真空包裝免泡豆桿優勢腐敗細菌分離鑒定及其致腐能力分析

鄭麗君，申光輝*，張志清，李辰鳳，陳安均，黎杉珊，吳賀君，羅松明

真空包裝免泡豆桿優勢腐敗細菌分離鑒定及其致腐能力分析

鄭麗君，申光輝*，張志清，李辰鳳，陳安均，黎杉珊，吳賀君，羅松明

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

以真空包裝免泡豆桿為研究對象，分離鑒定其中的腐敗細菌，并分析耐高溫優勢腐敗菌的腐敗能力，為產品質量控制提供參考。采用選擇性培養基對免泡豆桿中腐敗細菌進行分離純化，并測定菌株的耐高溫及產蛋白酶能力，通過形態、生理生化特征結合16S rRNA、gyrB基因序列分析對優勢腐敗細菌進行分類鑒定。將優勢腐敗菌接種到無菌免泡豆桿中，通過樣品感官評價、質構特性、揮發性鹽基氮值（TVB-N）、蛋白酶活力及pH值的分析，比較不同腐敗菌株對免泡豆桿的腐敗能力。從腐敗樣品中共分離獲得20 株不同的腐敗菌，其中有12 株可耐受110 ℃、20 min高溫處理，且具有較強的產蛋白酶能力。回接驗證實驗結果表明，接種4 株優勢耐高溫腐敗菌的免泡豆桿樣品，37 ℃貯藏至第7天發生明顯腐敗變質，樣品TVB-N、蛋白酶活力及pH值顯著高于未接菌對照樣品；此外，硬度、彈性、膠著性、耐咀性等產品質構特性也顯著低于對照樣品。4 株優勢腐敗菌均為芽孢桿菌，通過比較TVB-N產量因子確定腐敗能力最強的是解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）DY1a，其次依次分別為解淀粉芽孢桿菌DY1b，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）DY3和DY2a。

免泡豆桿；芽孢桿菌；gyrB基因；腐敗能力；質構特性

豆桿是我國四川隆昌、重慶梁平等地的一種傳統非發酵豆制品，也稱豆筋，豆棒。其中隆昌豆桿歷史悠久、品質優良，產品質地細膩，綿軟筋道，豆香濃郁，深受消費者喜愛，已被列為國家地理標志保護產品。傳統豆桿是將大豆經清洗浸泡、磨漿、過濾煮漿、起皮、裹棒成型，烘至半干，再次裹棒成型，最后干制而成的棒狀豆制品[1]。豆桿食用前需在常溫下復水4～6 h，耗時費力，極不方便，且不同水質對復水后的產品品質影響較大。近年來，企業為滿足消費者食用方便的需求，將傳統豆桿復水，真空包裝成免泡豆桿，開袋即烹即食，節約時間，更加方便消費者食用，消費市場潛力巨大。免泡豆桿中大豆蛋白、脂肪、糖類等營養成分豐富，且水分含量高，非常適宜腐敗微生物生長繁殖，因此免泡豆桿貨架期內極易發生腐敗脹袋，嚴重影響產品品質與食用安全。

目前國內外研究發現，由于大豆原料來源不同及加工生產環境狀況差異，傳統非發酵豆制品腐敗微生物種類及其多樣性差異較大。部分研究發現，芽孢桿菌是主要的腐敗微生物。如變質豆漿主要腐敗菌為地衣芽孢桿菌，短小芽孢桿菌和短芽孢桿菌[2]；豆腐干中主要腐敗菌為枯草芽孢桿菌[3]。另外研究結果發現，除芽孢桿菌外還有其他類群腐敗微生物。如內酯豆腐中的主要腐敗菌有堅強芽孢桿菌和屎腸球菌[4-5]，鹵水豆腐的主要腐敗菌為短小芽孢桿菌和惡臭假單胞菌[6]。研究還發現豆腐中存在發酵乳桿菌、梨形腸桿菌、腸膜明串珠菌等乳酸菌[7-8]。豆腐絲主要腐敗細菌有成團腸桿菌、短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌[9]；發現白干和薄百葉中主要腐敗菌除枯草芽孢桿菌外，還有溶酪葡萄球菌、約翰遜不動桿菌和戊糖片球菌[10]。豆腐干中腐敗菌除枯草芽孢桿菌，還有惡臭假單胞菌[11]。

