特基拉芽孢桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶的異源表達及高密度發酵

范雪萍，馮志彬,*，房美芳，張 娟，陳國忠，李麗娜

（1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學農學院，山東 煙臺 264025）

特基拉芽孢桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶的異源表達及高密度發酵

范雪萍1，馮志彬1,*，房美芳1，張 娟2，陳國忠1，李麗娜1

（1.魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025；2.魯東大學農學院，山東 煙臺 264025）

L-天冬氨酸α-脫羧酶（L-aspartate α-decarboxylase，PanD）能選擇性脫去L-天冬氨酸的α-羧基生成β-丙氨酸，具有重要的工業應用價值。以特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）PanD37的基因組為模板，擴增PanD表達基因panD，構建表達質粒pET32a（＋）-panD，轉入Escherichia coli BL21（DE3）成功實現異源表達。利用搖床和發酵罐優化培養條件實現高密度發酵，確定最佳培養條件為：37 ℃培養8 h，加入終濃度0.5 mmol/L的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）降溫至26 ℃誘導，采用葡萄糖為碳源并控制初始質量濃度為5 g/L，發酵過程中采用pH-stat方式補料。在此基礎上利用5 L發酵罐進行發酵產酶，酶活力最高可達1 109.8 U/mL，OD600nm達到106.3。全細胞催化100 g/L L-天冬氨酸，反應10 h物質的量轉化率為99.2%。構建的重組菌經發酵優化后具有較高的細胞濃度和PanD活力，為生物法β-丙氨酸的工業化生產與應用提供理論支持。

特基拉芽孢桿菌；大腸桿菌；L-天冬氨酸α-脫羧酶；異源表達；β-丙氨酸

β-丙氨酸是一種重要的精細化工品和藥物中間體，廣泛用于合成肌肽、泛酸鈣、巴柳氮、帕米磷酸鈉及聚β-氨基丙酸等生化產品[1-4]。化學合成法是目前β-丙氨酸的主要生產方法，存在成本高、工藝條件苛刻、副產物較多及環境不友好等缺點，生物轉化法生產工藝被認為是最有前景的替代方法。生物轉化法是以L-天冬氨酸為生產原料，利用微生物胞內L-天冬氨酸α-脫羧酶（L-aspartate α-decarboxylase，PanD）催化L-天冬氨酸脫α位羧基生產β-丙氨酸[5]。因此生物生產法的研究重點是尋找到一個合適的PanD并進行高效的異源表達。

研究發現PanD僅存在于微生物和植物中，是泛酸合成途徑中的關鍵酶[6-10]。目前報道的PanD主要來源于大腸桿菌[11]（Escherichia coli）、結核分枝桿菌[12]（Mycobacterium tuberculosis）、沙門菌[13]（Salmonella typhimurium）、谷氨酸棒桿菌[14]（Corynebacterium glutamicum）及幽門螺桿菌[15]（Helicobacter pylori）等菌屬。目前研究較多的是E. coli，在結構解析、自剪切機理及酶學性質方面取得不少成果，已證實PanD為丙酮酰基依賴型的脫羧酶，需要在翻譯后通過電子重排促使肽鏈斷裂，形成丙酮酰基活性中心[5]。亦有關于E. coli PanD（PanDE.c）工程表達的研究報道[16-18]，但大多數酶活力低下，且重組PanDE.c在宿主E. coli內多以未激活的酶原形式存在，必須在PanZ或PanM蛋白的作用下才能在常溫下進行剪切形成丙酮酰基[19]。Nicole等[20]克隆了C. glutamicum PanD（PanDC.g）和PanDE.c的合成基因并在E. coli中表達，PanDC.g活力約為PanDE.c活力的15.5 倍，且無需PanZ或PanM蛋白完成自剪切過程形成丙酮酰基。因此，近年來國內外學者關于PanD的研究更多的鎖定在C. glutamicum上。趙連真等[21]克隆PanDC.g在E. coli BL21（DE3）中表達，酶活力高達9 4.1 6 U/m L，是目前為止報道的最高水平。Shen Yan等[22]對重組PanDC.g酶學性質進行充分研究，并以此為基礎應用于β-丙氨酸催化合成，36 h可產生12.85 g/L的β-丙氨酸，轉化率為97.2%，相較于PanDE.c有不少程度提高。Song等[23]利用E. coli W3110胞內異源擴增PanDC.g，同時強化表達天冬氨酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，構建從葡萄糖開始的β-丙氨酸全合成途徑，經39 h發酵β-丙氨酸產量達到32.3 g/L，葡萄糖轉化率13.5%，為應用PanD合成β-丙氨酸開啟了一條新思路。以上研究表明PanDC.g在生產β-丙氨酸方面取得較大的進步，但仍然存在酶活力不夠高、產物濃度低、轉化率低及生產周期長的缺點，和化學法相比仍無明顯的成本優勢，距離工業應用尚有一段距離。

