿素 煙臺市雙化工有限公司；二硝基苯甲酸（5,5’-dithio bis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 上海源葉生物科技有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TGL-20M高速臺式冷凍離心機 上海謙科儀器有限公司；XHF-D高速分散器（內切式勻漿機） 寧波新芝生物科技股份有限公司；754PC型紫外-可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；QL-866旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；YYW-2型應變控制試無側限壓力儀 南京土壤儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

牦牛屠宰后立即取其背最長肌，剔除肉表面的筋、腱、膜及脂肪后，將肉樣切成質量100 g左右的肉塊，用聚乙烯食品保鮮袋包裝，裝入放有冰袋的保溫盒中運回實驗室。樣品隨機分為8 組，每組3 份平行，分別為凍融0、1、2、3、4、5、6、7 次。樣品循環凍融條件為在-18 ℃冷凍，4 ℃解凍12 h，每周凍融1 次。

1.3.2 pH值

將解凍后的肉樣用便攜式pH計進行測定，將探頭插入到肉樣中，使其電極與肌肉組織充分接觸，待pH計讀數穩定后記錄，每個肉樣測定3 次，取平均值。

1.3.3 解凍損失率的測定

肉樣分別在解凍前、后用吸水紙擦去表面滲出汁液并準確稱量質量。解凍損失率計算公式如下：

式中：m1為解凍前肌肉質量；m2為解凍后肌肉質量。

1.3.4 蒸煮損失率的測定[5]

將準確稱質量后的肉樣（2 cm×2 cm×3 cm）裝入蒸煮袋中封好，在恒溫水浴中加熱至肉樣的中心溫度達到75 ℃，取出冷卻至室溫，再用吸水紙吸干表面汁液后進行稱量質量，蒸煮損失率計算公式如下：

式中：m3為蒸煮前肌肉質量；m4為蒸煮后肌肉質量。

1.3.5 加壓失水率

采用Farouk等[6]的方法。測定肉樣在35 kg壓力下保持5 min的水分損失量，加壓前后分別稱量質量，加壓條件下的保水性可以用加壓失水率表示，加壓失水率計算公式如下：

式中：m5為加壓前肌肉質量；m6為加壓后肌肉質量。

1.3.6 肌原纖維蛋白的制備

參照Park等[7]的方法。將切碎的肉塊與4 倍體積的分離緩沖液（0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L Na3PO4、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA，pH 7.0）混合勻漿后離心（4 ℃、2 000×g、15 min），所得沉淀重復洗滌，離心2 次。隨后再按上述操作用4 倍體積0.1 mol/L NaCl 溶液洗滌，離心2 次，并在最后1 次離心前用3 層紗布過濾，再用0.1 mol/L HCl溶液將其pH值調至6.0，得到肌原纖維蛋白于-20 ℃冷凍儲藏。用考馬斯亮藍法對肌原纖維蛋白濃度進行測定，采用牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.3.7 羰基含量測定

參照Levine等[8]的方法在1.5 mL的離心管中，加入0.1 mL的蛋白液與0.5 mL 0.02 mol/L 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液，在25 ℃反應40 min，空白樣品中加入0.5 mL不含2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液。然后在上述反應液中分別加入0.5 mL質量分數為20%的三氯乙酸，振蕩后離心（4 ℃、11 000×g、5 min）棄上清液，蛋白質沉淀用1 mL的乙醇-乙酸乙酯溶液（1∶1，V/V）洗滌3 次，揮發完溶劑后將蛋白質懸浮于1 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37 ℃條件下水浴30 min。以空白為對照于λ370nm波長下測吸光度，每組樣品測量3 個平行，結果取平均值。羰基含量計算公式如下：

式中：A為370 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數22 000/（L/（mol·cm））；ρ為蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 總巰基含量測定

根據Srinivasan等[9]的方法，將蛋白液稀釋至2 mg/mL，與尿素緩沖液按1∶1比例溶解，孵育后用加入0.5 mL DTNB試劑，在室溫反應15 min，在λ412nm處測吸光度。空白組加入0.5 mL不含DTNB的緩沖液，每組樣品測量3 個平行，結果取平均值。巰基含量計算公式如下：

式中：A為412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數11 400/（L/（mol·cm））；ρ為蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

1.3.9 蛋白質溶解度

根據Joo等[10]的方法，肌漿蛋白：2.5 g肉樣加50 mL冰預冷的0.025 mol/L的磷酸鉀緩沖溶液（pH 7.3），勻漿（6 500 r/min）20 s×3 次，4 ℃搖勻12 h。5 700×g離心10 min，取上清液，用考馬斯亮藍測定蛋白濃度。溶解度表示為mg/g肉。

