紅景天和輪葉黨參混合提取物戊糖乳桿菌發(fā)酵條件及抗氧化作用分析

姜國哲，全貞玉，金潤浩，HONG Heedo*，韓春姬,*

紅景天和輪葉黨參混合提取物戊糖乳桿菌發(fā)酵條件及抗氧化作用分析

姜國哲1，全貞玉1，金潤浩1，HONG Heedo2,*，韓春姬1,*

（1.延邊大學醫(yī)學院，吉林 延吉 133002；2.韓國食品研究院，京畿道 城南 462-746）

目的：優(yōu)化紅景天和輪葉黨參混合提取物（mixed extracts from Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata，RCME）戊糖乳桿菌發(fā)酵條件，分析發(fā)酵產(chǎn)物的主要活性成分組成與含量，評價其抗氧化作用。方法：RCME中接種戊糖乳桿菌，以發(fā)酵液中的pH值、總酸含量及生物量為指標，研究發(fā)酵所需的最佳時間、培養(yǎng)基組成（紅景天和輪葉黨參混合比例）、RCME最佳質(zhì)量濃度；采用比色法測定RCME發(fā)酵前后的總蛋白質(zhì)、中性糖、酸性多糖及總酚含量變化，采用高效液相色譜法分析RCME發(fā)酵前后的紅景天苷和酪醇含量變化，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical，ABTS＋·）清除實驗評價RCME發(fā)酵物的抗氧化作用。結(jié)果：單純紅景天提取物發(fā)酵24～72 h，其pH值和總酸含量無明顯變化，隨著發(fā)酵時間延長，乳桿菌數(shù)明顯減少（P＜0.01）。紅景天和輪葉黨參混合質(zhì)量比達到3∶2，發(fā)酵24 h后發(fā)酵液的pH值下降幅度和總酸含量升高的幅度最大，發(fā)酵48 h時后，pH值和總酸含量無明顯的變化，乳桿菌數(shù)有所減少。可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)在1.0%～3.0%范圍內(nèi)，紅景天苷轉(zhuǎn)化為酪醇的轉(zhuǎn)化率無明顯差異。RCME發(fā)酵24 h后，紅景天苷含量顯著減少（P＜0.01），酸性多糖、總酚、蛋白質(zhì)及酪醇含量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。RCME發(fā)酵后DPPH自由基和ABTS＋·清除能力明顯增強。結(jié)論：RCME發(fā)酵條件為紅景天-輪葉黨參混合比例3∶2、可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)1.0%～3.0%、發(fā)酵時間24 h。

紅景天；輪葉黨參；戊糖乳桿菌；發(fā)酵；抗氧化

生長在長白山的高山紅景天（Rhodiola sachalinensis A. Bor）為景天科紅景天屬多年生草本植物，具有明顯的耐缺氧、抗疲勞、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血糖、抗肝毒性等多種功效[1-6]。因此，高山紅景天作為保健食品的良好原料備受關注。高山紅景天中的主要活性成分為紅景天苷及其苷元酪醇，這些成分具有明顯的抗氧化及抗疲勞作用[7-8]。酪醇在體外清除羥自由基的能力高于紅景天苷[9]。紅景天苷在大鼠體內(nèi)藥代動力學研究結(jié)果表明，經(jīng)口給予紅景天苷后0.5～4 h內(nèi)僅在肝臟中檢測到紅景天苷，而在心、肝、脾、肺、腎等組織中均檢測到其苷元酪醇，表明紅景天苷在體內(nèi)代謝為酪醇后發(fā)揮生物學作用[10]。

研究表明，將紅景天與紅參混合，用乳酸菌發(fā)酵后，總酚、總蛋白及酪醇含量明顯增加，紅景天苷含量明顯減少，其抗氧化作用明顯增強[11]，進一步研究結(jié)果表明紅參和紅景天混合發(fā)酵物可使骨骼肌細胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶、Cu/Zn-超氧化物歧化酶基因表達明顯增強[12]。但由于紅參原料價格昂貴，造成紅景天發(fā)酵產(chǎn)品的成本極高，如何得到紅參的替代材料成為降級產(chǎn)品價格的關鍵。