鄧思穎等[24]外源表達枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、C. glutamicum及E. coli的PanD，通過酶學性質比對發現芽孢桿菌屬PanD具有更好的熱穩定性和酶學特性，具有更強的工業應用潛力。本實驗室前期篩選到1 株高活性PanD的特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）[25]，在簡單優化培養基的情況下酶活力可達44.57 U/mL，展現出良好的應用前景。以此菌panD基因為模板，構建了基因工程菌，可溶性表達PanD。同時為提高PanD的表達量，對其培養條件進行優化，進行高密度發酵，提高菌體密度的同時保持單位細胞合成目標蛋白的生產能力，以實現PanD活力的大幅度提高，為β-丙氨酸的工業化生產與應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌E. coli BL21（DE3）用于轉化宿主，B. tequilensis PanD37提供panD基因，以上菌種均由應用微生物研究室保藏；質粒pET32a（＋）購買于Novagen公司。

Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、核酸限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA連接酶 大連寶生物公司；細菌基因組提取試劑盒、細菌質粒提取試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒 上海生工生物有限公司；β-丙氨酸、氨芐青霉素 阿拉丁試劑（上海）有限公司；AccQ·Fluor試劑 美國Waters公司；豆粕水解液山東陽成生物科技公司；其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

LB培養基：酵母浸粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 15 g/L，pH 7.0；發酵培養基：甘油20 g/L，酵母浸粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，豆粕水解液20 g/L，K2HPO413 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，丁二酸1.5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，微量元素母液5 mL/L，pH 7.0；微量元素母液：FeSO4·7H2O 10 g/L，ZnSO4·7H2O 2 g/L，CuSO4·5H2O 2 g/L，CaCl22 g/L，H3BO30.3 g/L，Na6Mo7O240.1 g/L，1 mol/L HCl溶液溶解并儲于棕色試劑瓶中；補料培養基：甘油500 g/L，豆粕水解液40 g/L， MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 7.0。滅菌條件皆為：121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SPX-150B-Z生化培養箱 廣東省醫療器械廠；PCR儀美國Bio-Rad公司；ZWY-111G恒溫振蕩搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-75KB高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；TGL-16B高速離心機上海安亭科學儀器廠；BGZ-5自控發酵罐 上海保興生物設備公司；高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）（色譜柱為Waters AccQ-TagTM柱（150 mm×3.9 mm，4.0 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆與重組菌構建