總蛋白溶解度：2.5 g肉樣加50 mL冰預冷的1.1 mol/L碘化鉀的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液溶液（pH 7.3），勻漿（6 5 0 0 r/m i n）2 0 s×3 次，4 ℃搖勻12 h。 5 700×g離心10 min，取上清液，用考馬斯亮藍測定蛋白濃度。溶解度表示為mg/g肉。肌原纖維蛋白溶解度計算公式如下：

肌原纖維蛋白溶解度=總蛋白溶解度-肌漿蛋白溶解度 （6）

1.4 數據分析

數據采用Origin 8.0與SPSS 19.0軟件進行處理。采用方差分析，采用鄧肯氏多重比較方法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 凍融次數對牦牛肉pH值的影響

圖1 凍融次數對牦牛肉pH值的影響Fig. 1 Effects of freeze-thaw cycles on pH of yak meat

肌肉中的pH值主要依賴于肌肉中肌糖原的存在，是影響肉品持水性的主要因素之一。肌肉最初的pH值增加或是降低和氧化速率、滴水損失等有關[11]。由圖1可以看出，隨著凍融次數的增加，pH值顯著降低（P＜0.05）。肉樣中pH值呈現持續降低的趨勢，這是由于pH值會影響蛋白質分子的離子化作用和凈電荷值，從而影響蛋白分子間的吸引力和排斥力以及蛋白分子與水分子的結合能力[12]。在反復凍融過程中，解凍使得糖酵解增加和磷酸化酶的激活而導致pH值降低[13]。同時得出，前期3次凍融，pH值下降了6.97%，后期凍融過程中pH值下降了2.07%，說明在后期凍融過程中，pH值的下降速率逐漸降低，當pH值下降到肌原纖維蛋白質等電點附近的時候，肌肉蛋白質所帶的正負電荷大致相等，凈電荷為零，肌肉蛋白質對水分的吸引力最低，導致水分大量流失[14]，后期水分流失達到飽和，溶質濃度不再增加，使得pH值下降不顯著（P＞0.05），基本保持一致[15]，pH值的變化過程是復雜的，其具體機制有待深入研究。在解凍過程中，水溶性蛋白質的析出，微生物代謝產物的變化，都可能對肉品pH值產生影響。

2.2 凍融次數對牦牛肉保水性的影響

隨著凍融次數的增加，肉中的細胞液從組織內部不斷滲出，不僅影響其外觀，而且使肌肉中的營養成分流失和汁液流失增加。從表1可以看出，隨著凍融次數的增加，pH值顯著降低（P＜0.05），解凍損失率、加壓失水率和蒸煮損失率反映的保水性也顯著降低（P＜0.05）。在前3 次凍融循環中，解凍損失率、蒸煮損失率和加壓失水率分別增加了67.89%、23.51%和53.24%，而在后4 次凍融循環中分別增加了23.90%、20.76%和10.38%，說明在后期凍融過程中，保水性的下降速率有所變慢。這可能是因為肌肉被冷凍后水分在凍結過程中體積的增加使肌細胞的細胞膜凍裂[16]，而后由于在解凍時細胞中的汁液滲漏較多。導致較高的解凍失水率，而在反復凍融次數增多時水分丟失達到飽和[17]。楊巧能等[18]研究發現牦牛肉在成熟過程中蒸煮損失率和失水率同樣呈先上升后下降的趨勢，說明肌肉保水性與pH值有關。

Wang Hang等[19]研究表明肌肉不斷的進行凍結-解凍過程，會引起冰晶不斷再形成、對肌肉細胞膜和細胞器造成機械損傷，肌肉的持水能力下降，肌肉的蒸煮損失率、解凍損失隨著凍融次數的增加而增大。Rahman[11]和Leygonie[20]等報道滴水損失和蒸煮損失率都會受到凍融循環的影響，這與本研究結果一致。本研究發現，結果表明肌肉的保水性與宰后pH值的下降速率度密切相關，宰后pH值下降速率越快，保水性下降速率就會越大，并且凍融前期下降速率明顯高于后期，隨著凍融次數的增加，肉品質急劇下降。

表1 凍融次數對牦牛肉保水性的影響Table 1 Effects of freeze-thaw cycles on water holding capacity of yak meat

2.3 凍融次數對牦牛肉羰基含量的影響

圖2 凍融次數對牦牛肉羰基含量的影響Fig. 2 Effects of freeze-thaw cycles on carbonyl group content of yak meat