輪葉黨參（Codonopsis lanceolata Benth. et Hook.）為多年生草本植物，主要分布在中國、韓國、朝鮮等地區(qū)，具有消炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、通乳等功效，因其含有豐富的淀粉、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，作為山野菜廣泛食用，其水提取物無急性或亞急性毒性[13]。與紅參相比，輪葉黨參同樣含有豐富的皂苷、黃酮類及多糖成分，具有抗疲勞、增強免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血脂等多種與紅參類似的功能[14-15]，并且易被乳酸菌發(fā)酵[16]，同時價格比人參更為低廉。

本研究擬以輪葉黨參作替代紅參，通過將輪葉黨參和紅景天作為乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，探討發(fā)酵的適宜條件，分析發(fā)酵產(chǎn)物的理化特征及抗氧化作用，為高山紅景天資源的大規(guī)模開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高山紅景天和輪葉黨參干燥根為吉林省延邊州安圖縣高山紅景天種植基地和輪葉黨參種植基地產(chǎn)品，用粉碎機進行微粉碎（80目）。

戊糖乳桿菌菌株Lactobacillus pentosus KFRI 1183（L1183） 韓國食品研究院；紅景天苷對照品中國食品藥品檢定研究院；酪醇對照品 美國Chromadex公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azo-bis (2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH） 上海源葉生物有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenly-2-picrylhydrazyl，DPPH） 日本W(wǎng)ako公司；2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

430型pH計 美國Corning公司；Mega 17R低溫離心機 韓國Hanil Science Indusrrial公司；CyclotecTM1093粉碎機 美國Foss公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 紅景天-輪葉黨參混合提取物的制作

將紅景天和輪葉黨參粉末以質(zhì)量比1∶0、9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1的比例混合，分別加10倍于原料質(zhì)量的蒸餾水，90℃恒溫加熱回流提取3 h，過濾，濾液經(jīng)8 000 r/min低溫離心10 min，上清液用濾紙過濾，冷凍干燥，得到紅景天-輪葉黨參混合提取物（mixed extracts from Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata，RCME），此濾液作為L1183發(fā)酵的液體培養(yǎng)基。

1.3.2 L1183發(fā)酵RCME

1.3.2.1 L1183發(fā)酵條件

將L1183接種在MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)20 h左右進行活化。將制備好的RCME稀釋成一定質(zhì)量分數(shù)（0.5%～3.0%），在121℃滅菌15 min，將活化的L1183以1%（106CFU/mL）的質(zhì)量分數(shù)接種于高壓滅菌處理過的RCME中，在37℃下發(fā)酵24～72 h后，冷凍干燥，得到紅景天-輪葉黨參混合提取液發(fā)酵物（fermented RCME，F(xiàn)RCME）。

1.3.2.2 菌落數(shù)測定

取1 mL L1183發(fā)酵液FRCME加入到9 mL無菌生理鹽水中，分階段稀釋，取0.1 mL稀釋液涂抹在MRS瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后測量生成的菌落數(shù)，最后平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可計算每毫升提取物中的菌落數(shù)。

1.3.3 理化特征與指標成分分析

1.3.3.1 pH值與可滴定酸度測定

利用pH計測量RCME在發(fā)酵過程中的pH值。采用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的方法測定發(fā)酵液的總酸質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3.2 多糖及糖醛酸含量測定

采用苯酚-硫酸法[17]測定多糖含量。將RCME及FRCME分別置于試管中，加蒸餾水溶解，使其質(zhì)量濃度達到1 g/100 mL，用0.45 μm薄膜過濾，取續(xù)濾液各1 mL置于新的試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，充分混勻，加入磺酸5 mL，反應30 min，在490 nm波長處測定吸光度，通過測得的葡萄糖含量來計算多糖含量。

采用咔唑-硫酸法[18]測定糖醛酸的含量。將RCME及FRCME分別加入到試管中，加蒸餾水溶解，使其質(zhì)量濃度達到1 g/100 mL，用0.45 μm薄膜過濾。取續(xù)濾液各0.5 mL，置于新的試管中，加入0.125%咔唑溶液0.25 mL，充分混勻，加入硫酸3 mL，在85 ℃水浴中反應15 min，在525 nm波長處測定吸光度。以β-D-半乳糖醛酸為標準物計算糖醛酸的含量。

