白絲北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的異源表達及酶學性質分析

陳 穩，李由然，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽*

白絲北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的異源表達及酶學性質分析

陳 穩，李由然，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽*

（江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

為實現從L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的高效生物轉化，將來源于白絲北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，LGOX）在大腸桿菌（Escherichia coli）中實現異源表達，并研究其酶學特性。根據LGOX的氨基酸序列和大腸桿菌系統偏好性合成LGOX全基因序列，并通過pET28a（＋）/DE3系統在大腸桿菌中實現了功能表達。誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）終濃度為0.1 mmol/L，20 ℃誘導18 h，重組大腸桿菌粗酶液酶活力可達49.10 U/mL。親和層析獲得酶比活力為45.98 U/mg純酶，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶顯示蛋白分子質量大小約為70 kDa。酶學性質研究表明：其最適反應溫度和pH值分別為40 ℃和6.0；Km值為1.23 mmol/L，Vmax值為76.24 μmol/（min·mg），L-谷氨酸為該酶的最適底物。本研究確定了LGOX在E. coli BL21中的異源表達及酶學特性，為生物轉化合成α-KG提供了新的參考途徑。

白絲北里孢菌；L-谷氨酸氧化酶；α-酮戊二酸；異源表達；酶學性質

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）作為三羧酸循環和氨基酸代謝中重要的二元氨基酸，在氨基酸形成和氮代謝中起關鍵作用。它也廣泛用于各種醫藥和食品領域，如用作化學合成藥物的前體物質[1]、膳食補充劑[2]、注射室化合物和創傷恢復性化合物等[3]。α-KG和三醇（丙三醇、1,2,4-丁三醇、1,2,6-已三醇）中的任意一個發生熱縮聚反應形成聚三醇-α-酮戊二酸化合物可能在生物醫學中有潛在的應用[4]。微生物體內主要在三羧酸循環途徑中形成α-KG，外源碳源物質進入細胞后，經糖酵解形成丙酮酸，再由丙酮酸轉化成α-KG，α-KG又在酮戊二酸脫氫酶系作用下代謝成琥珀酸輔酶A，進入下一碳代謝節點；此外，α-KG可經轉氨基作用形成L-谷氨酸進入氮代謝，在某些微生物中L-谷氨酸也可被氧化形成α-KG，但絕大多數微生物群體內或體外都不積累α-KG。目前，工業上生產α-KG主要有化學合成法、微生物發酵法和生物轉化法。其中化學合成法生產過程中有毒化合物和有毒溶劑會對環境產生巨大危害，不符合綠色生物制造的發展趨勢[5]；微生物發酵法（細菌和酵母）由于合成路線長，伴隨多個電子傳遞和能量傳遞過程，受調控復雜，收率低，很難達到工業化的生產要求[6-8]；而生物轉化法通過酶轉化和細胞轉化合成目的產物[9-10]，相較于前兩種方式生產條件更為簡單、溫和，且生產過程中基本無副產物的積累，便于后續分離提取，是最具應用前景的生產方式。

L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，LGOX）可催化L-谷氨酸生成α-KG，它是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（f l avin adenine dinucleotide，FAD）為輔酶的黃素酶，但因其本身含有一個非共價結合的FAD，因此又能在不加外源性輔助因子FAD條件下完成催化反應[11-12]。LGOX對催化反應底物有著很強的底物專一性，且催化效率高，反應條件溫和，因此利用LGOX生物轉化生產α-KG引起了廣大研究者的興趣[13]。同時，LGOX也可被用于臨床實驗檢測γ-谷氨酰基轉移酶、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性[14]，及用于測定肌酐、血氨等含量[15]。生物傳感器中也經常使用LGOX測定L-谷氨酸含量[16]。

