變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶基因的原核表達

孫文敬，楊 荔，欒 方，何小用，崔鳳杰,*，王大明，錢靜亞，齊向輝

變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶基因的原核表達

孫文敬1,2，楊 荔1，欒 方1，何小用1，崔鳳杰1,2,*，王大明2,3，錢靜亞1,2，齊向輝1

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221；
3.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

采用降落聚合酶鏈式反應（touchdown polymerase chain reaction，TD-PCR）技術，從2-酮基葡萄糖酸工業生產菌株變形假單胞菌JUIM01中克隆了編碼2-酮基葡萄糖酸差向異構酶的基因kguE。將目的基因與質粒pET-28a（＋）重組后轉入宿主表達菌中，獲得了重組菌株大腸桿菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的誘導下，該重組菌株表達了一個分子質量約為30.5 ku的融合蛋白，且該蛋白的Western-blot鑒定結果顯示為陽性。生物信息學分析結果表明，該蛋白是一種由256 個氨基酸殘基組成的分子質量為28.5 ku的親水性蛋白，與惡臭假單胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向異構酶在氨基酸序列上的一致性達78%，定位于細胞質中，其二級結構中α-螺旋、延伸鏈和無規則卷曲所占的比例分別為40.62%、17.19%和42.19%。本研究結果為變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶的功能研究提供了一定理論支持。

變形假單胞菌；2-酮基葡萄糖酸差向異構酶；kguE基因；克隆；表達；生物信息學

2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）即2-酮基-D-葡萄糖酸，是雜環化合物合成、區域選擇性和立體選擇性化學反應中的基礎材料[1]，目前最主要的用途是作為食品抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鹽類合成的前體[2-5]。2KGA的生產方法主要有4 種，即化學合成法、酶法、發酵法和靜息細胞轉化法[6-8]。其中，發酵法是迄今為止最為經濟、高效和環境友好的2KGA工業生產方法[9]。

氧化細菌[10-11]如假單胞菌（Pseudomonas）[12-13]、歐文氏菌（Erwinia）[14]、葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter）[15]、沙雷菌（Serratia）[16-18]、克雷伯菌（Klebsiella）[19-20]、醋酸桿菌（Acetobacter）[21]等，存在著由膜結合吡咯喹啉醌依賴的葡萄糖脫氫酶[22]和膜結合黃素腺嘌呤二核苷酸依賴的葡萄糖酸脫氫酶[23]組成的葡萄糖直接氧化系統，能夠以葡萄糖為底物在細胞的周質空間中生物合成2KGA。在國內外2KGA的工業生產中，通常采用的菌株是具有相對高效、穩定發酵性能的假單胞菌[24]。

在假單胞菌的葡萄糖代謝中，隨著培養條件的變化，積累于培養液中的中間代謝產物2KGA可以被轉運至其細胞質內而被分解代謝[25]。相關研究結果[26-29]表明，與假單胞菌2KGA分解代謝相關的基因位于染色體上的2KGA利用操縱子即kgu操縱子中，并受到阻遏蛋白PtxS的調控，該蛋白同時調控其自身的合成。kgu操縱子包含kguT、kguK、kguE和kguD等結構基因，分別編碼2KGA轉運蛋白（2-ketogluconate transporter，KguT）、2KGA激酶（2-ketogluconate kinase，KguK）、2KGA差向異構酶（2-ketogluconate epimerase，KguE）和2KGA還原酶（2-ketogluconate reductase，KguD）。其中：KguT是一種跨膜轉運蛋白，能夠將周質空間或培養環境中的2KGA轉運至細胞質中；KguK是一種ATP依賴性激酶，在ATP存在的條件下能夠將2KGA磷酸化為2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸；KguD是一種NADPH依賴性還原酶，能夠將2-酮基-6-磷酸葡萄糖酸還原為中心代謝產物6-磷酸葡萄糖酸。利用基因敲除技術，Swanson等[26]證實了KguE是假單胞菌2KGA代謝過程中必不可少的一種異構酶，但到目前為止其在2KGA代謝中的作用尚未得到揭示，也鮮見到進一步的相關文獻報道。為全面理解假單胞菌的2KGA代謝調控機制，有必要開展KguE功能的相關研究。