根據B. tequilensis全基因組（LGRW01000001）中PanD的基因序列信息設計含有限制性內切酶BamHⅠ酶切位點（粗體表示）的上游引物F-PanD：5’-AAGGAT CCGAAGGAGATATACCATGTATCG-3’；含有EcoRⅠ酶切位點（粗體表示）的下游引物R-PanD：5’-TTCTC GAGCTACAAAATTGTACGGGCGGGTTC-3’。通過細菌基因組DNA提取試劑盒提取得到B. tequilensis PanD37基因組DNA，并以該基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系包括10×Ex Taq buffer（Mg2＋Plus）4 μL，dNTPs mixture 4.5 μL，TaKaRa Ex Taq 0.3 μL，模板1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，用dd H2O補足至50 μL。PCR參數為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環后，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，并用DNA凝膠回收試劑盒純化目標DNA片段。用BamHⅠ和EcoRⅠ分別酶切載體pET32a（＋）及panD片段，然后用DNA連接酶將panD片段與載體連接并轉化E. coli BL21（DE3）感受態細胞，挑選陽性克隆并提取質粒pET32a（＋）-panD（圖1），進行質粒PCR驗證和DNA序列測序。

圖1 重組質粒pET32a（）-panD的構建Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pET32a (+)-panD

1.3.2 重組PanD的表達與SDS-PAGE分析

將重組菌接種于含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min培養過夜。以1%接種量轉接到含有100 mg/L氨芐青霉素的新鮮LB培養基中，37 ℃、200 r/min培養至菌液OD600nm約為0.5～0.8后加入1 mmol/L IPTG誘導，于30 ℃繼續培養約16 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌2 次，重懸于pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液中，冰浴下超聲破碎，12 000 r/min離心10 min，取上清酶液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3 培養條件

1.3.3.1 搖瓶培養

挑取1 環新鮮斜面菌種接入含50 mL LB培養基的500 mL三角瓶中，加氨芐青霉素至終質量濃度為100 μg/mL，37 ℃、200 r/min條件下培養6 h，作為種子液。按5%接種量將種子液接入含50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，37 ℃、220 r/min振蕩培養4 h，降溫至30 ℃并加入1 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）繼續誘導表達16 h。

1.3.3.2 發酵罐培養

挑取1 環新鮮斜面菌種接入含50 mL LB培養基的500 mL三角瓶中，加氨芐青霉素至終質量濃度為100 μg/mL，37 ℃、200 r/min條件下培養6 h，作為種子液。按5%接種量將種子液接入含3 L發酵培養基的5 L自控發酵罐中，初始轉速200 r/min，初始通氣流量為2 L/min，隨著菌體OD600nm值增加調節轉速與通氣流量，以維持溶氧值在20%以上，用25%氨水調節pH值穩定在7.0，37 ℃培養8 h加入誘導劑降溫至26 ℃進行蛋白表達，至酶活力不再增加時結束發酵。

1.3.4 發酵條件優化

1.3.4.1 誘導條件優化

改變IPTG濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L）、誘導時機（2、4、6、8、10 h）、誘導溫度（22、26、30、34、37 ℃），誘導時間（4、8、12、16、20 h）在搖床上進行單因素發酵試驗并檢測酶活力及OD600nm。以IPTG濃度、誘導時機、誘導溫度、誘導時間為變量，以PanD活力為指標，進行L9（34）正交試驗，確定最佳誘導條件。

1.3.4.2 碳源優化

在確定誘導條件的情況下，以20 g/L的比例，分別添加葡萄糖及甘油作為碳源，在搖床上進行發酵實驗并檢測酶活力、乙酸及OD600nm。

1.3.4.3 補料方式優化

采用優化后的誘導條件和最佳碳源，在5 L發酵罐上進行補料-分批發酵，待碳源耗盡后分別采用間歇流加、DO-stat、pH-stat方式流加補料培養基，發酵結束后取樣檢測酶活力、乙酸及OD600nm。全部測定數據均重復3次取平均值。

1.3.5 全細胞催化合成β-丙氨酸

配制100 g/L L-天冬氨酸溶液2 L，NaOH調節pH 7.0，加入濕菌體80 g（發酵結束后8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體），過程中自動流加2 mol/L HCl溶液控制pH值為7.0，溫度40 ℃，在5 L自控發酵罐上轉化10 h。