1983年，Kamei等[17]從Streptomyces violascens中發現LGOX，并確定了其催化反應后所生成產物，將其歸納為黃素酶類。目前，現有LGOX的報道都來自鏈霉菌屬：Kusakabe等[18]率先從Streptomyces sp. X-119-6中發現較強底物專一性的LGOX，但粗酶液酶活力僅為0.056 U/mg；為進一步提高LGOX的表達量，Arima等[11]將Streptomyces sp. X-119-6來源的LGOX基因在大腸桿菌（Escherichia coli）JM109中實現重組表達并分析其蛋白結構，獲得2.42 U/mg的粗酶液，酶比活力比原始菌中提高了43.2 倍，但熱穩定性迅速降低，該重組酶在pH 7.4、30 ℃溫浴0.5 h僅剩50%酶活力；2013年，盧嬋等[19]又將該來源的基因連接至pET28a表達載體上，實現了在E. coli BL21中的重組表達，并發現該重組酶在50 ℃保溫10 min，酶活力迅速降為原來的15%，說明該酶的穩定性較差。為尋找一株熱穩定性良好、可實現工業應用的菌株，Niu等[10]將來自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表達，經HisTrapTMFF親和層析柱純化后其酶比活力達到9.54 U/mg，熱穩定性研究顯示該重組酶在50 ℃溫浴1 h后，其酶活力亦迅速降為原來的30%。綜上LGOX酶學特性分析發現，來源于鏈霉菌的LGOX普遍存在酶學性質不穩定或表達量低等問題，難以滿足利用該酶工業化生產α-KG的條件。

白絲北里孢菌（Kitasatospora setae）是一類放線菌，是1982年由Omura等[20]發現的一個新屬，其生理特征、遺傳特性及蛋白結構與鏈霉菌有諸多不同，其主要特征是菌體細胞壁同時含有L,L-二氨基庚二酸和meso-二氨基庚二酸兩個組分，并含有甘氨酸和半乳糖，可產生多種抗生素[21]，而對該菌株產酶及其基因來源酶類的異源表達鮮有報道。本研究將來源于K. setae的LGOX，根據E. coli系統合成該基因，經重組轉化到E. coli BL21中過量表達LGOX，經親和層析純化后，研究重組酶的酶學性質發現該酶具有突出的熱穩定性，具備應用于α-KG生物轉化的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coli JM109為本實驗中質粒構建和保藏菌株，E. coli BL21（DE3）為過表達目的基因的宿主菌，質粒pET-28a（＋）為含有T7強啟動子的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導型表達質粒，上述菌株與質粒均由本實驗室保藏。

DNA片段純化、膠回收和質粒提取試劑盒 北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；TA克隆載體、T4 DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶、限制性內切酶等工具酶 寶生物工程（大連）有限公司；標準分子質量蛋白 美國Thermo Scientific公司；蛋白胨、酵母粉 英國Oxiod公司；十二烷基硫酸鈉、卡那霉素（kanamycin，Kan）、瓊脂糖、IPTG、牛血清蛋白美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PCR儀、Chemi Doc XRS＋凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；AB204-N分析天平 梅特勒-托利多有限公司；CF16RXⅡ型冷凍離心機、CT15RE型臺式微量高速離心機 日本Hitachi公司；AF100雪花制冰機 意大利Scotsman公司；pHS-3TC型pH計 德國賽多利斯股份公司；MLS-3750型全自動高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；VC750型超聲波細胞破碎儀 美國Sonics公司；DYY-6B凝膠水平電泳儀 北京市六一儀器廠；AKTA蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司；HYL-C多功能組合式搖床 太倉市強樂實驗設備廠；SF-CJ-2超凈工作臺 上海三發科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LGOX密碼子優化合成

參照NCBI中來源于K. setae菌屬的LGOX的氨基酸序列（Accession編號：BAJ32332），根據E. coli系統密碼子偏好性及使用頻率，在不改變氨基酸序列的前提下減少序列中可能存在的穩定的二級結構區域，防止終止子使轉錄提前終止，同時在序列的5’端和3’端分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點，利用利用密碼子優化軟件GeneOptimizer對LGOX基因進行優化，交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成LGOX基因，連接至pUC57-T載體上，命名為pUC57T-LGOX。

1.3.2 LGOX表達載體的構建

用NdeⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切pUC57T-LGOX質粒、pET-28a（＋）質粒。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收1 830 bp的目的片段，與雙酶切后的pET-28a（＋）質粒載體經T4連接酶過夜連接，連接產物轉化至E. coli BL21感受態細胞，涂布Kan平板37 ℃過夜培養后，挑取單克隆轉化子經PCR和酶切驗證獲得重組表達載體pET28a-LGOX，同時將含有上述重組載體的重組菌命名為E. coli BL21/pET28a-LGOX。

1.3.3 重組LGOX在E. coli中的誘導表達

將含有重組表達載體pET28a-LGOX的重組菌接入LB培養基中過夜活化后，轉接3%的接種量至TB培養基中37 ℃培養，至OD600nm約為1.2時，分別加入不同濃度的IPTG，于不同溫度誘導培養不同時間，探討了誘導劑IPTG終濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2 mmol/L）、誘導時間（3、6、9、12、15、18、21 h）和誘導溫度（20、25、30、37 ℃）對重組LGOX表達影響。