1.3.3.3 總酚含量的測定

采用多酚物質(zhì)與磷鉬酸反應后發(fā)生青色反應的Folin Deinis法[19]測定總酚含量。即將RCME及FRCME分別置于試管中，加蒸餾水溶解，使其最終質(zhì)量濃度達到1 g/100 mL，用0.45 μm濾膜過濾。取新的試管，分別加入不同樣品續(xù)濾液0.1 mL，再加入蒸餾水5 mL，充分混勻，各試管分別加入福林-酚試劑0.5 mL，加入飽和Na2CO3溶液1.5 mL及蒸餾水2.9 mL，常溫放置2 h后在765 nm波長處測定吸光度，最后以沒食子酸標準品計算總酚含量。

1.3.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

用改良的Bradford[20]法測定樣品中的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標準物。即將受試物分別放入試驗管中，加蒸餾水溶解，使最終質(zhì)量濃度達到1 g/100 mL，用0.45 μm濾膜過濾。取新試管，分別加入續(xù)濾液0.1 mL，加入Bradford dye試劑1 mL，充分混勻，在常溫下反應10 min，在600 nm波長處測定吸光度并計算蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.5 發(fā)酵前后成分分析

為了分析FRCME中的紅景天苷和酪醇的含量，取紅景天苷和酪醇對照品各10 mg，溶于甲醇，配制成所需質(zhì)量濃度。準確稱取待測樣品0.100 0 g溶于10 mL甲醇，用0.45 μm濾膜過濾，采用HPLC儀分析。色譜分析條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為90%乙腈（A）和0.3%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～8 min，8% A；8～25 min，8%～15% A；25～35 min，15%～8% A；35～40 min，8%A）；檢測波長278 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測器，樣品注入量20 μL。

1.3.4 抗氧化作用評價

1.3.4.1 DPPH自由基清除實驗

參考Huang Bo等[21]方法進行DPPH自由基清除率測定。取乙醇2.8 mL，加入實驗液0.4 mL和4×10-4mol/L的DPPH溶液0.8 mL混合，室溫放置10 min，525 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率的計算如式（1）所示：

1.3.4.2 ABTS＋·清除實驗

ABTS＋·清除實驗參考Tuberoso等[22]提出的改良方法進行。1 mmol/L的AAPH：將100 mmol/L磷酸鹽緩沖液加2.5 mmol/L的ABTS，混勻并在68 ℃恒溫中反應12 min。ABTS溶液的濃度控制在734 nm波長處吸光度0.650±0.2。最后取待測樣品20 μL和ABTS試液980 μL混勻，在37 ℃恒溫水浴中反應10 min，734 nm波長處測定吸光度。ABTS＋·清除率的計算如式（2）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

實驗結(jié)果采用SPSS Statistics 17.0進行統(tǒng)計分析，用Bonferroni方法檢驗各組間統(tǒng)計有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RCME最適發(fā)酵條件的確定

為篩選L1183菌株對RCME的最適發(fā)酵條件，將紅景天與輪葉黨參原料以不同比例混合，制備RCME，接種L1183菌株后在37℃發(fā)酵24～72 h，在不同時間點測定發(fā)酵液的pH值、總酸含量及L1183菌落數(shù)，測定結(jié)果見表1和表2。單純紅景天發(fā)酵24、48 h及72 h后，其pH值無顯著變化（P＞0.05），表明紅景天提取物幾乎未發(fā)酵。

表1 不同混合比例條件下FRCME中pH值及總酸含量的變化（，n=3）Table 1 Changes in pH and acidity of FRCME with different Rhodiola sachalinensis to Codonopsis lanceolata ratios (x s, n=3)

表1 不同混合比例條件下FRCME中pH值及總酸含量的變化（，n=3）Table 1 Changes in pH and acidity of FRCME with different Rhodiola sachalinensis to Codonopsis lanceolata ratios (x s, n=3)

混合質(zhì)量比pH 總酸質(zhì)量分數(shù)/%24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 10∶0 6.00±0.03 5.89±0.01 5.72±0.02 0.031±0.001 0.033±0.001 0.043±0.000 9∶1 5.38±0.02 5.39±0.03 5.34±0.05 0.032±0.001 0.042±0.001 0.044±0.004 4∶1 5.31±0.02 5.08±0.02 5.05±0.01 0.038±0.003 0.056±0.001 0.060±0.000 7∶3 4.48±0.04 4.24±0.02 4.24±0.02 0.079±0.001 0.097±0.002 0.099±0.001 3∶2 3.61±0.06 3.54±0.02 3.51±0.01 0.150±0.004 0.172±0.001 0.174±0.002 1∶1 3.56±0.01 3.38±0.02 3.31±0.02 0.170±0.002 0.181±0.001 0.182±0.002

