抗腫瘤靶向工程菌的高密度發酵及菌粉研制

王 燦，莫湘濤，張 峰，吳柳娟，李 躺，夏立秋*

抗腫瘤靶向工程菌的高密度發酵及菌粉研制

王 燦，莫湘濤，張 峰，吳柳娟，李 躺，夏立秋*

（湖南師范大學生命科學學院，微生物分子生物學湖南省重點實驗室，淡水魚類發育生物學國家重點實驗室，湖南 長沙 410081）

為獲得侵襲性抗腫瘤靶向工程菌株EcNA高菌體濃度的培養基配方，在單因素試驗的基礎上，通過Plackett-Burman試驗篩選出對菌體濃度影響最顯著的因素為酵母抽提物、K2HPO4用量，對顯著影響因素進行中心組合試驗響應面分析。結果表明最佳培養基成分為：可溶性淀粉2 g/L、酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO414.26 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO40.3 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量3%。發酵后溶液中菌體OD600nm達到7.602，菌體生物量達到2.96×109CFU/mL，比優化前提高了78.3%。以凍干保護劑在冷凍干燥過程中對工程菌株的保護效果為研究對象，通過正交試驗得到制成菌粉的最佳保護劑配方為脫脂乳14.25 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、抗壞血酸鈉3 g/100 mL，優化后菌體凍干粉存活率可達86.32%，利于制成延長貯存期的口服菌粉膠囊。

抗腫瘤靶向工程菌；高密度發酵；響應面分析法；凍干保護劑；菌粉制劑

近年來，細菌靶向治療腫瘤已成為國際研究的熱點，利用沙門菌工程菌進行腫瘤治療[1]、雙歧桿菌作為靶向治療載體[2]、產氣莢膜梭菌腸毒素作為潛在腫瘤靶向藥物[3]等細菌靶向治療腫瘤的研究都有相關報道。大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917，EcN）作為腸道益生菌而被廣泛使用[4-5]，具有治療傳染性腹瀉尤其是嬰幼兒腹瀉[6]、防止新生兒消化道內病原菌定殖[7-8]、緩解炎癥性腸炎[9-10]、調節免疫[11]等功能。通過綠色熒光蛋白追蹤技術，發現EcN對實體腫瘤具有很好的靶向性[12]，EcN不僅可以在腫瘤富集區聚集，還可以在腫瘤低氧區和壞死區定植，受腫瘤大小及腫瘤微環境等因素的限制較小。EcN進行遺傳改造得到的EcNA菌株，對B16黑色素瘤細胞和4T1乳腺癌細胞具有很好的侵襲活性，其表達的天青蛋白對B16黑色素瘤細胞、4T1乳腺癌細胞和HCT-116結腸癌細胞具有很強的靶向性抑制作用，因此EcNA具有顯著的靶向抗腫瘤效果[13]。基于上述特性，本室構建的能分泌天清蛋白的抗腫瘤靶向工程菌株EcNA，呈現出潛在的臨床應用價值[14]。

本研究采用響應面法優化EcNA菌株的培養基配方，既有利于菌株的高密度發酵、提高工程菌菌體濃度，又能推遲菌體老化時間、延緩抗腫瘤靶向工程菌株的功能，同時還能減少培養體積，縮短生產周期，減少設備投資從而降低生產成本。工程菌EcNA在原始發酵液狀態下不宜直接服用，同時需要解決短存放期與貨架期等問題。采用真空冷凍干燥技術將工程菌制成固體菌粉，后續加工制成口服膠囊劑，有利于其運輸及貨架期的延長。在冷凍干燥過程中添加保護劑，可以有效改變冷凍干燥時菌體細胞所處的物理、化學環境，以此減輕或防止冷凍干燥對菌體細胞的損害，使工程菌最大程度保持原有的理化特性和生物活性，從而利于保持抗腫瘤菌體藥物的功能作用。研究表明，單一保護劑保護效果有限[15-17]，致使其保護作用不理想，研制復合型保護劑是提高菌體存活率的重要方法[18]。本研究采用抗腫瘤靶向工程菌高密度發酵，并優化菌體粉劑保護劑配方，期望得到顯著提高菌體功能及其存活率的復合型保護劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EcN工程菌EcNA為本實驗室構建表達Azurin的工程菌[13]，由本實驗室保存。