1.3.4 重組蛋白的純化

12 000 r/min離心2 min收集經發酵誘導培養后的細胞，用20 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液洗滌菌體2 次，最后用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎6 min（工作1 s，間歇2 s），冷凍離心收集上清液。采用HisTrapTMFF親和層析柱純化重組蛋白，用A液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，100 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗去非特異性結合的雜蛋白，用B液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗下目的蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白純度。

1.3.5 LGOX活力測定[22]

反應體系中包括12 mmol/L L-谷氨酸、0.2 mmol/L 4-氨基安替比林、1 mmol/L N,N-二甲基苯胺、2 U/mL辣根過氧化物酶，總反應體系為3 mL（pH 7.0）。加入100 μL稀釋后的酶液，于37 ℃反應10 min后，立即測定其在550 nm波長處的吸光度。1 個酶活力單位的定義為：37 ℃條件下反應1 min生成1 μmol過氧化氫所需的酶量。

式中：A550nm為550 nm波長處的吸光度；14.3為每毫摩爾醌亞胺混合物的消光值；3.1為總反應液體積/mL；0.1為酶液體積/mL；10為反應時間/min；C為稀釋倍數。

1.3.6 LGOX純酶酶學性質分析

1.3.6.1 最適反應溫度和溫度穩定性

將等量的純酶于4、20、25、30、37、40、45、50、55、60、70、80 ℃條件下測定酶活力，以反應所測的最高酶活力為100%，計算其他不同溫度下的相對酶活力，探討溫度對LGOX活力影響。

將等量酶液分別于4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下恒溫放置1 h后，測定酶活力，以反應所測的最高酶活力為100%，考察LGOX在不同溫度的熱穩定性。

1.3.6.2 最適反應pH值及pH值穩定性

將等量的酶置于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5），0.1 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5），0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.0、8.5、9.0）中，于37 ℃反應測定酶活力，以所測的最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，考察該酶在不同pH值條件下的酶活力影響。

將等量的純酶分別于pH 3.0～9.0、4 ℃放置12 h后，測定酶活力，以所測最高酶活力為100%，考察不同pH值條件下LGOX的pH值穩定性。

1.3.6.3 底物特異性

用不同氨基酸溶液替代L-谷氨酸，測定LGOX活力，以L-谷氨酸為底物測定的活性定義為100%，獲得其他不同底物的相對活性。

1.3.6.4 外源金屬離子對LGOX活力影響

向反應體系中加入2 mmol/L的不同金屬離子（Ni＋、K＋、Ba2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ca2＋、Mn2＋、Co＋），測定LGOX活力，以不加金屬離子測定的酶活力為100%，獲得相應的添加金屬離子后的相對酶活力。

1.3.6.5 動力學參數測定

在最適反應溫度與pH值條件下，測定不同L-谷氨酸底物濃度（0.5～15 mmol/L）條件下的反應速率，計算其Km與Vmax值。

1.3.7 酶液中蛋白含量的測定

蛋白含量測定采用Bradford法[23]。

2 結果與分析

2.1 K. setae來源的LGOX氨基酸序列分析及密碼子優化

將K. setae來源的LGOX的610個氨基酸序列，提交至NCBI數據庫中（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對，MEGA 5軟件繪制進化樹（圖1）發現該酶的氨基酸序列與來源于鏈霉菌同類酶的同源性較低，約為40%，進化樹表明兩者具有同一根，不同節點，都屬放線菌科，兩類LGOX進化枝長相差較大，可能是因為隨著時間的進化，保守區域變化不大，非保守區的部分氨基酸序列發生了不定向進化，引起蛋白結構區域部分變化，而影響酶的部分催化特性[24]。

圖1 鏈霉菌與北里孢菌來源的LGOX氨基酸序列進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of LGOX from streptomycete and Kitasatospora

在網站http://www.kazusa.or.jp/codon/上查詢大腸桿菌主要具有UAG、UGA、CUA、CGA、CGG、AUA、AGA、AGG等稀有密碼子，優化后密碼子幾乎全是大腸桿菌所偏好的，LGOX基因序列比對（圖2）發現合成基因序列中GC含量從原始菌的45.3%提高到53.6%，兩者具有77.76%的同源性，其中替換了407 個堿基和371 個密碼子，密碼子替換比例達60.8%。合成的序列連接至pUC57-T載體上，獲得含目的基因的重組質粒pUC57T-LGOX。