表2 不同混合比例條件下FRCME中L1183活菌數(shù)的變化（x ±s，n=3）Table 2 Changes in L1183 viable cell count in FRCME with different Rhodiola sachalinensis to Codonopsis lanceolata ratios (, n= 3)

表2 不同混合比例條件下FRCME中L1183活菌數(shù)的變化（x ±s，n=3）Table 2 Changes in L1183 viable cell count in FRCME with different Rhodiola sachalinensis to Codonopsis lanceolata ratios (, n= 3)

CFU/mL混合質(zhì)量比 0 h 24 h 48 h 10∶0 3.3×106 4.5×104 1.2×103 9∶1 3.3×106 9.1×104 7.1×104 4∶1 3.3×106 9.5×105 8.2×105 7∶3 3.3×106 8.8×107 7.0×107 3∶2 3.3×106 2.4×108 1.7×108 1∶1 3.3×106 2.2×108 2.0×108

紅景天加不同比例的輪葉黨參混合制備RCME在發(fā)酵24、48 h及72 h后，隨著輪葉黨參添加比例的增加，其pH值逐漸下降，總酸含量逐漸增高。輪葉黨參添加比例為30%以上，發(fā)酵24 h后，與單純紅景天組比較（pH 6.0），其pH值明顯下降（P＜0.001），總酸含量明顯增高（P＜0.001）。當輪葉黨參添加比例達到50%時，發(fā)酵24、48 h及72 h后pH值分別下降了2.44、2.51及2.41，不同時間點pH值下降幅度無顯著差異（P＞0.05），表明添加輪葉黨參的比例越高，發(fā)酵后的pH值越低，總酸含量越高，發(fā)酵24 h后再延長發(fā)酵時間對發(fā)酵無明顯的影響，因此最適發(fā)酵時間可確定為24 h。一般情況下，乳酸菌發(fā)酵過程中pH值下降的現(xiàn)象是由于發(fā)酵過程中生成醋酸、丙酸、丁酸、檸檬酸等有機酸所致[23]，本實驗實際測定的總酸含量結(jié)果也表明類似趨勢。

菌落數(shù)測定結(jié)果表明，單純紅景天隨著發(fā)酵時間延長，菌落數(shù)急劇減少，發(fā)酵24 h后菌落數(shù)減少了98.6%，發(fā)酵48 h后減少了99.9%，表明單純紅景天提取物對L1183有明顯的抑制作用，無法進行發(fā)酵，該結(jié)果與Sung等[11,24]的研究結(jié)果基本一致。與0 h相比，當輪葉黨參添加比例增加至30%時，發(fā)酵24 h后菌落數(shù)增加至26.7倍；輪葉黨參添加比例達到40%時，發(fā)酵24 h增加至72.7倍，發(fā)酵48 h后有所減少；輪葉黨參添加比例達到50%，發(fā)酵24 h和48 h后菌落數(shù)增加至66.7倍和60.6倍，表明紅景天中添加輪葉黨參40%～50%，L1183發(fā)酵良好。發(fā)酵48 h后菌落數(shù)比發(fā)酵24 h時有所減少，該結(jié)果與Song等[25]研究結(jié)果基本一致，其可能的原因是發(fā)酵時間超過24 h后，混合提取物中的L1183增殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，以及增殖過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物堆積，從而抑制乳酸菌增殖。

根據(jù)以上結(jié)果判斷，紅景天中添加輪葉黨參的比例達到40%時可以進行L1183發(fā)酵。后續(xù)的實驗采用紅景天-輪葉黨參混合比例為3∶2。

為了確定混合提取液中可溶性固形物含量對發(fā)酵過程的影響，取RCME（混合比例為1∶1）的固形物質(zhì)量分數(shù)分別為1.0%和3.0%，接種L1183菌株。在發(fā)酵24、48 h及72 h時分別測定pH值、總酸含量及菌落數(shù)的變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同固形物含量條件下pH值（A）、總酸質(zhì)量分數(shù)（B）及L1183菌落數(shù)（C）變化Fig. 1 Changes in pH, acidity and viable cell counts of FRCME with different soluble solid contents

