黑曲霉發酵法制備米糠粕可溶性膳食纖維工藝優化及其理化分析

閔鐘熳，高 路，高育哲，徐彩紅，鄧雪雪，肖志剛*

黑曲霉發酵法制備米糠粕可溶性膳食纖維工藝優化及其理化分析

閔鐘熳，高 路，高育哲，徐彩紅，鄧雪雪，肖志剛*

（沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034）

以米糠粕為底物，采用黑曲霉對其進行發酵，研究提高米糠粕中可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）提取率的工藝條件以及發酵前后SDF結構、理化性質的變化。通過單因素試驗結合Box-Behnken響應面試驗設計，得到最優的發酵條件，并對此條件下制備的SDF性質進行研究。結果表明：最佳發酵時間77 h、發酵溫度26 ℃、料液比1∶11（g/mL）、pH 5.0、搖床轉速150 r/min時，SDF提取率為38.23%，比優化前提高了29.58%。發酵后SDF的膨脹力、持水力及持油力分別提高了84.44%、79.30%和73.25%。掃描電鏡觀察到發酵后SDF表面結構粗糙、疏松多孔。

米糠粕；可溶性膳食纖維；黑曲霉；響應面法；理化性質

膳食纖維（dietary fiber，DF）通常是指一類不能被人體消化酶消化[1]也不被小腸吸收的植物性細胞壁主要成分[2]，包括纖維素、半纖維素和果膠類物質等[3]。DF按溶解性可分為不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fi ber，IDF）和可溶性膳食纖維（soluble dietary fi ber，SDF）[4]。IDF具有預防結腸癌、通便等功能，SDF具有降膽固醇、預防糖尿病[5-6]及心血管病[7]等生理功能，因此，SDF含量是影響DF生理功能的重要因素[8-9]。然而，天然來源的DF組成中IDF含量較高，SDF含量很低，而只有SDF含量達到30%以上時，才稱為高品質DF[10]。因此，對DF進行改性，提高其中SDF含量成為主要的研究方向。

SDF的提取方法主要有酶法、化學法、物理法[11]和發酵法[12]等，其中微生物發酵法對DF有很好的改性效果[4]。微生物發酵法是制備SDF的新型技術手段，實現微生物產酶與酶解過程的統一，資源得到合理利用，省去了酶制劑在生產過程中的分離純化工藝，大大降低生產成本。

遼寧省作為東北優質粳稻種植和加工利用的代表性產區，水稻年種植面積在56.25萬 hm2，年產稻谷455.6萬 t，省內中大型稻米加工企業820 家，年加工量400多萬 t，為糧食副產品的開發利用提供了廣闊空間。米糠粕是稻谷加工過程中的副產物米糠經過浸出脫脂處理后的產物[13]。米糠粕DF中SDF比例低，口感較粗糙，僅能作為飼料或者丟棄，造成資源的極大浪費。因此，需要研究提高其中SDF的含量，滿足現代食品開發和加工的需要[14]。根據目前國內已有報道，提高米糠粕中SDF的方法通常采用超微粉碎法[15]、擠壓法[16]、酶解法[17]、化學試劑-酶法[18]、超聲波-酶法[19]，微生物發酵法僅有報道采用綠色木霉對米糠粕進行發酵[20]。以黑曲霉發酵香蕉皮[21]、小麥麩皮[22]、花生殼[23]、豆渣[24]等制備SDF的研究較多，但鮮見黑曲霉發酵米糠粕制備SDF的報道。本研究以米糠粕為原料，采用響應面法，優化黑曲霉發酵米糠粕制備SDF工藝，并對其理化性質進行測定，以期為米糠粕SDF的合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠粕 華潤五豐（沈陽）有限公司；黑曲霉（Aspergillus niger） 中國工業微生物菌種管理保藏中心。

95%乙醇溶液（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；熱穩定α-淀粉酶 美國Sigma公司；蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶 北京格林博遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-6型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；AL104-IC電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、HZP-250型全溫培養振蕩器 上海精宏實驗設備有限公司；BJ-2CD型超凈工作臺 上海博迅公司；Avanti J-25型離心機 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；MLS-3780-SV型高溫高壓滅菌鍋 松下電器（中國）有限公司上海分公司；s-4800掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