K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇（均為分析純）、葡聚糖（生化試劑）國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸鈉（分析純） 上海笛柏生物科技有限公司；海藻糖（分析純） 美國Sigma公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、瓊脂粉 英國Oxoid公司；脫脂乳 內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Format 900 series超低溫冰箱 美國Thermo公司；SmartspecTM3000分光光度計 美國Bio-Rad公司；ZWY-C2112培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；FD-1干燥機 北京德天佑科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子復壯

取菌種保藏液10 μL，劃線涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB平板上，置于37 ℃培養箱培養18 h。

1.3.2 種子培養

從復壯的LB平板上挑取單菌落接種于20 mL的LB液體培養基中，在37 ℃、170 r/min的恒溫振蕩器上培養10 h。

1.3.3 發酵培養

將種子液以3%（V/V）的接種量接入裝有20 mL發酵培養基的三角瓶中，置于37 ℃恒溫培養振蕩器120 r/min振蕩培養16 h。

1.3.4 菌體濃度的測定

采用光密度（optical density，OD）表征菌體濃度，即從培養瓶中取菌液稀釋適當倍數后，用分光光度計在600 nm波長處測定其OD600nm，重復3 次。

1.3.5 菌粉的制備

將發酵液轉移至離心管中，6 000 r/min離心10 min，收集菌體。加入等體積生理鹽水洗滌，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，重復洗滌3次。對洗滌后的菌體收集物，加入等體積保護劑并攪拌均勻，置于-80 ℃冰箱預凍2 h，隨后立即轉入超低溫真空冷凍干燥機凍成干粉狀。

1.3.6 菌體存活率的測定

向菌粉中加入與凍干前相等體積的生理鹽水進行復水，再稀釋涂布活菌計數，測定凍干存活率，重復3 次。

1.3.7 培養基組分及菌粉配方優化

1.3.7.1 發酵培養基組分單因素試驗

分別加入4 g/L的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和甘露醇至酵母抽提物15 g/L、MgSO40.25 g/L、K2HPO42.3 g/L、KH2PO41.5 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量2%的無碳源培養基中，篩選出較適發酵碳源；分別加入25 g/L的酵母抽提物、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和棉籽粉至可溶性淀粉4 g/L、MgSO40.25 g/L、K2HPO42.3 g/L、KH2PO41.5 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量2%的無氮源培養基中，篩選出較適氮源。參考重組大腸桿菌發酵條件優化的研究[19-21]，選擇磷酸鹽、MgSO4、微量元素等作為初始發酵培養基組成部分，然后進行單因素試驗確定各因素的較適范圍。

1.3.7.2 Plackett-Burman試驗設計

采用Plackett-Burman試驗設計，從可溶性淀粉、酵母抽提物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、微量元素母液用量、接種量中篩選出對工程菌生物量有顯著性影響的因素，每個因素取高低兩個水平（1，-1），以OD600nm作為目標值。Plackett-Burman試驗設計的因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in Plackett-Burman design

1.3.7.3 中心組合試驗設計

在Plackett-Burman試驗結果的基礎上，選擇酵母抽提物和KH2PO4這兩種培養基組分進行中心組合試驗優化。中心組合試驗設計因素與水平見表2。

表2 中心組合試驗設計因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in central composite design

1.3.7.4 凍干保護劑配方優化

根據文獻[13-15]，在菌粉制作的過程中，選取抗壞血酸鈉、葡聚糖、海藻糖、甘露醇、脫脂乳、蔗糖6 種凍干保護劑進行單因素試驗，得到各因素的較適質量濃度范圍，試驗設計如表3所示。