固形物質(zhì)量分數(shù)為1.0%和3.0%時，發(fā)酵前pH值均為6.13，發(fā)酵24 h后pH值下降至3.59和3.61，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，pH值無明顯變化。固形物質(zhì)量分數(shù)為1.0%和3.0%時，發(fā)酵前總酸質(zhì)量分數(shù)為0.028%，發(fā)酵24 h后分別提高至0.184%和0.409%，分別提高到原來的6.6 倍和14.6倍，固形物質(zhì)量分數(shù)為3.0%時的總酸含量明顯高于固形物質(zhì)量分數(shù)1.0%的總酸含量（P＜0.01），發(fā)酵48 h和72 h后總酸含量進一步提高，但與24 h時比較無明顯差異。菌落數(shù)測定結(jié)果：發(fā)酵前為6.25（lg（CFU/mL）），發(fā)酵24 h后增加至8.92（lg（CFU/mL））和8.83（lg（CFU/mL））（發(fā)酵前后發(fā)酵后比較，P＜0.01），發(fā)酵48 h后菌落數(shù)有所減少。固形物質(zhì)量分數(shù)在1.0%～3.0%范圍內(nèi)，對L1183增殖無明顯的影響。

綜合上述結(jié)果，發(fā)酵的最適條件為：紅景天-輪葉黨參混合比例3∶2、可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)1.0%、發(fā)酵時間24 h。

2.2 發(fā)酵前后成分分析

圖2 紅景天苷（A）、酪醇（B）、FRCME（C）和RCME（D）的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatograph of salidroside (A), tyrosol (B),FRCME (C) and RCME (D)

圖3 RCME和FRCME溶液中紅景天苷（a）和酪醇（b）含量的變化Fig. 3 Changes in salidroside and tyrosol contents of RCME

為觀察RCME發(fā)酵后紅景天有效成分變化，采用HPLC法檢測紅景天苷及其苷元酪醇含量，結(jié)果如圖2、3所示。RCME溶液固形物質(zhì)量分數(shù)為1.0%時，紅景天苷和酪醇含量分別為481.5 mg/100 g和37.0 mg/100 g，發(fā)酵24 h后FRCME紅景天苷含量減少至207.4 mg/100 g，酪醇含量增加至333.3 mg/100 g，發(fā)酵后紅景天苷減少了56.9%，酪醇增加了8.01 倍。RCME溶液的固形物質(zhì)量分數(shù)為3.0%時，紅景天苷和酪醇含量分別為570.4 mg/100 g和51.9 mg/100 g，發(fā)酵24 h后紅景天苷含量減少至133.3 mg/100 g，酪醇含量增加至374.1 mg/100 g，發(fā)酵后紅景天苷減少了76.6%，酪醇增加了6.21 倍，表明在發(fā)酵過程中，紅景天苷水解，轉(zhuǎn)化為其苷元酪醇。可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)在1.0%～3.0%范圍內(nèi)，紅景天苷轉(zhuǎn)化為酪醇的轉(zhuǎn)化率無明顯差異。

紅景天苷是糖的半縮醛羥基與醇羥基脫水形成的醇苷，是一種由葡萄糖與酪醇以苷鍵結(jié)合而成的糖苷。催化紅景天苷降解的第一個酶是β-D-葡萄糖苷酶。本實驗中，用L1183發(fā)酵RCME后，紅景天苷含量明顯減少，而酪醇含量顯著增高。其可能的機制是L1183在增殖過程中產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶，促進紅景天苷水解轉(zhuǎn)化為酪醇，其確切機制有待于今后進一步研究。

林俊芝等[26]研究結(jié)果顯示，給大鼠分別灌胃紅景天苷和酪醇各100 mg/kg后，紅景天苷血藥濃度在30 min達峰，而酪醇血藥濃度在5 min后達峰，表明酪醇在腸道中的吸收比紅景天苷迅速。Guo Na等[10]報道，給大鼠灌胃紅景天苷100 mg/kg后，僅在肝組織中檢測到紅景天苷，但在心、肝、腎、脾、肺等組織中均檢測到酪醇，表明紅景天苷被吸收后在組織臟器中主要以酪醇的形式發(fā)揮生物學作用。本實驗結(jié)果表明，紅景天與輪葉黨參混合，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，使大部分紅景天苷轉(zhuǎn)化為酪醇，可提高其在胃腸道中的吸收速度及在體內(nèi)的生物利用率[27]。