斜面培養基[25]：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL，pH值自然。馬鈴薯去皮，切塊煮沸0.5 h，紗布過濾，再加糖及瓊脂，融化后補足水至1 000 mL。121 ℃滅菌30 min。

種子培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、酵母膏10 g、水1 000 mL，pH值自然。配制及滅菌方法同斜面培養基。

米糠粕發酵培養基：將米糠粕50 ℃干燥，粉碎，過60目篩。按照一定料液比與水混勻后，密封，115 ℃滅菌15 min，備用。

1.3.2 黑曲霉種子液制備

將菌株接種于斜面培養基，25 ℃培養72 h后，用無菌水淋洗斜面，血球計數板計數，制成濃度為108CFU/mL孢子懸液[26]。吸取1 mL該孢子懸液，于裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中[23]，25 ℃搖床150 r/min培養72 h活化，然后用4層紗布過濾掉菌絲體，調整制成濃度為108CFU/mL的種子液。

1.3.3 米糠粕SDF提取工藝流程

米糠粕發酵培養基→10%接入黑曲霉種子液→液體搖床培養→固液分離→上清液→濃縮醇沉（95%乙醇溶液）→離心（3 500 r/min，20 min）→固體干燥→SDF

SDF含量的測定：采用GB/T 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》。3 次平行實驗，取平均值，按式（1）計算SDF提取率：

式中：M1為烘干至質量恒定的濾紙質量/g；M2為醇沉后烘干至質量恒定含SDF的濾紙質量/g；M為米糠粕樣品的干質量/g。

1.3.4 米糠粕發酵制備SDF單因素條件優化

1.3.4.1 料液比對SDF含量的影響

將米糠粕與水比例分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25（g/mL）裝入250 mL三角瓶中，于25 ℃、pH 5.0、轉速為150 r/min的條件下搖床培養72 h，測定并計算發酵后SDF提取率，確定最佳料液比。

1.3.4.2 發酵時間對SDF含量的影響

將料液比為1∶10（g/mL）的米糠粕培養基裝入250 mL三角瓶中，于25 ℃、pH 5.0、轉速為150 r/min的條件下分別培養0、24、48、72、96 h和120 h，測定并計算發酵后SDF提取率，確定最佳發酵時間。

1.3.4.3 發酵溫度對SDF含量的影響

將料液比為1∶10（g/mL）的米糠粕培養基裝入250 mL三角瓶中，調節pH 5.0、轉速150 r/min，分別在20、25、30、35 ℃和40 ℃條件下培養72 h，測定并計算發酵后SDF提取率，確定最佳發酵溫度。

1.3.4.4 發酵初始pH值對SDF含量的影響

將料液比為1∶10（g/mL）的米糠粕培養基裝入250 mL三角瓶中，于25 ℃、轉速為150 r/min的條件下，分別調整pH值為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，搖床培養72 h，測定并計算發酵后SDF提取率，確定最佳發酵pH值。

1.3.4.5 搖床轉速對SDF含量的影響

將料水比為1∶10（g/mL）的米糠粕培養基裝入250 mL三角瓶中，于25 ℃、pH 5.0的條件下，分別以0、50、100、150 r/min和200 r/min的搖床轉速培養72 h，測定并計算發酵后SDF提取率，確定最佳轉速。

1.3.5 Box-Behnken響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，運用Box-Behnken試驗設計原理[13-14]，選取發酵時間、發酵溫度、料液比為自變量，以SDF提取率為響應值，進行三因素三水平試驗，各因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Level and code of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.6 發酵前后SDF理化性質測定

1.3.6.1 膨脹力測定

參照Zhang Min等[29]的方法。分別稱取發酵和未經發酵制取的SDF各1.000 g放入量筒中，讀取干品體積，然后向量筒中加入水使其總體積達到50 mL，搖勻后置于室溫下封口24 h，讀取量筒中SDF的體積。按照式（2）計算膨脹力：

式中：V1為干樣品的體積/mL；V2為樣品膨脹后的體積/mL；M為樣品的干質量/g。

1.3.6.2 持水力測定

參照Chau等[30]的方法。分別稱取發酵和未經發酵制取的SDF各1.000 g放入量筒中，向SDF加入20 mL水，在室溫下飽和24 h，將充分飽和后的SDF放在濾紙上瀝干外表水分，然后將SDF轉移到表面皿中稱量樣品濕質量，按照式（3）計算持水力：