表3 凍干保護劑單因素試驗設計Table 3 Levels of factors used in one-factor-at-a-time design

根據單因素試驗結果，選取抗壞血酸鈉、脫脂乳和蔗糖作為復合凍干保護劑組分。為獲得復合保護劑最佳保護效果，最后通過正交試驗設計得到各組分的最適用量。

2 結果與分析

2.1 培養基組分單因素試驗結果

2.1.1 碳源及氮源的篩選結果

圖1 不同碳源（A）及氮源（B）對工程菌EcNA菌體濃度的影響Fig. 1 Effects of different carbon sources (A) and nitrogen sources (B)on EcNA concentration

由圖1A可知，在發酵抗腫瘤靶向工程菌EcNA的過程中，培養基內加入可溶性淀粉對菌體濃度提高的效果最顯著。從圖1B可以看出，酵母抽提物是幾種主要氮源中最適合EcNA發酵的氮源。故選擇可溶性淀粉與酵母抽提物進行下一步的試驗。

2.1.2 培養基組分單因素試驗結果

圖2 培養基中各組分用量對工程菌EcNA菌體濃度的影響Fig. 2 Effects of different medium components on EcNA concentration

由圖2可知，隨酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素母液用量及接種量的升高，發酵后的菌體濃度均有上升。其中隨著可溶性淀粉用量的升高，發酵后的菌體濃度呈下降趨勢，當可溶性淀粉質量濃度超過8 g/L時，菌體濃度開始回升，但低于2 g/L時的菌體濃度，綜合考慮發酵成本，選擇2 g/L作為可溶性淀粉的較適質量濃度。

低質量濃度時，OD600nm隨酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素用量及接種量的升高而增加，用量過高后，OD600nm開始下降。加入高濃度的酵母抽提物，培養基的黏度增大，不利于工程菌的發酵。過量的磷酸鹽會促進乙酸等發酵抑制物的生成，阻礙正常發酵。高質量濃度的MgSO4會使菌體內的滲透壓升高，不利于工程菌的生長。而高濃度含重金屬離子的微量元素會導致菌體損傷，影響高密度發酵。從圖2可知，40 g/L酵母抽提物、3 g/L KH2PO4、12 g/L K2HPO4、0.3 g/L MgSO4、2 mL/L微量元素母液、3%接種量均能得到較高的OD600nm值。

2.2 Plackett-Burman試驗設計結果及回歸分析

表4 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 4 Plackett-Burman design with experimental results

利用Design-Expert 8.06軟件對表4的結果進行主效應分析，得到表5所示的Plackett-Burman試驗中各因素回歸分析結果。由表5可知，在試驗設計的7 種考察因素中，酵母抽提物用量的P值小于0.01，對工程菌株OD600nm的影響是極顯著的，且E為正值，說明酵母抽提物在高水平時對該菌株高密度發酵有利。K2HPO4的P值小于0.05，對工程菌株OD600nm的影響是顯著的，其E為負值，說明K2HPO4用量在低水平時利于工程菌的發酵。酵母抽提物和K2HPO4用量為發酵培養基的兩個重要影響因素。

表5 Plackett-Burman試驗中各因素的回歸分析Table 5 Regression analysis of Plackett-Burman design

2.3 中心組合試驗結果

根據Plackett-Burman試驗篩選出來的顯著影響因素酵母抽提物和K2HPO4用量，對這兩個因素編碼并進行中心組合試驗，其設計如表6所示。以培養16 h后工程菌株發酵液的OD600nm為響應值。試驗中各組均設置3 個平行，中心組合試驗結果見表6。

通過方差分析，可得到二次多項式回歸方程為：Y=7.46＋0.07X1-0.16X2＋0.4X1X2-2.08-1.07。由表7可知，該模型的F值為93.14，P值小于0.000 1，說明該模型是顯著的。模型的失擬項不顯著，表明該模型穩定性較好。模型的決定系數R2為0.985 2，說明模型對響應值的預測是準確的。相關調整系數為0.974 6，說明97.46%的數據可以由這個方程解釋。因此，該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面，可用來預測工程菌株菌體濃度的變化。