2.3 理化性質(zhì)及成分特征分析

表3 發(fā)酵前后主要成分的含量變化（x±s，n=3）Table 3 Changes in major component contents of RCME after fermentation (x s, n=3)

表3 發(fā)酵前后主要成分的含量變化（x±s，n=3）Table 3 Changes in major component contents of RCME after fermentation (x s, n=3)

%蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)RCME 70.90±2.43 26.93±1.80 0.70±0.07 1.51±0.03 FRCME 66.10±2.41 30.73±1.76* 1.02±0.07** 2.32±0.03***注：與發(fā)酵前RCME比較，*.P＜0.05；**.P＜0.01；***.P＜0.001。下同。組別 總糖質(zhì)量分數(shù)酸性多糖質(zhì)量分數(shù)總酚質(zhì)量分數(shù)

如表3所示，RCME發(fā)酵后總糖質(zhì)量分數(shù)由發(fā)酵前70.9%減少至66.1%，酸性多糖質(zhì)量分數(shù)由發(fā)酵前26.93%增加至30.73%。發(fā)酵后總酚和蛋白質(zhì)含量顯著高于發(fā)酵前（總酚類化合物t=5.787，P＜0.01；蛋白質(zhì)t=35.074，P＜0.001），總酚由發(fā)酵前的0.70%增加至1.02%，蛋白質(zhì)由發(fā)酵前的1.51%增加至2.32%。蛋白質(zhì)含量顯著增加的主要原因是乳酸菌大量增殖，總酚含量顯著增加的主要原因可能是紅景天和輪葉黨參中含有的高分子酚類化合物在發(fā)酵過程中分離成許多低分子酚類化合物或游離的酚類化合物，從而增加總酚類化合物含量。植物原料中總酚類化合物的含量越高，其抗氧化活性越強[28]。由此推測，紅景天經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，在體內(nèi)抗氧化、清除自由基的生物活性可能有一定的增強。

2.4 FRCME抗氧化作用評價

圖4 發(fā)酵前后的DPPH自由基（a）和ABTS＋·（b）清除能力Fig. 4 DPPH radical and ABTS+· scavenging activities of RCME and FRCME

如圖4所示，用FRCME 1 mg/mL處理時DPPH自由基清除率為46.8%，與發(fā)酵前比較具有顯著差異（P＜0.01），用FRCME 10 mg/mL處理時，其DPPH自由基清除率達到95.6%，比發(fā)酵前提高了10%（P＜0.01）。FRCME在0.5～6.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)ABTS＋·和DPPH自由基清除率均顯著高于RCME（P＜0.05或P＜0.01），F(xiàn)RCME和RCME清除DPPH自由基的IC50分別為1.10 mg/mL和1.61 mg/mL，F(xiàn)RCME和RCME清除ABTS＋·的IC50分別為3.33 mg/mL和4.69 mg/mL。總酚是廣泛分布于植物中的次級代謝產(chǎn)物，具有多種結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量，酚類化合物中的酚羥基具有抑制脂質(zhì)過氧化、抗氧化、抗癌、降血壓等多種生理活性[29-30]。Akter[31]和Oke-Altuntas[32]等研究結(jié)果表明，DPPH自由基和ABTS＋·清除能力隨著總多酚含量的增高而逐漸增強，總酚含量與自由基清除能力具有較高的相關性。本研究中，F(xiàn)RCME清除DPPH自由基和ABTS＋·能力明顯高于RCME，這一結(jié)果與FRCME和RCME的總酚含量變化相吻合，與其他研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