式中：M1為樣品持水后的質量/g；M為樣品的干質量/g。

1.3.6.3 持油力測定

參照Sangnsrk等[31]方法進行。稱取一定質量發酵和未經發酵的米糠粕SDF于離心管中，向其中加入質量比為1∶8的食用花生油，混勻后37 ℃靜置1 h，于3 000 r/min離心20 min，將離心后的上層清液棄去，并用濾紙吸干殘留游離的花生油。稱量吸附花生油后樣品的質量，按照式（4）計算持油力：

式中：M1為樣品持油后的質量/g；M為樣品的干質量/g。

1.3.7 發酵前后米糠粕SDF超微結構觀察

將樣品干燥至質量恒定，取適量樣品進行黏臺，采用離子濺射法對其鍍金，制備好的樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察[9]。

1.4 數據分析

響應面試驗采用Design-Expert v10軟件進行分析和作圖。其他數據利用SPSS 22軟件進行統計學分析，并采用Microsoft Off i ce Excel 2016作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比的確定

圖1 料液比對SDF提取率的影響Fig. 1 Inf l uence of solid-to-solvent ratio on SDF yield

由圖1可知，料液比對黑曲霉制備米糠粕SDF提取率有顯著影響。隨著加水量的增加，提取率先上升后下降。當料液比為1∶10（g/mL）時，米糠粕SDF提取率達到最高。因為真菌發酵時對培養基的含水量是有一定的要求的，加水量較少，會使菌種和原料接觸不充分，影響發酵[26]。同時，過低水分，會影響菌體生長及產酶速度[32]。因此確定較佳發酵料液比為1∶10（g/mL）。

2.1.2 發酵時間的確定

圖2 發酵時間對SDF提取率的影響Fig. 2 Inf l uence of fermentation time on SDF yield

由圖2可知，發酵時間對黑曲霉制備米糠粕SDF提取率有顯著影響。隨著時間的延長，黑曲霉發酵產生的纖維素酶增加，在72 h時SDF提取率最高。原因可能在72 h前，菌種中的酶對米糠粕中的IDF進行降解，使IDF的糖苷鍵斷裂，從而生成小分子多糖，轉化為SDF，使更多的大分子物質得以分解；在發酵時間約為72 h時，米糠粕SDF提取率達到最高，隨后SDF下降，可能是生長到一定階段后，基質被消耗，無法提供增殖所需的營養物質[33]，微生物開始利用小分子糖，SDF被進一步分解為分子質量更小的組分，不易于提取，故含量降低，呈現下降趨勢，因此確定較佳發酵時間為72 h。

2.1.3 發酵溫度的確定

圖3 發酵溫度對SDF提取率的影響Fig. 3 Inf l uence of fermentation temperature on SDF yield

由圖3可知，發酵溫度對米糠粕SDF提取率有顯著影響。發酵溫度達到25 ℃時，SDF提取率達到最高。這是因為溫度對于微生物的生長有重要影響，當溫度過低時，微生物會生長緩慢，產酶的速度相應緩慢，而當溫度過高，微生物又容易過早的老化，產酶的速度也迅速的降低，因此確定較佳發酵溫度為25 ℃。

2.1.4 發酵初始pH值的確定

圖4 發酵初始pH值對SDF提取率的影響Fig. 4 Inf l uence of pH on SDF yield

由圖4可知，pH值對米糠粕SDF提取率有顯著影響。在低pH值時變化不明顯，隨著pH值的升高提取率增大，在pH值為5.0時，SDF提取率達到最高，繼續升高pH值，提取率降低。分析SDF提取率下降原因與菌種作用的最適pH值有關，黑曲霉適宜在偏酸性的條件下生長，當偏離最適pH值，菌體生長緩慢，從而影響作用效果。同時pH 5.0為米糠粕與水混合液的自然pH值，偏離自然pH值都需要加酸或堿來調節，考慮到環保因素和操作簡便、提高效率因素，pH值不再作為響應面因素進行優化，因此選擇適宜的初始發酵pH值為5.0。