本研究以國內2KGA工業生產的主要用菌變形假單胞菌（P. plecoglossicida）JUIM01[30]為材料，利用降落聚合酶鏈式反應（touchdown-polymerase chain reaction，TD-PCR）克隆KguE的編碼基因，原核表達帶有His標簽的KguE蛋白，并通過生物信息學方法分析和預測該蛋白的基本生物學特性，為后續的KguE蛋白純化、鑒定及其結構與功能研究奠定基礎，進而為2KGA的高效生產提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

變形假單胞菌JUIM01，國內2KGA的工業生產用菌，由本實驗室選育保藏；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、表達菌株大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）和表達質粒pET-28a（＋）由本實驗室保存；克隆質粒pMD19-T購自寶生物工程（大連）公司。

1.1.2 培養基

LB培養基：酵母提取物5.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。

LB平板：含有15.0 g/L瓊脂的LB培養基。

1.1.3 主要試劑和工具酶

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型） 上海捷瑞生物工程有限公司；2×Pfu MasterMix 天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、改良型Bradford法蛋白質濃度測定試劑盒、Anti-6×His antibody、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP、W-TMB顯色試劑盒、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內切酶EcoRⅠ、限制性內切酶BamHⅠ、T4 DNA連接酶、DNA A-Tailing Kit、DL5 000 DNA Marker、Protein Molecular Weight Marker （Low）和5×Protein十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）Loading Buffer 寶生物工程（大連）公司；預染蛋白分子質量標準 碧云天生物技術研究所；考馬斯亮藍G250 國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

C1000 TouchTM型PCR儀、PowerPac Basic型電泳儀、GelDocTMXR＋型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Eporator電轉化儀、BioPhotometer plus核酸蛋白定量儀德國Eppendorf公司；DYCZ-40A型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVG20型防紫外割膠儀 上海領成生物科技有限公司；QL-901型旋渦混合器、TS-2型脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-18M型冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司；HYL-C型組合式搖床太倉市強樂實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 變形假單胞菌JUIM01基因組DNA的提取

挑取活化后的變形假單胞菌JUIM01單菌落，接種于5.0 mL的LB培養基中，30 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養12 h，然后離心（8 000 r/min，2 min）收集菌體，并用無菌水洗滌菌體2次。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作方法，提取變形假單胞菌JUIM01的總DNA，并貯存于-20 ℃，備用。

1.3.2 PCR引物的設計與合成

根據本實驗室在GenBank中公布的變形假單胞菌JUIM01的kgu操縱子的核苷酸序列（KU168040），結合生物信息學軟件DNAMAN的分析結果，設計了PCR引物。為便于克隆與表達，在上、下游引物的5’端分別引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。設計的PCR引物如下：

P1：5’-CGGGATCCATGCATGCGAACCCTGT-3’（BamHⅠ）

P2：5’-GGAATTCTCAGCCATGGTGGACCT-3’（EcoRⅠ）

1.3.3 變形假單胞菌kguE基因的擴增及測序

以設計的P1和P2為引物，以變形假單胞菌JUIM01的基因組DNA為模板，利用TD-PCR技術擴增kguE基因的全長序列。

PCR體系（50.0 μL）：2×Pfu MasterMix 25.0 μL，引物P1（10.0 μmol/L）1.0 μL，引物P2（10.0 μmol/L）1.0 μL，基因組DNA 1.0 μL，ddH2O 22.0 μL。

PCR程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（第1個循環的退火溫度為75 ℃，以后每個循環降低1 ℃），72 ℃延伸1 min/kb，反應20個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min/kb，反應25 個循環；72 ℃延伸5 min。

參照文獻[30]所述的方法對PCR產物進行處理，然后提交生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。

1.3.4 異源表達載體的構建與鑒定

利用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分別對PCR產物和表達載體pET-28a（＋）進行雙酶切處理；采用1%瓊脂糖凝膠電泳分別純化目的基因和表達載體的酶切產物；切膠獲取二者的目標條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA片段；在T4 DNA連接酶作用下，使回收的目的基因片段與線性化的表達載體pET-28a（＋）連接（16 ℃連接16 h），獲得重組質粒pET-28a（＋）-kguE（圖1）。

圖1 重組質粒pET-28a（）-kguE的構建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

將重組質粒pET-28a（＋）-kguE轉入E. coli JM109的感受態細胞。取適量經轉化的菌液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養12 h左右。從平板上挑取陽性單克隆，接種于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，在30 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養12 h。利用質粒DNA提取試劑盒從擴大培養的陽性單克隆中提取重組質粒，然后進行質粒PCR驗證、酶切驗證和測序驗證。