本研究通過考察RCME在戊糖乳桿菌發(fā)酵過程中的理化指標及活菌數(shù)的變化，研究了紅景天和輪葉黨參混合發(fā)酵的最佳條件，采用DPPH自由基和ABTS＋·清除實驗方法考察了FRCME的抗氧化作用。結(jié)果表明：單純紅景天幾乎不能用戊糖乳桿菌發(fā)酵，當紅景天與輪葉黨參原料以3∶2比例混合提取后，接種戊糖乳桿菌發(fā)酵24 h，與單純紅景天組比較，活菌數(shù)增加至2.4×108CFU/mL，pH值由6.0下降至3.61，總酸由0.031%增加至0.150%，發(fā)酵時間延長至48 h時，活菌數(shù)增加量有所減少，pH值進一步下降，總酸含量進一步提高。發(fā)酵液中可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)為1.0%，發(fā)酵24 h后菌落數(shù)由發(fā)酵前的6.25（lg（CFU/mL））增加至8.92（lg（CFU/mL）），約增加了467倍；可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)提高至3.0%，發(fā)酵24 h后菌落數(shù)增加至8.83（lg（CFU/mL）），約增加了380 倍，但兩者無明顯差異。經(jīng)戊糖乳桿菌發(fā)酵24 h，紅景天苷含量明顯減少（P＜0.01），酸性多糖、總酚、蛋白質(zhì)及酪醇含量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。因此，紅景天和輪葉黨參混合提取物戊糖乳桿菌發(fā)酵的最佳條件為：紅景天和輪葉黨參混合比例3∶2，可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)1.0%～3.0%，37℃發(fā)酵24 h。發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化作用評價結(jié)果顯示：戊糖乳桿菌發(fā)酵后，F(xiàn)RCME質(zhì)量濃度在1～6 mg/mL范圍內(nèi)DPPH自由基和ABTS＋·清除率明顯高于RCME。

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Fermentation Conditions and Antioxidative Activity of Mixed Extracts from Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata by Lactobacillus pentosus

JIANG Guozhe1, QUAN Zhenyu1, JIN Runhao1, HONG Heedo2,*, HAN Chunji1,*
(1. Medical College, Yanbian University, Yanji 133002, China; 2. Korea Food Research Institute, Sungnam 462-746, Korea)

Objective: To investigate the optimization of the fermentation of mixed extracts from Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata (RCME) by Lactobacillus pentosus and to determine the composition of bioactive compounds and antioxidative activity of fermented RCME. Methods: The pH, acidity and mycelial biomass were evaluated as a function of the ratio between Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata, soluble solid content of RCME and fermentation time.Variations in the total protein, neutral sugar, acidic polysaccharide and total phenolics contents in RCME before and after fermentation were determined using colorimetric method, as well as variations in salidroside and tyrosol contents by HPLC.The antioxidant activity of fermented RCME was evaluated using 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) radical scavenging assay. Results: The pH and total acidity were little changed from 24 to 72 h of fermentation when Rhodiola sachalinensis was fermented alone and the viable cell count signif i cantly decreased (P ＜ 0.01). A 3:2 mixture of Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata showed the greatest pH decline and largest increase in acidity at 24 h of fermentation, which remained little changed from 48 h onward,but the viable cell count dropped. Soluble solid content was in the range of 1.0%–3.0%, and the conversion rate of salidroside to tyrosol was not changed significantly from 48 to 72 h. However, salidroside content significantly decreased at 24 h compared with that at 0 h (P ＜ 0.01), whereas tyrosol, acidic polysaccharide, total phenolics and protein signif i cantly increased(P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). DPPH and ABTS+· scavenging activity of fermentation product were signif i cantly higher than those of RCME (P ＜ 0.01). Conclusion: The optimum fermentation conditions of RCME were determined as follows: ratio between Rhodiola sachalinensis and Codonopsis lanceolata ratio, 3:2; soluble solid concentration of RCME 1.0%–3.0%, temperature 37 ℃, and time 24 h.

Rhodiola sachalinensis; Codonopsis lanceolata; Lactobacillus pentosus; fermentation; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201802020

Q815

A

1002-6630（2018）02-0124-07

姜國哲, 全貞玉, 金潤浩, 等. 紅景天和輪葉黨參混合提取物戊糖乳桿菌發(fā)酵條件及抗氧化作用分析[J]. 食品科學,2018, 39(2): 124-130.

10.7506/spkx1002-6630-201802020. http://www.spkx.net.cn

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2017-02-10

國家科技部國際合作專項基金項目（2011DFA33470）

姜國哲（1989—），男，博士研究生，主要從事分子毒理學及保健食品研究。E-mail：gzjiang@ybu.edu.cn

*通信作者簡介：Hong Heedo（1964—），男，研究員，博士，主要從事食品發(fā)酵工程及功能食品研究。E-mail：hdstraw@naver.com

韓春姬（1960—），女，教授，博士，主要從事分子毒理學及保健食品研究。E-mail：chjihan@126.com