2.1.5 搖床轉速的確定

圖5 搖床轉速對SDF提取率的影響Fig. 5 Inf l uence of shaking speed on SDF yield

由圖5可知，搖床轉速對米糠粕SDF提取率有顯著影響。隨著搖床轉速的增大，黑曲霉與氧氣、米糠粕的接觸面積也越大，從而使菌體生長代謝速度加快。在搖床轉速為150 r/min時，米糠粕SDF提取率達到最高。搖床轉速繼續增大，會使剪切力增加[34]，從而造成黑曲霉菌絲體斷裂，影響SDF提取率。考慮到節能和經濟因素，搖床轉速不再作為響應面優化因素，因此選擇搖床轉速為150 r/min。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，以發酵時間、發酵溫度、料液比為自變量，米糠粕中SDF提取率為響應值，通過Box-Behnken響應面設計對發酵條件進一步優化。發酵米糠粕試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Experimental scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 擬合模型的建立與結果分析

應用Box-Behnken進行多元回歸擬合分析，可得到SDF提取率（Y）與各發酵條件A、B、C之間的二次多項式模型式。利用此二次回歸方程可以為優化提取SDF的發酵條件提供較好的數學模型，對SDF提取率的變化進行預測。二次多項回歸方程如下：

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗Table 3 Analysis of variance and signif i cance test of regression model

由表3方差分析可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），表明與實際情況擬合度好；失擬項不顯著（P=0.258 3），表明殘差均由隨機誤差引起，對實驗干擾小，預測值與試驗值有高度相關性（R2=0.985 6）。R2Adj表示模型調整確定系數，本試驗中為0.967 2，表示試驗數據可靠性較高，可以用此模型來分析和預測黑曲霉發酵提取米糠粕提取SDF的工藝條件。由F值可知，3 個因素對米糠粕SDF提取率的影響大小依次為發酵時間（A）＞發酵溫度（B）＞料液比（C）。

2.2.3 響應面試驗交互作用分析

響應面是響應值對各試驗因素所構成的立體圖，因素對試驗結果影響越大，表面曲面越陡峭。等高線的形狀反映兩兩因素之間交互作用的顯著程度，等高線呈圓形表示兩因素交互作用不顯著，而當等高線呈橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[35-36]。

交互項對SDF提取率的影響見圖6，通過這組圖可以對任意兩因素之間交互影響的效應進行分析和評價，從而確定最佳的因素水平范圍。

圖6 各因素交互作用對SDF提取率影響的響應面及等高線圖Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on SDF yield

根據Box-Behnken試驗所得的結果和分析二次多項回歸方程，獲得了提取米糠粕SDF的最佳發酵提取條件：A=0.21、B=0.16、C=0.13，即發酵時間77.04 h、發酵溫度25.80 ℃、料液比1∶10.65（g/mL）時，SDF提取率最高。

2.2.4 驗證實驗結果

考慮到實際情況，選擇發酵時間77 h、發酵溫度26 ℃、料液比1∶11（g/mL）的條件下，進行3 次重復性驗證實驗。實驗結果平均值為38.23%，與理論值38.11%接近，擬合度較好，說明采用響應面設計得到的工藝參數真實可信，有較好的指導意義。

2.3 發酵前后SDF理化性質變化

表4 發酵前后米糠粕SDF理化性質的變化（，n=3）Table 4 Changes in physicochemical properties of SDF before and after fermentation (, n= 3)

表4 發酵前后米糠粕SDF理化性質的變化（，n=3）Table 4 Changes in physicochemical properties of SDF before and after fermentation (, n= 3)

注：同列不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

DF 膨脹力/（mL/g） 持水力/（g/g） 持油力/（g/g）未發酵 3.15±0.29b 2.56±0.21b 2.43±0.04b發酵 5.81±0.06a 4.59±0.09a 4.21±0.11a

由表4可知，經過黑曲霉發酵后提取出的米糠粕SDF膨脹力提高了84.44%，持水力提高了79.30%，持油力提高了73.25%。即經過發酵處理，米糠粕SDF的膨脹力、持水力和持油力都有顯著提高。高的膨脹力和持水力是DF功能特性的良好體現。由于發酵過程中黑曲霉產生的纖維素酶使原來聚合度高的米糠粕IDF部分降解成結構松散的小顆粒SDF[37]，從而增加了水與SDF的接觸面積，進而提高了膨脹力和持水力[38-39]。持油力經過發酵后也顯著提高，因此表明，黑曲霉發酵可有效提高米糠粕SDF的理化性質，是改性米糠粕DF的有效途徑。