蛋白質氧化導致不同蛋白質產物的形成，比如氨基酸側鏈的芳香烴羥基化，硫醇氧化以及羰基化合物的形成，后來被廣泛作為不同肉制品中蛋白質氧化的一個通用標記[21]，因此，蛋白質氧化的程度可以通過羰基的量化來評估[22]。由于蛋白質肽鏈上帶有NH—及NH2—基團，其氨基酸側鏈受到自由基的攻擊，使其斷裂形成羰基，從而導致羰基含量的增加，羰基值越大蛋白質氧化程度越大[23-24]。通過分析牦牛肉在凍融過程中羰基含量變化，可以反映牦牛肉在凍融條件下蛋白質氧化程度及其品質變化。從圖2可以看出，隨著凍融次數的增加，牦牛肉蛋白質羰基含量顯著增加（P＜0.05）。第7次凍融后，羰基含量高達9.48 nmol/mg，與第0次凍融的6.04 nmol/mg有明顯差異（P＜0.05）。表明反復凍融會產生大量的活性氧自由基，使牦牛肉蛋白質的氨基酸側鏈NH—或NH2—基團部分轉化為羰基基團。同時發現，凍融3 次后，羰基含量增加了17.37%，后4 次凍融過程中，羰基含量增加了18.35%，該結果說明，雖然后期保水性下降速率有所降低，但是氧化速率在不斷增加。

2.4 凍融次數對牦牛肉巰基含量的影響

圖3 凍融次數對牦牛肉巰基含量的影響Fig. 3 Effects of freeze-thaw cycles on sulfydryl group content of yak meat

肌肉蛋白質的變性和聚集與二硫鍵的形成有關，在早期蛋白質氧化過程中，巰基轉變成二硫鍵或其他氧化產物[24]。由圖3可知，牦牛肉中蛋白質巰基含量隨凍融次數的增加顯著降低（P＜0.05），經7 次凍融后，牦牛肉蛋白質巰基含量降低至32.12 nmol/mg。通常蛋白質氧化程度越高總巰基含量越低。羥自由基誘導的蛋白質氧化，使細胞遭到破壞，導致蛋白質中巰基轉化成二硫鍵，從而造成蛋白質巰基含量下降[25]。巰基對于穩定肌原纖維蛋白完整的空間結構具有十分重要的意義，因此蛋白質空間結構的伸展同樣會造成巰基含量的顯著降低[26-27]，從而直觀地反映出蛋白質的氧化程度。因此，分析巰基含量的變化可以從另一個方面反映在凍融條件下的蛋白質氧化效應。同時從本實驗結果可以看出，經過3 次凍融的牦牛肉巰基含量降低了6.38%，后期凍融過程中，巰基含量降低了20.03%，表明前期凍融循環巰基含量明顯低于后期，說明凍融循環后期的氧化速率高于前期氧化速率。

2.5 凍融次數對牦牛肉蛋白質溶解度的影響

圖4 凍融次數對牦牛肉蛋白質溶解度的影響Fig. 4 Effects of freeze-thaw cycles on protein solubility

從圖4可以看出，隨著凍融次數的增加，全蛋白溶解度從新鮮的111.51 mg/g經過7 次凍融后降低到58.11 mg/g，降低了53.4 mg/g，表明增加凍融次數會使全蛋白質溶解度顯著下降（P＜0.05）。同時從圖5可以發現，凍融3 次后，全蛋白溶解度降低了28.12%，后4 次凍融過程中，降低了31.65%，即后期凍融過程中的全蛋白溶解度下降速率高于前期下降速率。另外，冷凍儲藏過程中肌原纖維蛋白的減少是蛋白質變性的一個主要指標，肌原纖維蛋白溶解度從新鮮的79.88 mg/g經過7 次凍融后降低到38.35 mg/g，這是由于肌原纖維蛋白部分結合水形成冰晶，使得肌動球蛋白分子之間可以相互形成非共價鍵（疏水鍵和氫鍵），進而形成超大分子的不溶性凝集體，導致在反復凍融過程中其溶出量不斷下降所致。肌肉蛋白質的溶解性會隨著凍藏過程中蛋白質的變性而降低，表現在蛋白質的可提取性降低。而與全蛋白和肌原纖維蛋白溶解度變化相比，肌漿蛋白的溶解度呈現出相對平緩的下降趨勢，這可能是由于肌肉在解凍過程中滲出液的流失所致[28]。Leygonie等[20]研究表明，隨著凍融次數的增加，蛋白質發生氧化，引起蛋白聚合，肽斷裂，從而使得基質蛋白類不穩定，導致蛋白質溶解度降低，保水性下降等。因此隨著凍融次數的增加，蛋白質溶解度基本顯示出顯著性降低（P＜0.05），即肉樣的保水性隨之顯著下降的規律。

2.6 牦牛肉各品質指標相關性分析

表2 牦牛肉各品質指標相關性分析Table 2 Correlation analysis among various quality parameters of yak meat