本實驗主要對真空包裝免泡豆桿中優勢腐敗細菌進行分離鑒定，并比較分析耐高溫腐敗細菌對免泡豆桿的腐敗能力，確定優勢腐敗菌及其對豆桿質構特性品質的影響，為免泡豆桿的殺菌防腐工藝條件研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆桿由四川山古坊食品有限公司提供。

主要培養基[12]：LB液體培養基、PCA瓊脂培養基、VRBA瓊脂培養基、酪蛋白培養基、STAA瓊脂培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基、MSA培養基、氣單胞菌培養基（AMB）、錳鹽營養瓊脂 青島海博生物技術有限公司。

主要試劑：TIANamp Bateria DNA Kit（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；MasterMix Taq、Loading buffer、核酸染料 成都康迪生物技術有限公司；微生物生理生化鑒定管 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

CPA225D型電子天平 德國賽多利斯股份公司；FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；ECLIPSE E100型生物顯微鏡 日本Nikon公司；YXQ-LS-30SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司；MyCyclerTM Thermal Cycler PCR儀、Gel Doc XR＋凝膠成像分析儀 美國Bio-Rad公司；TA-XT Plus質構儀 英國Stable Micro公司。

1.3 方法

1.3.1 免泡豆桿腐敗細菌的分離純化

取腐敗免泡豆桿樣品（25±1）g，無菌條件下充分研磨后轉入加有225 mL 0.85%無菌生理鹽水的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用0.85%生理鹽水10倍梯度稀釋，選擇3 個稀釋梯度，各取1 mL梯度稀釋液，采用傾注法，利用不同選擇性培養基分離并統計各種培養基分離典型菌株的分離頻率。選擇3 批次樣品，每個批次隨機選取3 袋樣品進行分離。根據菌落的形狀、大小和顏色等形態特征，挑取不同選擇性培養基上單菌落進行純化，鏡檢，斜面保藏。菌落總數用PCA瓊脂培養基分離計數；葡萄球菌和微球菌（Micrococcaceae）用MSA瓊脂培養基分離計數；芽孢桿菌（Bacillus）用錳鹽營養瓊脂培養基分離計數；腸桿菌（Enterobacteriaceae）用VRBA瓊脂培養基分離計數；乳酸菌數用MRS瓊脂培養基進行統計；熱殺索絲菌用STAA瓊脂培養基分離計數；綠膿假單胞菌用CFC培養基分離計數；氣單胞菌用AMB培養基分離計數。其中熱殺索絲菌30 ℃培養，其他細菌37 ℃培養，培養時間均為48 h。

1.3.2 腐敗細菌耐高溫及其產蛋白酶能力測定

從分離純化菌株中篩選既能夠耐受110 ℃高溫處理，同時具有較強的產蛋白酶能力腐敗菌。

1.3.2.1 耐高溫能力測定

將分離菌株接種于無菌LB液體培養基中37 ℃培養12 h，調節菌懸液濃度為107～108CFU/mL，經110 ℃滅菌20 min處理后，取1 mL菌懸液，采用傾注法于37 ℃培養24 h計數，并采用微生物殘活率進行評價[14]，按公式（1）計算。

式中：lgS為高溫處理前后菌落總數降低的對數值；N0為高溫處理前菌懸液中的微生物濃度/（CFU/mL）；N為高溫處理后菌懸液中的微生物濃度/（CFU/mL）。

1.3.2.2 耐高溫腐敗菌產蛋白酶能力測定

將耐高溫菌株接種于酪蛋白平板，37 ℃培養24 h，分別測定產生的蛋白酶水解圈及菌落直徑，以水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）[15]初步確定菌株產蛋白酶活性的強弱。