將克隆載體pUC57T-LGOX經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，割膠回收1 830 bp的LGOX基因片段與經相同酶切的pET28a（＋）表達載體連接并轉化至E. coli BL21（DE3），轉化子質粒經NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，獲得5 331 bp及1 830 bp兩條DNA條帶，與DNA序列分析結果一致，獲得重組載體pET28a-LGOX，及重組菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-LGOX，驗證結果如圖3所示。

圖2 LGOX基因序列比對圖Fig. 2 Sequence alignment between original and synthetic LGOX gene

2.2 重組表達載體的構建

圖3 重組質粒pET28a-LGOX雙酶切Fig. 3 Identif i cation of recombinant plasmid pET28a-LGOX by double enzyme digestion and PCR

2.3 重組LGOX的表達

重組菌誘導發酵，超聲破碎，經SDS-PAGE蛋白條帶檢測（圖4），在2、4泳道中70 kDa附近有一明顯目的條帶，而對照組1、3泳道中則無明顯蛋白條帶，說明重組菌在大腸桿菌實現部分可溶性表達；本研究中胞外蛋白濃度較低，SDS-PAGE檢測5、6泳道未顯示明顯條帶。

圖4 重組LGOX在E. coli BL21（DE3）中過表達后的SDS-PAGE驗證Fig. 4 SDS-PAGE analysis of overexpression of recombinant LGOX in E. coli BL21 (DE3)

2.4 誘導表達條件的優化

圖5 IPTG濃度（A）、誘導時間（B）和誘導溫度（C）對重組LGOX的影響Fig. 5 Effect of IPTG concentration (A), induction time (B) and temperature (C) on recombinant LGOX activity

按照前述方法中所述發酵重組菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-LGOX，加入不同終濃度的IPTG，20 ℃誘導培養15 h后測定酶活力，結果如圖5A所示。在IPTG終濃度為0.1 mmol/L時誘導效果最佳。此外，在不添加IPTG誘導時，也能表達出一定的酶活力，這一本底表達的存在表明實驗條件下，阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表達。故確定0.1 mmol/L IPTG為最佳誘導劑濃度，以此條件為基礎，改變誘導時間，結果如圖5B所示，隨著誘導時間的延長，單位酶活力也相應增加，當誘導18 h時，酶活力基本達到穩定，故綜合考慮，誘導時間為18 h時最佳。接著，以此條件為基礎，改變誘導溫度為20、25、30、37 ℃，結果如圖5C所示，隨著溫度升高，酶活力逐漸降低。據相關報道重組E. coli能高表達重組蛋白的誘導溫度為15～42 ℃，降低溫度有利于重組酶的表達同時減少包涵體的產生[25-26]，本實驗結果也間接證實了這一結論，當誘導溫度為20 ℃時，酶活力最佳。故最終確定誘導條件為0.1 mmol/L IPTG、誘導時間18 h、誘導溫度20 ℃，獲得酶活力為（49.10±2.26）U/mL粗酶液，比活力為19.56 U/mg。

2.5 重組LGOX的純化

圖6 重組LGOX分 離純化過程SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis in the puri fi cation process of recombinant LGOX

由于本實驗所采用的pET28a（＋）為含有T7強啟動子的IPTG誘導型表達載體，且本身自帶有組氨酸標簽，可采用HisTrapTMFF親和層析柱純化重組蛋白，達到快速、便捷、高效的目的[27]。如圖6所示，粗酶液經HisTrapTMFF親和層析柱純化后得到單一的目的蛋白條帶，純化后的酶比活力達到45.98 U/mg，是純化前的2.35 倍。

2.6 LGOX純酶酶學性質分析

2.6.1 溫度及pH值對重組LGOX影響

圖7 溫度（A）和pH值（B）對重組LGOX活力影響Fig. 7 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of recombinant LGOX

從圖7A可以看出，該酶的最適溫度為40 ℃，最適溫度范圍在30～50 ℃之間，其能維持90%以上酶活力，當溫度達60 ℃時，具有60%的活力，說明該酶的作用溫度較為廣泛，能滿足工業化酶轉化生產α-KG要求。80 ℃反應時，該酶活力幾乎完全喪失。此外，將該酶分別在4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃保溫1 h后測定酶活力，發現該酶在70 ℃及以下溫度保溫1 h后，還能維持其50%以上的酶活力，80 ℃保溫1 h后，酶活力基本喪失。