1.3.6 分析檢測

生長量測定：將菌液適當稀釋，在600 nm波長處測量其光密度，即OD600nm。

酶活力測定[20]：酶反應體系：pH 7.0、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液2.0 mL、發酵液0.1 mL、L-天冬氨酸（200 g/L）0.4 mL，用NaOH調節pH值使L-天冬氨酸溶解，反應1 h，按體積比1∶1加入10%三氯乙酸溶液，4 ℃放置終止反應，AccQ·Tag法[16]測酶活力，即使用Waters公司的AccQ·Fluor試劑盒柱前衍生HPLC檢測β-丙氨酸含量。酶活力定義：在pH 7.0、溫度37 ℃的條件下，每l h轉化生成1 μmol β-丙氨酸所需的酶量為1 個酶活力單位U。

L-天冬氨酸測定：使用Waters公司的AccQ·Fluor試劑盒柱前衍生HPLC檢測L-天冬氨酸含量。

乙酸測定：按文獻[26]方法。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 panD基因的克隆與重組菌構建

圖2 panD基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of panD gene PCR product

以B. tequilensis PanD37基因組DNA為模板，根據特基拉芽孢桿菌全基因組（LGRW01000001）中panD基因序列設計引物，進行PCR擴增，擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。經PCR擴增可得到400 bp左右條帶，無非特異性擴增，與預期大小相符。使用DNA凝膠回收試劑盒純化目標DNA片段。目的基因和pET32a（＋）經雙酶切，連接后得到重組質粒，然后全部轉化到E. coli BL21（DE3）宿主菌，獲得重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（＋）-panD。隨機挑取平板上的單個菌落，LB液體培養基（含100 μg/mL氨芐青霉素抗性）過夜富集培養。提取重組質粒，做質粒PCR驗證，瓊脂糖電泳檢測，panD基因序列大小約為400 bp，與預期基因相符。取該重組質粒送樣測序，測序結果表明，重組大腸桿菌構建成功，panD片段大小384 bp，提交NCBI數據庫獲得GenBank號：KY123117。

2.2 重組酶的表達與SDS-PAGE分析

圖3 重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（ ）-panD表達產物的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of protein expression in recombinant E. coli BL21(DE3) pET32a(+)-panD

取重組菌的胞內蛋白粗提液（發酵液離心獲菌體，超聲破碎后，取上清液）進行SDS-PAGE分析，由圖3可知，經IPTG誘導，重組大腸桿菌有目的蛋白的表達，目的蛋白大小約為12 kDa，略小于預期13.9 kDa，說明表達蛋白已完成自剪切形成丙酮酰基活性形式和β-亞基，β-亞基分子質量較小（小于2 kDa），電泳檢測不到。同時測得重組菌E. coli BL21（DE3）pET32a（＋）-panD的表達酶活力為78.3 U/mL，證明panD基因在E. coli BL21（DE3）成功異源表達。

2.3 誘導條件優化

2.3.1 單因素試驗優化誘導條件

表1 不同誘導條件下重組菌株搖瓶產酶的酶活力及菌體濃度變化Table 1 Enzymatic activity of PanD and cell growth in shake fl asks of recombinant E. coli under different induction conditions