表6 中心組合試驗設計及結果Table 6 Central composite design with experimental results

表7 中心組合試驗中各因素的回歸分析Table 7 Regression analysis of central composite design

等高線圖中兩因素作用構成的圖形越橢圓，交互作用越強，由圖3可知，酵母抽提物和K2HPO4在工程菌EcNA的發酵過程中存在交互作用。由響應面圖可以看出，該模型存在極大值。對所得二次多項式回歸方程取一階偏導等于零，聯立方程求解可得：當酵母抽提物用量50.3 g/L、K2HPO4用量14.26 g/L時，能得到OD600nm的預測極大值為7.467。按此配方進行發酵驗證，測得OD600nm為7.602，與預測值接近，說明了該方程的擬合性好。采用梯度稀釋平板計數法，測得該條件下工程菌株的實際濃度為2.96×109CFU/mL。

圖3 酵母抽提物與K2HPO4用量對工程菌EcNA菌體濃度影響的等高線和響應面圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast extract and dipotassium phosphate on EcNA concentration

2.4 凍干保護劑的優化

2.4.1 凍干保護劑單因素試驗結果

圖4 4 種凍干保護劑對EcNA菌體存活率影響Fig. 4 Effects of four cryoprotectants on survival rate of EcNA

海藻糖和甘露醇在各種質量濃度下，菌體凍干存活率均小于1%。脫脂乳、蔗糖、葡聚糖、抗壞血酸鈉作為保護劑，菌體凍干存活率如圖4所示，可看出運用蔗糖、抗壞血酸鈉和脫脂乳作為凍干保護劑能得到較高的菌體存活率。故選擇蔗糖、抗壞血酸鈉和脫脂乳進行下一步的正交試驗。

2.4.2 凍干保護劑正交試驗及方差分析

表8 L9（34）正交試驗結果與極差分析Table 8 Experimental results and range analysis of L9 (34) orthogonal array design

采用L9（34）正交表設計研究了凍干保護劑對抗腫瘤靶向工程菌體存活率的影響，正交試驗結果及極差分析如表8所示，其方差分析結果如表9所示。對表8進行數學擬合可得方程：Y=-30.71-61.02A＋29.34B＋7.68C＋5.68A2-1.03B2＋3.42C2。由方程可知，當A=3、B=14.245 8、C=3時，Y取得極大值。這與正交試驗極差分析得到的較優組合A1B2C3，即A=3、B=15、C=3吻合。由表9可知，蔗糖、脫脂乳、抗壞血酸鈉均對凍干菌粉存活率有顯著影響，且影響因素順序為：抗壞血酸鈉質量濃度＞蔗糖質量濃度＞脫脂乳質量濃度。

表9 正交試驗方差分析Table 9 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

根據正交試驗結果，綜合考慮稱量誤差，最終選定最優水平為蔗糖質量濃度3 g/100 mL、脫脂乳質量濃度14.25 g/100 mL、抗壞血酸鈉質量濃度3 g/100 mL，并進行驗證實驗。此條件下，凍干菌粉的存活率達到（86.32±3.04）%。

3 討 論

合理的培養基組成是高密度發酵的前提，直接影響工程菌的生長增殖及目的基因的表達。本研究中，利用本室構建的抗腫瘤靶向工程菌株EcNA[13]，采用Plackett-Burman試驗設計，篩選出兩種對工程菌株菌體濃度影響顯著的成分為酵母抽提物、K2HPO4。酵母抽提物富含氨基酸、多肽、呈味核苷酸、B族維生素、生長因子和微量元素，被廣泛用于微生物培養[22]，是發酵工業的優質天然營養源[23-24]。K2HPO4等磷酸鹽能調節工程菌的生長及產物代謝[25]，是微生物生長代謝不可或缺的營養成分，對菌體內滲透壓和微生物代謝酶系的活力[26]有重要影響，因此控制適宜的K2HPO4用量對高密度發酵具有極其重要的意義。

根據Plackett-Burman試驗結果，選取酵母抽提物、K2HPO4進行中心組合試驗，建立了二次擬合回歸模型，根據模型得到了這兩個成分的最佳比例為酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO414.26 g/L，發酵后菌體濃度OD600nm達到7.602，生物量達到2.96×109CFU/mL，比優化前提高了78.3%。