由表2可知，凍融次數與保水性呈現較高的相關性，其中凍融次數與pH值、解凍損失率均呈現極顯著相關（P＜0.01），同時，pH值與解凍損失率、失水率呈極顯著負相關（P＜0.01），與蒸煮損失率呈顯著負相關（P＜0.05），表明隨著凍融次數的增加，pH值降低，肌肉蛋白質靜電荷減少，蛋白質之間排斥力減小使得蛋白質分子相互靠近，分子之間空間縮小而將分布在其中的水分擠出，從而使得保水性也逐漸下降。同時由表2可看出，凍融次數與蛋白質氧化也呈現極顯著相關性（P＜0.01），說明凍融次數的增加引起肌原纖維以及基質中多數蛋白氧化變性，同時，pH值和解凍損失率與羰基和巰基以及蛋白質溶解度相關性極顯著（P＜0.01），表明隨著機械組織的破壞，細胞膜的破裂，能溶解于肌肉汁液中的全蛋白也會隨之流失，也就說明了隨著凍融次數的增加蛋白質溶解度的降低導致了肌肉的保水性削弱，同時蛋白質氧化造成的交聯、降解及變性都會導致肌肉持水性的降低而影響肌肉的品質[29-30]。因此可以得出隨著凍融次數的增加，保水性與蛋白質氧化相關性極顯著（P＜0.01）。

3 結 論

反復凍融導致牦牛肉保水性顯著削弱，隨著凍融次數的增加，解凍損失率、蒸煮損失率和加壓失水率顯著降低（P＜0.05），肌肉中水分的流失，使得肌肉溶質濃度的增加，從而導致pH值下降。同時宰后pH值下降速率越快，保水性下降速率就會越大，因此有效的控制pH值可以提高牦牛肉保水性。反復凍融循環促進了牦牛肉蛋白質氧化，并且隨著凍融次數的增加，蛋白質氧化程度顯著升高（P＜0.05），并且后期凍融過程中保水性下降速率變慢的同時氧化速率加快。凍融次數與保水性、蛋白質氧化呈現極顯著相關性（P＜0.01），其中羰基、巰基、蛋白質溶解度等蛋白質氧化相關指標與pH值、解凍損失率、蒸煮損失率等保水性相關指標相關性顯著（P＜0.05），說明隨著凍融次數的增加，牦牛肉蛋白質氧化程度與保水性下降呈顯著相關性，在牦牛肉生產加工過程中控制蛋白質氧化速率對提高保水性有重要作用。

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Relationship between Protein Oxidation and Water Holding Capacity of Yak Meat under Freeze-Thaw Cycles

LI Wanzhu, LIANG Qi*, ZHANG Yan, WEN Pengcheng
(Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu Province, College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

This study was designed to explore the effect of freeze-thaw cycles on the protein oxidation and water holding capacity of yak meat and also to investigate the relationship between the two parameters. Longissimus dorsi samples were collected from the carcass of 3-year-old Gannan yaks, and the changes in pH, thawing loss, cooking loss, pressurized water loss, carbonyl group and total sulfydryl group contents and protein solubility of repeatedly frozen-thawed yak meat were analyzed. The results showed that with an increase in the number of freeze-thaw cycles, pH was significantly decreased as well as water holding capacity (thawing loss, pressurized water loss and cooking loss) were significantly decreased (P ＜ 0.05),the degree of protein oxidation (carbonyl group and total sulfydryl group contents) was significantly increased (P ＜ 0.05),and total, myofibrillar and sarcoplasmic protein solubility were significantly decreased (P ＜ 0.05). pH was significantly correlated with water holding capacity and protein oxidation (P ＜ 0.05). During 7 freeze-thaw cycles, pH decreased at a rate similar to water holding capacity. Moreover, after the fourth cycle, the rate of decrease in water holding capacity was slowed down and the rate of protein oxidation was speeded up. All these results demonstrated that freeze-thaw cycles gave a rise to a significant rise in the degree of protein oxidation and caused a significant reduction of the water holding capacity of yak meat. Therefore, controlling protein oxidation during storage is effective in enhancing the quality of yak meat.

yak meat; freeze-thaw cycles; water holding capacity; protein oxidation

10.7506/spkx1002-6630-201802003

TS211.7

A

1002-6630（2018）02-0014-06

李婉竹, 梁琪, 張炎, 等. 不同凍融次數下牦牛肉蛋白質氧化與保水性的關系[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 14-19.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802003. http://www.spkx.net.cn

LI Wanzhu, LIANG Qi, ZHANG Yan, et al. Relationship between protein oxidation and water holding capacity of yak meat under freeze-thaw cycles[J]. Food Science, 2018, 39(2): 14-19. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802003. http://www.spkx.net.cn

2016-11-01

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B01）

李婉竹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為畜產品加工。E-mail：544915072@qq.com

*通信作者簡介：梁琪（1969—），女，教授，博士，研究方向為食品品質、食品科學。E-mail：liangqi@gsau.edu.cn