在重組菌構建成功的基礎上，優化誘導條件提高PanD的表達量，結果發現IPTG濃度、誘導時機及誘導溫度對酶的合成有顯著影響。由表1可知，IPTG對菌體的生長有抑制作用，但外源蛋白的表達水平隨著誘導劑濃度的增加而不斷升高，當IPTG濃度達到0.5 mmol/L時酶活力達到最高值169.7 U/mL；若繼續提高濃度，對細胞生長產生毒性，蛋白表達水平會受到影響。分別在不同培養時間加入0.5 mmol/L的IPTG，同時降溫至30 ℃誘導培養，發現過早誘導加重菌體代謝負擔，不利于菌體生長，最終由于菌體生長量不足導致表達酶活力不高；誘導太晚，則菌體代謝開始降低，不利于外源蛋白的表達，在6～8 h誘導，此時菌體生長處于對數生長中期，代謝旺盛，外源蛋白也易于誘導表達。誘導后培養溫度對外源蛋白表達也非常重要，溫度過低，菌體生長緩慢，外源蛋白合成速率降低，表達酶活力不高；溫度過高，菌體生長速率過快，重組蛋白因錯誤折疊形成包涵體，最終酶活力也不高。培養至8 h時，加入0.5 mmol/L的IPTG在不同溫度下誘導酶的表達，結果顯示溫度在22～37 ℃變化時酶活力先上升后下降，并在溫度為26 ℃時達到最高189.9 U/mL，可見適度的低溫對外源蛋白的可溶性表達是有利的。試驗最后發現誘導時間也是影響酶表達的重要因素，誘導時間越長酶活力越高，16 h酶活力達到最高后繼續延長誘導時間酶活力反而下降。

2.3.2 誘導條件正交試驗優化

結合單因素試驗結果，以IPTG濃度、誘導時機、誘導溫度、誘導時間為因素，設計四因素三水平正交試驗，結果如表2所示，極差R值大小順序為：RA＞RC＞RB＞RD，說明IPTG濃度對PanD活力影響最大，其次是誘導溫度、誘導時機和誘導時間。k值分析結果顯示，4 個因素的最優組合為A2B2C2D3，即IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導時機8 h、誘導溫度26 ℃、誘導時間18 h。依據此組合進行發酵驗證，最終酶活力為191.3 U/mL，高于正交試驗中所有的組合，說明該組合確實為最佳誘導條件。

表2 誘導條件的正交試驗優化方案及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results of PanD activity for the optimization of induction conditions

2.4 碳源優化

表3 碳源對重組菌產PanD的影響Table 3 Effects of carbon sources on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

基因工程菌發酵過程中，培養基的組成既要有利于工程菌生長，又要保證外源蛋白有效表達。分別以20 g/L的葡萄糖、甘油作為碳源，在搖瓶中發酵產酶。由表3可知，相較于甘油，葡萄糖發酵過程中生成的乙酸遠高于甘油培養基，抑制了外源蛋白的表達，但菌體生長量卻顯著提升，更有利于高密度發酵，如能控制乙酸的生成，緩解對蛋白表達的抑制作用，葡萄糖仍是比較合適的高密度發酵碳源。控制總糖20 g/L，分別設葡萄糖初始質量濃度為5、10、15 g/L，余糖均等分為15 份，自培養1 h開始補入，每小時補入1 次，在15 h補完，設對照組（總糖一次性加入），在搖床上振蕩培養，結果（表4）顯示降低初始糖質量濃度基本不影響菌體生長，但酶活力隨初始糖質量濃度降低而顯著增加，當初始糖質量低至5 g/L時，酶活力為235.1 U/mL，是對照組的1.7 倍，且乙酸質量濃度被控制在較低水平，保證菌體生長量的同時克服了葡萄糖作碳源酶活力不高的缺點。

表4 初始糖質量濃度對重組菌產PanD的影響Table 4 Effects of initial glucose concentration on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

2.5 補料方式優化

表5 補料方式對重組菌產PanD的影響Table 5 Effects of feeding modes on the growth of recombinant E. coli and the yield of PanD

為進一步降低發酵過程中葡萄糖對外源蛋白表達的抑制作用，提高菌體生長量和酶活力，在5 L發酵罐上進行補料分批發酵，葡萄糖初始質量濃度設為5 g/L，當葡萄糖耗盡后分別采用間歇流加、DO-stat、pH-stat 3 種方式流加補料培養基，結果如表5所示，由于連續補充營養和發酵罐上環境條件的精準控制，3種方式的發酵結果均較搖瓶發酵有明顯提高，OD600nm和酶活力成倍數增加，乙酸生成量亦得到顯著控制，發酵結束時均低于1 g/L，其中尤以pH-stat方式補料發酵效果最好，酶活力提高至1 050.2 U/mL。