在翻轉課堂的實踐中，教師的角色不僅僅是課程內容的傳授者，更多則轉變為學習過程的引導者，學生則由原來被動的接受者，轉變為積極主動的參與者[3]。

1.3.5 變形假單胞菌kguE基因的原核表達

將經過驗證的重組質粒pET-28a（＋）-kguE導入E. coli BL21（DE3）的感受態細胞中，然后涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養12 h。挑取陽性單克隆接種于含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜。取上述培養物，按10%（體積分數）的比例接種于250 mL含有50 mL的LB培養基的錐形瓶中進行擴大培養。當培養液的OD600nm值達到0.5～0.8時，分別加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，18 ℃、200 r/min的條件下誘導表達16 h。離心收集菌體，利用SDSPAGE及Western-blot對蛋白的表達情況進行檢測。

1.3.6 表達產物的SDS-PAGE分析與Western-blot鑒定

取細胞培養液2.0 mL，離心（8 000 r/min，3 min）收集菌體，并用預冷的無菌PBS洗滌2次，然后使菌體重懸于200 μL的PBS中。取20.0 μL的重懸菌液與5.0 μL的上樣緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸5 min。冷卻樣品，對重組菌株的全細胞蛋白進行SDS-PAGE分析。

以預染蛋白質分子質量標準為Marker，以抗6×His單克隆兔抗（Anti-6×His antibody）為一抗、IgG/HRP羊抗兔（Goat Anti-Rabbit IgG/HRP）為二抗，對SDS-PAGE分離的KguE融合蛋白進行Western-blot鑒定。

1.3.7 變形假單胞菌KguE蛋白的序列分析

利用在線生物信息學分析工具對變形假單胞菌KguE蛋白的氨基酸序列進行分析[30]。

2 結果與分析

2.1 變形假單胞菌kguE基因的PCR擴增

以變形假單胞菌JUIM01的基因組為模板，以P1和P2為引物，按照設定的程序進行TD-PCR。取5.0 μL的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果（圖2）顯示：在750 bp附近有一條非常明顯的條帶，其大小與預計的kguE基因的大小相符，可初步認為已克隆到目的基因kguE。

圖2 變形假單胞菌kguE基因PCR擴增產物的電泳分析Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplif i ed kguE gene from P. plecoglossicida

圖3 變形假單胞菌KguE的基因序列及氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequences of KguE from P. plecoglossicide

采用DNA A-Tailing Kit對切膠回收的PCR產物加A尾后，使其與克隆載體pMD19-T連接，再經轉化、藍白斑篩選和質粒提取等步驟，得到了重組質粒pMD19-T-kguE。將驗證正確的重組質粒送生工生物（上海）股份有限公司進行DNA測序，結果（圖3）表明：克隆的kguE基因片段與本實驗室克隆的變形假單胞菌kgu操縱子（GenBank：KU168040）中的kguE在核苷酸序列上是完全一致的，其核苷酸序列長度為771 bp。采用DNAMan軟件分析發現，克隆的基因片段具有一個完整的開放閱讀框，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。通過同源性比對發現，該基因片段與P. putida IEC33019、Pseudomonas sp. CCOS191、P. mosselii SJ10和P. putida S13.1.2等假單胞菌的kguE基因在核苷酸序列上的一致性達到75%～80%。

2.2 異源表達載體pET-28a（＋）-kguE的構建

將經過雙酶切處理的變形假單胞菌kguE基因的PCR產物和質粒pET-28a（＋）連接，得到重組質粒pET-28a（＋）-kguE。將構建的重組質粒轉入E. coli JM109的感受態細胞，然后對其陽性單克隆進行質粒PCR驗證。從圖4可以看出，以陽性單克隆的質粒DNA為模板、采用P1和P2為引物擴增的產物長度在750 bp左右，與預期的長度771 bp相符，可初步認為重組質粒得到正確構建。采用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ對重組質粒進行酶切驗證，其結果（圖5）與預期相符，因此可以認為目的片段已經準確插入表達載體，重組質粒得到成功構建。將經過驗證的重組質粒送生工生物（上海）股份有限公司進行DNA測序，結果表明：重組質粒pET-28a（＋）-kguE的kguE與變形假單胞菌kgu操縱子（GenBank：KU168040）的kguE在核苷酸序列上是完全一致的。