由圖7B可知，pH值為6.0時，酶活力最高，為該酶的最適反應pH值，最適pH值范圍為5～6，當pH值高于6.0時，酶活力降低較為顯著，pH值為9.0時，酶活力基本完全喪失。同時，將該酶分別在pH值為3、4、5、6、7、8、9條件下，4 ℃放置12 h后，測定酶活力，發現該酶在pH值為5～6.5時，該酶活力基本穩定，能維持將近80%以上的酶活力，當pH值高于7.0時，酶活力迅速較為50%以下，而pH值為9.0時，酶活力基本喪失。

2.6.2 底物特異性

表1 重組LGOX底物特異性分析Table 1 Substrate specif i city of recombinant LGOX

由表1可知，LGOX的最適底物為L-谷氨酸，還對L-谷氨酰胺和L-組氨酸有微弱作用外，對其他氨基酸無作用，這與Kamei等[17]的研究結果類似。較強的底物專一性，顯示了該酶一定的應用前景。

2.6.3 金屬離子對LGOX活力影響

由圖8可知，在酶活力測定反應體系中加入2 mmol/L的不同外源金屬離子時，K＋、Ba2＋、Mn2＋均對該酶起了一定的促進作用，其中尤以Mn2＋促進效果最為明顯，與不加外源離子的對照組相比，酶活力提高了10%以上，同時，Ni＋、Cu2＋、Zn2＋、Ca2＋、Co＋、Mg2＋對LGOX有不同程度的抑制效果，其中，又以Zn2＋最為突出，幾乎能完全抑制其酶活力。

圖8 金屬離子對重組LGOX活力影響Fig. 8 Effect of different metal ions on the activity of recombinant LGOX

2.6.4 動力學參數的測定結果

按照酶活力標準測定方法，在最適溫度40 ℃和最適pH 6.0條件下，測定不同底物濃度（0.5、1、3、6、9、12、15 mmol/L）的酶活力，計算出反應速率，得到該重組LGOX的Km值為1.23 mmol/L，最大反應速率Vmax為76.24 μmol/（min·mg）。

3 討 論

表2 不同來源LGOX的特征Table 2 Characters of the LGOX from different sources

α-KG在食品、醫藥等領域存在巨大的應用價值，一方面，α-KG與精氨酸等氨基酸復配，能幫助運動員快速補充能量，另一方面，α-KG能減輕腎病患者腎臟負擔[1]，此外，α-KG還在魚類營養及腸道代謝中存在巨大應用價值[28]，而目前工業上生產α-KG存在各種弊端，因此，利用LGOX高效生物轉化生產食品添加劑α-KG是一極具應用情景選擇。表2顯示，目前大部分的LGOX研究均來源于鏈霉菌屬，Arima等[29]將Streptomyces sp. X-119-6來源的LGOX基因在E. coli JM109中實現重組表達，該重組酶在pH 7.4、30 ℃溫浴0.5 h僅剩50%酶活力；Niu等[10]將來自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表達，重組酶45 ℃溫浴1 h酶活力不到50%，酶活力下降明顯，穩定性較差。直接由野生菌分泌的LGOX表達量低，且分離純化較為困難，不適宜大規模制備。為尋找出一種穩定性能良好、作用條件溫和的LGOX，同時獲得一株能高效表達該酶的重組菌株，發現來源于北里孢屬的LGOX表達量高，熱穩定性能良好，70 ℃放置1 h還有50%的酶活力，最適反應溫度及pH值較為溫和，適用于工業化轉化L-谷氨酸生產α-KG。

根據來源于北里孢的LGOX的氨基酸序列，合成了上述來源的LGOX基因，并將其克隆至pET28a表達載體，轉化至E. coli BL21中，獲得高效表達。并通過對誘導條件的探索，發現在誘導產酶時，影響外源基因的表達除了載體和宿主外，誘導劑濃度、誘導時間和誘導溫度等都會在不同程度上影響重組菌的表達。研究結果發現低濃度誘導劑IPTG（濃度0.1 mmol/L）即可誘導重組菌的表達，濃度過高，由于其本身的毒性作用，會抑制菌體生長而影響活性蛋白的表達；在不添加IPTG誘導時，也能表達出一定的酶活，說明這一本底表達的存在表明實驗條件下，阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表達。在一定的誘導時間內，隨著誘導時間的延長，其酶活力也逐漸上升，當誘導時間為18 h時，達到最佳誘導效果；溫度對誘導蛋白的表達影響效果顯著，當溫度在1～42 ℃時，溫度升高，菌體生長過快，導致蛋白合成過快，沒有足夠時間進行正確折疊，而形成不溶解的包涵體，導致酶活力急劇下降[25]。