2.4 發酵前后米糠粕SDF超微結構觀察

如圖7所示，放大10 000 倍后，兩者的形態結構區別明顯。發酵前米糠粕SDF（圖7a）結構致密，顆粒較大；發酵后的SDF（圖7b）表面結構發生變化，疏松、多孔蜂窩狀，顆粒變小。原因是黑曲霉在發酵過程中代謝產生纖維素酶，能夠作用于米糠粕中的纖維多糖，使其糖苷鍵降解，因此可以使原來致密的結構遭到破壞，呈現出松散的狀態。這種結構有利于水分子、油分子的進入，增加與水和油的接觸面，從而改善SDF膨脹力、持水力和持油力等理化性質。

圖7 發酵前（a）和發酵后（b）米糠粕SDF掃描電鏡圖Fig. 7 SEM images of rice bran SDF before and after fermentation

3 結 論

采用黑曲霉對米糠粕進行發酵，通過單因素結合Box-Behnken響應面試驗設計，得到最佳發酵時間77 h、發酵溫度26 ℃、料液比1∶11（g/mL）、pH 5.0、搖床轉速150 r/min時，SDF提取率為38.23%，比發酵前提高了29.58%。發酵后的SDF經掃描電鏡觀察，其表面結構粗糙、疏松多孔，由小顆粒聚集而成，這種結構有利于水分子和油分子的進入，從而提高其膨脹力、持水力及持油力。與其他方法制備米糠粕SDF相比[40-41]，黑曲霉發酵法制備米糠粕SDF，提取率顯著提高，同時功能性質也有很大程度改善，這些優良的性質為其在食品工業中的應用提供了依據。

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Optimization of the Preparation Process for Soluble Dietary Fiber from Rice Bran by Aspergillus niger Fermentation and Its Physicochemical Properties

MIN Zhongman, GAO Lu, GAO Yuzhe, XU Caihong, DENG Xuexue, XIAO Zhigang*
(College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Rice bran was fermented to produce soluble dietary fi ber (SDF) with Aspergillus niger. The optimum fermentation conditions for higher yield of SDF were determined by one-factor-at-a-time method and Box-Behnken response surface methodology and the structural and physicochemical change of SDF before and after fermentation was examined. The maximum yield of SDF of 38.23% was achieved after fermentation at 26 ℃ and pH 5.0 with a solid-to-solvent ratio of 1:11 (g/mL) at a shaking speed of 150 r/min, which was improved by 29.58% compared with that before optimization. The swelling force, water-holding capacity and oil-holding capacity of SDF were increased respectively by 84.44%, 79.30%and 73.25% after fermentation. The result of scanning electron microscopy showed that fermented SDF displayed a rough surface and porous structure.

rice bran; soluble dietary fi ber; Aspergillus niger; response surface methodology; physiochemical properties

10.7506/spkx1002-6630-201802018

TS209

A

1002-6630（2018）02-0112-07

閔鐘熳, 高路, 高育哲, 等. 黑曲霉發酵法制備米糠粕可溶性膳食纖維工藝優化及其理化分析[J]. 食品科學, 2018, 39(2):

112-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802018. http://www.spkx.net.cn

MIN Zhongman, GAO Lu, GAO Yuzhe, et al. Optimization of the preparation process for soluble dietary fi ber from rice

bran by Aspergillus niger fermentation and its physicochemical properties[J]. Food Science, 2018, 39(2): 112-118. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802018. http://www.spkx.net.cn

2017-07-14

2015年度國家星火計劃項目（2015GA650007）；遼寧省農業領域青年科技創新人才項目（2015053）；

沈陽師范大學優秀人才支持計劃項目（2016）

閔鐘熳（1982—），女，講師，博士，研究方向為糧油加工及微生物發酵。E-mail：sy776838@icloud.com*通信作者簡介：肖志剛（1972—），男，教授，博士，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。E-mail：ln75939@163.com