1.3.3 耐高溫菌株腐敗能力測定

取干制豆桿用無菌水于20～23 ℃水溫下浸泡復水4 h，真空包裝后121 ℃高溫殺菌處理20 min，以獲得無菌供試豆桿。供試菌株接種于LB培養液37 ℃培養12 h，并用無菌水調整菌懸液濃度至106CFU/mL。將無菌豆桿置于供試菌株菌懸液中浸泡30 s，用無菌包裝袋真空包裝，即為接種處理免泡豆桿，以無菌水浸泡30 s并無菌真空包裝的豆桿為空白對照。所有樣品37 ℃貯藏至腐敗后，采集樣品進行感官評價，并測定質構特征參數、菌落總數及蛋白酶活力、揮發性鹽基氮、pH值等指標，以評價菌株對免泡豆桿的腐敗能力。

1.3.3.1 感官評價

本實驗感官評價采取100 分制，參考陳平等[16]對豆桿的感官評價方法，由感官評價小組共10 人按照表1的評分標準對實驗樣品進行評價。

表1 豆桿樣品感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Dougan

1.3.3.2 質構特征參數測定

采用物性測定儀，測定樣品的硬度、彈性、內聚性、膠著性、耐咀性、回復性等質構特征指標。每組樣品分別取3 塊，剪成2 cm×2 cm大小樣品測定，參考劉建偉等[18]方法并做修正，每塊樣品選擇5個不同位置測定。質構測定條件參數為：P5測試探頭，測前速率1 mm/s，測中速率0.5 mm/s，測后速率1 mm/s，應變60%，停留間隔5 s。

1.3.3.3 菌落總數及理化指標測定

參照GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[18]對樣品進行細菌菌落總數測定。參照GB 5009.228—2016《蛋白酶制劑》[19]進行蛋白酶活力測定，定義40 ℃每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為一個酶活單位（U）。參照GB/T 23527—2009《食品中揮發性鹽基氮的測定》[20]進行揮發性鹽基氮（TVB-N）測定。參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》[21]分別對樣品pH值進行測定。所有實驗均重復3 次。

1.3.3.4 耐高溫優勢腐敗菌腐敗能力的定量分析

以TVB-N產量因子Y（TVB-N/CFU）作為各優勢腐敗菌腐敗能力的定量指標[22]，腐敗菌的TVB-N產量因子計算方法見公式（2）。

1.3.4 耐高溫優勢腐敗菌分類鑒定

通過形態、生理生化并結合16S rRNA及gyrB基因序列對4 株優勢腐敗細菌進行分類鑒定。形態特征采用革蘭氏染色觀察法，生理生化特性利用試劑盒進行測定。

菌株基因組DNA提取：將待測菌株分別使用LB液體培養基37 ℃、140 r/min振蕩培養24 h獲得新鮮細胞懸浮液，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。

1 6 S r R N A擴增采用細菌通用引物：2 7 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）[23]。PCR反應體系為：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，補水至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個循環，72 ℃延伸10 min。

gyrB基因擴增采用簡并引物，UP1s（5’-GA A G T C A T C A T G A C C G T T C T G C A Y G C N G G N GGNAARTTYGA-3’），UP2rs（5’-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCR TCNGTAT-3’）[24]。PCR反應體系：Master mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL，補水至25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環，72 ℃延伸10 min[25]。

擴增產物經1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定擴增片段長度與目的片段長度相同、無雜帶后送成都擎科梓熙生物技術有限公司進行純化并測序，將測序結果提交到NCBI數據庫進行基因序列同源性BLAST搜索比對，選擇相似度較高的模式菌株序列，用Clustalx 1.83與MEGA 5.1軟件，采用NJ法構建菌株系統發育樹。