菌粉制劑通過除去水分，降低了水分遷移對貨架期的影響，有利于延長貨架期[27]，而真空冷凍干燥法是菌粉制作中最安全高效的方法之一[28]。實驗完成對抗腫瘤靶向工程菌EcNA的發酵條件優化，顯著提高菌體的生物量后，利用正交試驗設計優化了工程菌冷凍干燥過程中保護劑的配比，研制了含有抗壞血酸鈉、蔗糖、脫脂乳的復合保護劑。其中脫脂乳能穩定細胞膜，提供細胞保護衣以免細胞損傷[29]。蔗糖能干擾高度黏稠或玻璃態的鹽以免細胞流體凍結[30]。抗壞血酸鹽能減少環境中氧氣對凍干菌粉的影響[31]。獲得的最佳保護劑配方為脫脂乳14.25 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、抗壞血酸鈉3 g/100 mL，凍干后菌粉中菌體存活率可達86.32%。

本研究通過響應面優化法大幅提高了工程菌的產量，同時也提高天青蛋白的比生產率（單位體積單位時間內產物的產量）以及單位體積的抗腫瘤活性，通過菌粉的制備，簡化了高活力菌體的保藏與運輸條件，推動了靶向抗腫瘤藥物的發展，有利于長貨架期的抗腫瘤靶向活菌膠囊劑的研制。但該抗腫瘤工程菌粉藥物的臨床效果與安全性還需進一步研究。

[1] JIN H Z, MIN J J. Targeted cancer therapy using engineered Salmonella typhimurium[J]. Chonnam Medical Journal, 2016, 52(3):173-184. DOI:10.4068/cmj.2016.52.3.173.

[2] FUKIYA S, HIRAYAMA Y, SAKANAKA M, et al. Technological advances in bifidobacterial molecular genetics: application to functional genomics and medical treatments[J]. Bioscience of Microbiota Food and Health, 2012, 31(2): 15-25. DOI:10.12938/bmfh.31.15.

[3] GAO Z J, MCCLANE B A. Use of clostridium perfringens enterotoxin and the enterotoxin receptor-binding domain (C-CPE) for cancer treatment: opportunities and challenges[J]. Journal of Toxicology,2012: 981626. DOI:10.1155/2012/981626.

[4] GROZDANOV L, RAASCH C, CHULZE J, et al. Analysis of the genome structure of the nonpathogenic probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917[J]. Journal of Bacteriology, 2004,186(16): 5432-5441. DOI:10.1128/JB.186.16.5432-5441.2004.

[5] 張允雷, 夏立秋, 張友明. 細菌靶向治療腫瘤的研究進展[J]. 腫瘤防治研究, 2009, 36(7): 619-622. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2009.07.024.

[6] MIRSEPASI-LAURIDSEN H C, HALKJAER S I, MORTENSEN E M, et al. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli are associated with intestinal inflammation in patients with ulcerative colitis[J].Scientif i c Reports, 2016, 6: 31152. DOI:10.1038/srep31152.

[7] HENKER J, LAASS M W, BLOKHIN B M, et al. Probiotic Escherichia coli Nissle 1917 versus placebo for treating diarrhea of greater than 4 days duration in infants and toddlers[J]. Pediatric Infectious Disease Journal, 2008, 27(6): 494-499. DOI:10.1097/INF.0b013e318169034c.

[8] CHEN Q, ZHU Z, WANG J, et al. Probiotic E. coli Nissle 1917 biofilms on silicone substrates for bacterial interference against pathogen colonization[J]. Acta Biomaterialia, 2017, 50: 353-360.DOI:10.1016/j.actbio.2017.01.011.

[9] LODINOVá-ZáDNíKOVá R, PROKESOVá L, TLASKALOVá H,et al. Inf l uence of oral colonization with probiotic E. coli strain after birth on frequency of recurrent infections, allergy and development of some immunologic parameters. Long-term studies[J]. Ceska Gynekologie, 2004, 69 (Suppl 1): 91-97.