圖4 重組質粒pET-28a（）-kguE的kguE基因PCR擴增產物的電泳分析Fig. 4 Electrophoretic analysis of PCR ampli fi ed kguE gene from the recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

圖5 重組質粒pET-28a（）-kguE酶切產物的電泳分析Fig. 5 Electrophoretic analysis of the restriction enzyme-digested products of recombinant plasmid pET-28a(+)-kguE

2.3 變形假單胞菌kguE基因在E. coli BL21（DE3）中的誘導表達

圖6 重組菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（）-kguE全細胞蛋白的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis of whole-cell proteins from E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguE

圖7 重組菌株E. coli BL21（DE3）/pET-28a（）-kguE表達的融合蛋白的Western-blot分析Fig. 7 Western blot analysis of the fusion protein expressed by E. coli BL21(DE3)/ pET-28a(+)-kguE

從含有pET-28a（＋）-kguE的E. coli JM109中提取質粒pET-28a（＋）-kguE，然后將其轉入E. coli BL21（DE3）。經抗性篩選和酶切驗證后，得到重組菌株E.coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在0.6 mmol/L的IPTG誘導下，18 ℃、200 r/min培養E. coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE 16 h。離心收集菌體，利用SDSPAGE對變形假單胞菌kguE基因的原核表達情況進行檢測。分析結果（圖6）表明，E. coli BL21（DE3）/pET-28（＋）-kguE表達的帶有His標簽的重組蛋白的分子質量約為30.5 ku，與預測的變形假單胞菌KguE的分子質量相符，也與銅綠假單胞菌KguE的分子質量（28.9 ku）大致相符，而E. coli BL21（DE3）/pET-28a（＋）在相同的誘導條件下并不能表達出相同的蛋白。上述結果表明，變形假單胞菌基因kguE在E. coli BL21（DE3）中得到了成功表達。以抗6×his單克隆兔抗為一抗、IgG/HRP羊抗兔為二抗，對經SDS-PAGE分離的兩種融合蛋白進行Western-blot檢測，結果（圖7）顯示為陽性，進一步證明了目的基因的成功表達。

2.4 變形假單胞菌KguE蛋白序列的分析

利用ProtParam工具對變形假單胞菌KguE的基本理化性質進行了預測，結果表明：該蛋白由256 個氨基酸殘基組成，其中帶負電荷的氨基酸殘基（Asp＋Glu）總數為35 個，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg＋Lys）總數為25 個，其氨基酸組成（表略）中Ala和Leu居多，分別達到12.9%和13.7%。該蛋白的分子質量為28.5 ku，等電點為5.28，分子式為C1278H1988N364O370S7。變形假單胞菌KguE的不穩定指數為49.29（＞40），說明其在溶液中的性質不夠穩定；該蛋白的脂溶性指數為93.83，總平均親水性指數為-0.206，預測該蛋白屬于親水性蛋白。

采用PSORT Prediction、TMHMM Server 2.0和SignalP 4.1 Server等在線工具，分別對變形假單胞菌的細胞定位、跨膜結構和信號肽進行了預測，結果顯示：該蛋白定位于細胞質中，無跨膜結構域，為非跨膜蛋白，而且沒有信號肽的存在。

采用PredictProtein工具對變形假單胞菌KguE的二級結構進行了預測，結果表明：該蛋白的二級結構中包含α螺旋、延伸鏈和無規則卷曲3種結構形式，所占的比例分別為40.62%、17.19%和42.19%。

圖8 KguE蛋白的系統進化樹Fig. 8 Phylogenetic tree of KguE and KguE-related proteins

圖9 變形假單胞菌JUIM01蛋白KguE的三級結構Fig. 9 Tertiary structure of KguE from P. plecoglossicida JUIM01 predicted by Swiss-model

利用BLAST工具從NCBI中數據庫中獲得與變形假單胞菌KguE同源性較高的氨基酸序列，并利用ClustW軟件進行多序列同源性多重比對，采用MEGA 5.10軟件對7 個不同來源的氨基酸序列進行系統進化分析。結果（圖8）顯示，變形假單胞菌KguE與惡臭假單胞菌KguE的同源性較高，其氨基酸序列的一致性達到78%。