酶學性質研究發現該重組酶底物特異性強，除對L-谷氨酸有強烈作用外，僅對L-組氨酸和L-谷氨酰胺有微弱作用；熱穩定性能良好，70 ℃溫浴1 h，還能維持50%以上的活力，而目前已有報道的LGOX，熱穩定性普遍偏低，其中以Kusakabe等[18]所報道的LGOX熱穩定性最佳，在0.1 mol/L pH 5.5緩沖劑中75 ℃以下維持15 min還具100%酶活力，但其表達量低，無法滿足工業化生產制備要求；本研究中的重組LGOX在pH 5～6.5時，能維持80%以上的活力，說明該重組酶耐酸性較強，符合工業化生產制備的要求，為工業化生產α-KG提供參考依據；同時，本研究還發現外源添加一定濃度的Mn2＋能促進LGOX活力，可為工業上酶轉化生產α-KG提供一定的參考。

對來源K. setaed的LGOX異源表達及酶學性質分析，發現該酶作用條件溫和，且穩定性能良好，為今后通過生物轉化L-谷氨酸生產α-KG研究提供了理論支持。

4 結 論

研究來源于K. setaed的LGOX在大腸桿菌中異源表達及催化特性，發現在誘導劑IPTG終濃度為0.1 mmol/L時，20 ℃誘導18 h，重組大腸桿菌粗酶液酶活力最佳為49.10 U/mL，其催化特性結果顯示該重組酶在溫度為40 ℃和pH 6.0時，酶活力最佳，此外，該酶在70 ℃及以下溫度保溫1 h后，能維持其50%以上的酶活力，熱穩定性良好，在pH 5～6.5時，能維持將近80%以上的酶活力，底物專一性強，外源加入Mn2＋能促進重組LGOX活力，可為工業生產α-KG提供借鑒。

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Heterologous Expression and Characterization of Recombinant L-Glutamate Oxidase from Kitasatospora setae

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, DING Zhongyang, ZHANG Liang, SHI Guiyang*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to achieve eff i cient bioconversion of L-glutamic acid to alpha ketoglutaric acid (α-KG), the L-glutamate oxidase (LGOX) gene from Kitasatospora setae KM-6054 was expressed in Escherichia coli BL21. According to the known LGOX sequence from K. setae and the codon bias of E. coli, the optimized LGOX gene sequence was synthesized and cloned into the pET28a (+) vector, which was then transferred into E. coli BL21(DE3) to obtain a recombinant LGOX.And enzymatic properties of the recombinant LGOX were also investigated. Results showed that the recombinant LGOX activity could reach 49.10 U/mL after induction at an IPTG concentration of 0.1 mmol/L at 20 ℃ for 18 h. Subsequently, the recombinant LGOX was purif i ed by aff i nity column chromatography to a specif i c activity of 45.98 U/mg and its molecular weight was about 70 kDa as determined by SDS-PAGE analysis. The enzymatic properties showed that the optimal reaction temperature and pH value were 40 ℃ and 6.0, respectively. The Michaelis-Menten constant Kmwas 1.23 mmol/L, and the maximum reaction rate Vmaxwas 76.24 μmol/(min·mg). L-Glutamic acid was the optimal substrate for the LGOX. The heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase in this study can provide a new way for biosynthesis of α-KG.

Kitasatospora setae; L-glutamate oxidase; α-ketoglutaric acid; heterologous expression; enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201802010

Q814

A

1002-6630（2018）02-0058-08

陳穩, 李由然, 顧正華, 等. 白絲北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的異源表達及酶學性質分析[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 58-65.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, et al. Heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase from Kitasatospora setae[J]. Food Science, 2018, 39(2): 58-65. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

2017-01-05

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401674）；“十三五”國家重點研發計劃重點專項（2016YFD0401404）

陳穩（1992—），男，碩士，研究方向為工業微生物學與酶工程。E-mail：chenwenjnu@126.com

*通信作者簡介：石貴陽（1963—），男，教授，博士，研究方向為發酵工程。E-mail：gyshi@jiangnan.edu.cn