2.6 優化條件下重組菌高密度發酵

采用優化的發酵參數在5 L自控發酵罐上進行補料分批發酵。37 ℃培養8 h后降溫至26 ℃，加入0.5 mmol/L的IPTG誘導產酶，間隔2 h取樣測定OD600nm、酶活力及乙酸含量，結果如圖4所示，重組菌接入發酵培養基后約2 h進入對數生長期，迅速生長導致氧氣消耗加劇，應及時調節轉速及通氣量保證溶氧供給，在8 h降溫并添加誘導劑后，菌體經短暫調適后繼續保持增長，同時PanD在誘導劑作用下開啟表達開關，并以較高的效率穩步合成，在22 h時，OD600nm與酶活力均達到最高，分別為106.3和1 109.8 U/mL，較搖瓶發酵酶活力達到峰值的時間有所提前，繼續培養二者出現不同程度的衰減，應及時終止發酵。發酵過程中采用pH-stat流加補料有效控制葡萄糖質量濃度始終在5 g/L（數據未顯示）以下，減少了乙酸的生成，22 h時乙酸質量濃度僅為0.39 g/L，最大程度地保證了外源蛋白的高效表達。

圖4 最優條件下重組菌發酵生產PanD的過程曲線Fig. 4 Time courses of recombinant E. coli fermentation under the optimum conditions

2.7 全細胞催化合成β-丙氨酸

圖5 全細胞催化合成β-丙氨酸Fig. 5 Time course of β-alanine production with whole-cell broth

2 L轉化體系中加入200 g L-天冬氨酸，NaOH調節pH 7.0，升溫至40 ℃加入80 g濕菌體，轉化過程中L-天冬氨酸脫羧基釋放CO2導致pH值上升，流加2 mol/L鹽酸控制pH 7.0，反應10 h，結果如圖5所示，β-丙氨酸5 h前線性增加，尤其反應開始的1 h內比合成速率達到19.5 g/（L·h），7 h后酶活力逐漸衰減，合成速率下降，最終產量為66.4 g/L，物質的量轉化率為99.2%。

3 結 論

β-丙氨酸作為一種重要的醫藥和化工中間體，市場潛力巨大，針對目前化工合成法的缺點，微生物酶法生產β-丙氨酸顯示了良好的應用前景和替代方案，受限于現有研究菌株低活性的PanD，難以滿足低成本制造，尚難具備工業價值[27-28]。目前關于PanD的研究多集中于E. coli和C. glutamicum來源，且PanDC.g是截至目前PanD工程表達酶活力最高的菌株，鮮有關于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）PanD的研究成果，僅出現B. tequilensis與B. subtilis產PanD的零星報道[24-25]，所產PanD均具有較好的熱穩定性和酶學特性，但未見高活性B. subtilis PanD（PanDB.s）及應用方面的的研究成果。本研究以前期分離到的一株具有較高PanD生產能力的B. tequilensis基因組為模板克隆到panD，構建表達載體pET32a（＋）-panD，將質粒轉化入E.coli BL21（DE3），成功實現PanD在大腸桿菌中的異源表達。為提高重組菌的發酵水平，首先對該菌的誘導條件進行優化，確定了誘導劑的加量、最佳誘導時機及誘導溫度，酶活力得到有效提升。選擇重組菌發酵常用的兩種碳源葡萄糖和甘油進行優化實驗，發現葡萄糖有利于長菌，甘油有利于產酶，同時檢測發酵液中乙酸含量發現葡萄糖更易于積累乙酸抑制酶的表達，和其他重組菌發酵的報道是一致的[29-30]。通過降低葡萄糖初始質量濃度有效降低了乙酸生成量，在保證菌體生長量的同時獲得較高的表達水平，基于高密度發酵和生產成本考慮選擇葡萄糖作為發酵碳源。為進一步提高酶活力，采用3 種補料方式在發酵罐上進行補料分批發酵，發現pH-stat方式補料在滿足菌體營養的同時，有效避免了乙酸的生成，減輕對酶表達的抑制。采用優化條件在發酵罐上進行驗證實驗，由于采用了優化的誘導條件和有利于重組菌生長的葡萄糖作為碳源并進行pH-stat方式補料，控制葡萄糖質量濃度剛好滿足菌體生長和產酶需要，降低了乙酸生成量，發酵22 h，OD600nm已達到106.3，成功實現高密度培養，菌體量遠高于以往研究[16-23]，得益于菌體高密度生長酶活力亦達到1 109.8 U/mL，是目前報道的最高水平。采用全細胞催化100 g/L底物L-天冬氨酸僅需10 h，物質的量轉化率達99.2%，在酶法生產β-丙氨酸方面具有很大的可行性和應用前景。