[10] CURRò D, IANIRO G, PECERE S, et al. Probiotics, fi ber and herbal medicinal products for functional and inf l ammatory bowel disorders[J].British Journal of Pharmacology, 2017, 174(11): 1426-1449.DOI:10.1111/bph.13632.

[11] HAFEZ M, HAYES K, GOLDRICK M, et al. The K5 capsule of Escherichia coli strain Nissle 1917 is important in stimulating expression of Toll-like receptor 5, CD14, MyD88, and TRIF together with the induction of interleukin-8 expression via the mitogenactivated protein kinase pathway in epitheli cells[J]. Infection and Immunity, 2010, 78(5): 2153-2162. DOI:10.1128/IAI.01406-09.

[12] ZHANG Y L, ZHANG Y M, XIA L Q, et al. Escherichia coli Nissle 1917 targets and restrains mouse B1 melanoma and 4T1 breast tumors through expression of azurin protein[J]. Applied and Environmental Microbiology,2012, 78(21): 7603-7610. DOI:10.1128/AEM.01390-12.

[13] 白利明, 唐斯佳, 文也, 等. 利用轉座子構建靶向侵襲性抗腫瘤工程菌[J].中國科學, 2015, 45(2): 200-209. DOI:10.1360/N052014-00101.

[14] OU B, YANG Y, THAM W L, et al. Genetic engineering of probiotic Escherichia coli Nissle 1917 for clinical application[J].Applied Microbiology & Biotechnology, 2016, 100(20): 8693-8699.DOI:10.1007/s00253-016-7829-5.

[15] 陳賀佳, 牟光慶. 混合乳酸菌復合凍干保護劑的研究[J]. 食品研究與開發, 2013, 34(18): 133-136. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.18.033.[16] 胥振國, 蔡玉華, 向敏, 等. 凍干高活力納豆芽胞桿菌菌粉保護劑的篩選和優化[J]. 微生物學通報, 2013, 40(5): 822-828. DOI:10.13344/j.microbiol.china.2013.05.011.

[17] 田芬, 陳俊亮, 霍貴成. 益生菌凍干保護劑優化及菌粉保存穩定性研究[J].食品科技, 2012, 37(2): 15-19. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2012.02.001.

[18] CARVALHO A S, SILVA J, HO P, et al. Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2004, 14(10): 835-847. DOI:10.1016/j.idairyj.2004.02.001.

[19] 張建新, 張噸, 胡文波, 等. 重組大腸桿菌高細胞密度發酵研究進展[J]. 中國釀造, 2011, 30(2): 5-8. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2011.02.002.

[20] 張龍, 司海明, 倪曄, 等. 響應面法優化重組大腸桿菌產ADI酶發酵培養基[J]. 食品與生物技術學報, 2015, 34(5): 475-481.DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2015.05.005.

[21] 劉紅娟, 王騰飛, 湯丹丹, 等. 響應面法優化大腸桿菌產海藻糖合酶發酵培養基[J]. 食品工業科技, 2015, 36(11): 181-187.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.028.

[22] ZHANG J, REDDY J, BUCKLAND B, et al. Toward consistent and productive complex media for industrial fermentations: studies on yeast extract for a recombinant yeast fermentation process[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82(6): 640-652. DOI:10.1002/bit.10608.

[23] VASIEE A, BEHBAHANI B A, YAZDI F T, et al. Optimization of the production conditions of the lipase produced by Bacillus cereus,from rice fl our through plackett-burman design (PBD) and response surface methodology (RSM)[J]. Microbial Pathogenesis, 2016, 101:36-43. DOI:10.1016/j.micpath.2016.10.020.

[24] 黃翔峰, 王凱, 黎明霞, 等. 酵母提取物對葡萄糖發酵生產生物破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-1的影響[J]. 環境科學, 2013, 34(4): 1524-1530. DOI:10.13227/j.hjkx.2013.04.007.

[25] ZHANG L, ZHANG L, HAN X, et al. Enhancement of transglutaminase production in Streptomyces mobaraensis as achieved by treatment with excessive MgCl2[J]. Applid Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(6): 2335-2343. DOI:10.1007/s00253-011-3790-5.