利用蛋白質三級結構預測數據庫Swiss-Model對變形假單胞菌KguE的三級結構進行預測。選取與KguE的氨基酸序列一致性為19.35%的D-木糖異構酶為模板，模擬KguE的三級結構。獲取預測的蛋白質的三級結構后下載其PDB文件，然后利用蛋白質三級結構顯示軟件PyMOL進行處理與顯示，結果如圖9所示。

3 結 論

采用TD-PCR技術，從工業生產菌株變形假單胞菌JUIM01克隆了其kgu操縱子中的結構基因kguE，其核苷酸序列長度為771 bp，與P. putida IEC33019、Pseudomonas sp. CCOS191、P. mosselii SJ10和P. putida S13.1.2等假單胞菌的kguE基因在核苷酸序列上的一致性達到75%～80%。在T4 DNA連接酶的作用下，使經過雙酶切處理的kguE基因與表達質粒pET-28a（＋）連接，構建了重組菌株E. coli BL21（DE3）/ pET-28a（＋）-kguE。在IPTG的誘導下，該重組菌株表達了分子質量約為30.5 ku的融合蛋白。SDS-PAGE分離的KguE融合蛋白的Westernblot鑒定結果顯示為陽性，進一步證明了變形假單胞菌JUIM01的kguE基因在E. coli BL21（DE3）中的表達。

生物信息學分析結果表明：變形假單胞菌KguE是由256個氨基酸殘基組成的無跨膜結構域的親水性蛋白，理論分子質量為28.5 ku，定位于細胞質中。在該蛋白的二級結構中，α-螺旋、延伸鏈和無規則卷曲3 種結構形式所占的比例分別為40.62%、17.19%和42.19%。該蛋白與惡臭假單胞菌KguE的同源性較高，其氨基酸序列的一致性達78%。

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Prokaryotic Expression of a 2-Ketogluconate Epimerase Gene from Pseudomonas plecoglossicida

SUN Wenjing1,2, YANG Li1, LUAN Fang1, HE Xiaoyong1, CUI Fengjie1,2,*, WANG Daming2,3, QIAN Jingya1,2, QI Xianghui1
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China;3. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The complete nucleotide sequence of the gene (kguE) encoding 2-ketogluconate epimerase was cloned by touchdown polymerase chain reaction (TD-PCR) from an industrial 2-ketogluconic acid producer, Pseudomonas plecoglossicida JUIM01. A recombinant vector was constructed by ligating the restriction enzymes digested products of the target gene to pET-28a(+) vector and then transferred into the expression host E. coli BL21(DE3). A specif i c fusion protein with molecular weight of about 30.5 ku was expressed in the recombinant strain E. coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-kguE after isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induction with a positive Western-blot result. Bioinformatic analysis showed that the protein was predicted to be a hydrophilic protein with molecular weight of 28.5 ku located in the cytoplasm, sharing 78% amino acid sequence identity with the 2-ketogluconate epimerase from P. putida. The predicted secondary structure consisted of 40.62% of α-helix, 17.19% of extended strand and 42.19% of random coil. This study is expected to provide a basis for further elucidating the function of 2-ketogluconate epimerase in P. plecoglossicida.

Pseudomonas plecoglossicide; 2-ketegluconate epimerase (KguE); kguE gene; cloning; expression;bioinformatics

10.7506/spkx1002-6630-201802011

Q781

A

1002-6630（2018）02-0066-07

孫文敬, 楊荔, 欒方, 等. 變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸差向異構酶基因的原核表達[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 66-72.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802011. http://www.spkx.net.cn

2017-02-25

國家自然科學基金面上項目（31571885）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA022103）；

江西省科技計劃項目（贛知發[2015]64號）；江西省創新團隊建設計劃項目（20142BCB24024）；

江西省科技平臺建設計劃項目（2010DTZ01900）；德興市科技計劃項目（德科發[2015]44號）

孫文敬（1964—），男，研究員，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：juswj@163.com

*通信作者簡介：崔鳳杰（1980—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：feijiecui@163.com

SUN Wenjing, YANG Li, LUAN Fang, et al. Prokaryotic expression of a 2-ketogluconate epimerase gene from Pseudomonas plecoglossicida[J]. Food Science, 2018, 39(2): 66-72. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802011. http://www.spkx.net.cn