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Heterologous Expression of the Bacillus tequilensis L-Aspartate α-Decarboxylase in Escherichia coli and Its High Cell Density Fermentation

FAN Xueping1, FENG Zhibin1,*, FANG Meifang1, ZHANG Juan2, CHEN Guozhong1, LI Lina1
(1. School of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025, China;2. School of Agriculture, Ludong University, Yantai 264025, China)

L-Aspartate α-decarboxylase is an important industrial enzyme which can stereo-selectively transform L-aspartate acid into β-alanine. In the present study, we cloned and expressed the L-aspartate α-decarboxylase gene (panD) from Bacillus tequilensis to construct an L-aspartate α-decarboxylase-producing Escherichia coli strain and optimized the culture conditions for high cell density fermentation. Using the genome of B. tequilensis PanD37 as template, the panD gene was amplified, and the recombinant plasmid pET32a(+)-panD was constructed and transformed into E. coli BL21(DE3) for expression. For high cell density growth and eff i cient L-aspartate α-decarboxylase expression, the optimum fermentation conditions in shake fl asks were determined as follows: a pH-stat fed-batch culture was performed using glucose as the carbon source at an initial concentration of 5 g/L; after 8 h of culture at 37 ℃, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to a fi nal concentration of 0.5 mmol/L as an inducer and the temperature was reduced to 26 ℃. Maximum L-aspartate α-decarboxylase activity of 1 109.8 U/mL and OD600nmvalue of 106.3 were obtained when the fermentation was carried out in a 5 L fermentor. Whole-cell catalysis of 100 g/L L-aspartate gave a molar conversion rate of 99.2% after 10 h of reaction. This work can provides a promising basis for further application of L-aspartate α-decarboxylase in industrial β-alanine production.

Bacillus tequilensis; Escherichia coli; L-aspartate α-decarboxylase; heterelogous expression; β-alanine

10.7506/spkx1002-6630-201802023

Q935

A

1002-6630（2018）02-0144-07

范雪萍, 馮志彬, 房美芳, 等. 特基拉芽孢桿菌L-天冬氨酸α-脫羧酶的異源表達及高密度發酵[J]. 食品科學, 2018, 39(2):144-150.

10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

FAN Xueping, FENG Zhibin, FANG Meifang, et al. Heterologous expression of the Bacillus tequilensis L-aspartate α-decarboxylase in Escherichia coli and its high cell density fermentation[J]. Food Science, 2018, 39(2): 144-150. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802023. http://www.spkx.net.cn

2017-02-24

山東省農業重大應用技術創新項目（魯財指2014-38）

范雪萍（1995—），女，學士，研究方向為生物工程。E-mail：xuepingFan95@163.com

*通信作者簡介：馮志彬（1977—），男，講師，碩士，研究方向為微生物發酵與酶催化。E-mail：zhibinfeng@126.com