[26] MARTIN J F. Phosphate control of the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites is mediated by the PhoR-PhoP system: an unf i nished story[J]. Journal of Bacteriology, 2004, 186(16): 5197-5201.DOI:10.1128/JB.186.16.5197-5201.2004.

[27] 史波林, 趙鐳, 支瑞聰. 基于品質衰變理論的食品貨架期預測模型及其應用研究進展[J]. 食品科學, 2012, 33(21): 345-350.

[28] 常金梅, 蔡芷荷, 吳清平, 等. 菌種冷凍干燥保藏的影響因素[J]. 微生物學通報, 2008, 35(6): 959-962. DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2008.06.024.

[29] CARVALHO A S, SILVA J, HO P, et al. Reevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria[J]. International Dairy Journal, 2004, 14(10): 835-847. DOI:10.1016/j.idairyj.2004.02.001.

[30] MOTTET C, MICHETTI P. Probiotics: wanted dead or alive[J].Digestive & Liver Disease, 2005, 37(1): 3-6. DOI:10.1016/j.dld.2004.09.010.

[31] KURTMANN L, CARLSEN C U, RISBO J, et al. Storage stability of freeze-dried Lactobacillus acidophilus (La-5) in relation to water activity and presence of oxygen and ascorbate[J]. Cryobiology, 2009,58(2): 175-180. DOI:10.1016/j.cryobiol.2008.12.001.

High Cell Density Fermentation of Tumor-Targeting Engineered Strain and Development of Lyoprotectant Formulation for Its Freeze-Drying

WANG Can, MO Xiangtao, ZHANG Feng, WU Liujuan, LI Tang, XIA Liqiu*
(Hunan Provincial Key Laboratory of Microbial Molecular Biology, State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish,College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

The present study aimed to optimize the medium formulation for high cell density culture of an invasive tumortargeting engineered strain, EcNA. Using one-factor-at-a-time method and a Plackett-Burman design, yeast extract and dipotassium phosphate were found to be the most important factors affecting cell concentration. The optimal medium,as determined using central composite design and response surface methodology, was composed of soluble starch 2 g/L,yeast extract 50.3 g/L, K2HPO414.26 g/L, KH2PO43 g/L, MgSO40.3 g/L, and trace element stock solution 2 mL/L, and the inoculum amount was 3%. The optical density at 600 nm (OD600nm) of the bacterial culture obtained using the optimized medium reached 7.602 and the biomass was 2.96 × 109CFU/mL, which was 78.3% higher than that before optimization. Moreover,using orthogonal array design, a lyoprotectant formulation consisting of skim milk 14.25 g/100 mL, sucrose 3 g/100 mL, VC-Na 3 g/100 mL was found to be optimal for the freeze-drying of the strain. The survival rate of the engineered bacterium was up to 86.32% during freeze-drying using the lyoprotectant, being benef i cial for of prolonged storage life of oral capsules.

tumor-targeting engineered strain; high cell density fermentation; response surface analysis; cryoprotectant;bacterial powder

10.7506/spkx1002-6630-201802017

TS201.3

A

1002-6630（2018）02-0105-07

王燦, 莫湘濤, 張峰, 等. 抗腫瘤靶向工程菌的高密度發酵及菌粉研制[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 105-111.

10.7506/spkx1002-6630-201802017. http://www.spkx.net.cn

WANG Can, MO Xiangtao, ZHANG Feng, et al. High cell density fermentation of tumor-targeting engineered strain and development of lyoprotectant formulation for its freeze-drying[J]. Food Science, 2018, 39(2): 105-111. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802017. http://www.spkx.net.cn

2017-01-10

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2012CB722301）；

湖南省生物發育工程及新產品研發協同創新中心項目（20134486）

王燦（1992—），男，碩士研究生，研究方向為微生物新藥發酵。E-mail：453519284@qq.com

*通信作者簡介：夏立秋（1955—），男，教授，碩士，研究方向為微生物新藥發酵。E-mail：xialq@hunnu.edu.cn