1.4 數據處理

實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行顯著性檢驗與多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 免泡豆桿中腐敗細菌的分離

從MSA、STAA、AMB、CFC、錳鹽選擇性培養基中，共分離出20 株菌（表2）。葡萄球菌、微球菌與熱索絲細菌分離頻率較低（0.01%），錳鹽培養基上芽孢桿菌分離頻率可達98.04%，其菌數對數值可達6.85～7.70（lg（CFU/g）），顯著高于其他細菌數量。第1批樣品中分離出了DY1a、DY1b兩株芽孢桿菌；第2批樣品中分離出了DY2a、DY2b、DY2c、DY2d四株芽孢桿菌；第3批樣品里分離到1株芽孢桿菌DY3。假單胞菌數最多可達5.5（lg（CFU/g）），第3批樣品里分離得到兩株假單胞菌DC3a、DC3b。氣單胞菌數量波動較大，有1～2 個數量級差距。3 個批次樣品中細菌種類相同，僅在數量上有所差異。

2.2 腐敗細菌耐高溫與產蛋白酶能力

2.2.1 腐敗細菌耐高溫能力

真空包裝免泡豆桿生產上采用90～100 ℃、30 min殺菌處理，仍有產品脹袋腐敗現象發生。因此，本研究從分離獲得的菌株篩選可耐受110 ℃高溫的耐高溫菌株。由表3可見，菌株DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DM3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY2d、DY3能耐受110 ℃、20 min的高溫處理。

表3 耐高溫細菌菌株殘活率及其產蛋白酶能力Table 3 Residual rate and protease-producing capacity of the heat-resistant strains

2.2.2 耐高溫腐敗細菌產蛋白酶能力

采用酪蛋白平板法對可耐受110 ℃、20 min的菌株產蛋白酶能力進行測定，采用蛋白水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）來評價腐敗細菌產蛋白酶能力，結果見表3。菌株DS2、DY3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2d的HC值均高于2，菌株DY1a的HC值最高為3.15；其余菌株產蛋白酶能力相對較弱。

2.3 耐高溫優勢細菌腐敗能力分析

2.3.1 感官評價

通過對菌株耐熱處理和產酶能力，確定12 株耐高溫優勢細菌進行回接處理，驗證其腐敗能力。

接種菌株后發生腐敗的免泡豆桿感官評價結果見表4。通過觀察比較，在37 ℃貯藏至第7天時，接種DY1a、DY1b、DY3、DY2a、DS1樣品色澤暗淡，質地變軟，表面出現黏液和不愉快刺激氣味等腐敗現象，已達到感官無法接受的程度，感官評分低于50 分；其余樣品也開始出現不同程度腐敗現象。

表4 接種腐敗細菌豆桿貯藏7 d后的感官評價結果Table 4 Sensory evaluation of Dougan inoculated with the 12 heat-resistant isolates after storage at 37 ℃ for 7 days

2.3.2 質構特征參數

表5 接種腐敗細菌豆桿貯藏7 d后的質構特性Table 5 In fl uence of inoculation with the heat-resistant isolates on textural parameters of Dougan stored at 37 ℃ for 7 days

由表5可見，與對照組比較，接種DY1a、DY1b、DY2a、DY3菌株的樣品硬度顯著降低，均在815 g以下，表明接種微生物樣品的空間結構發生了較大變化；與對照樣品相比，接種DY1a、DY2a菌株的樣品彈性值均降低，但與對照差異不顯著；除DY1a、DY3的內聚性低于0.60外，其余都在其之上，樣品腐敗程度與內聚性無顯著相關性。空白樣品的膠著性為858.73 g，而接種DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的樣品膠著性值分別為610.56、729.96、632.58、474.99、592.60 g，均顯著低于空白組，表明豆桿腐敗后膠著性降低。同樣，接種DA2、DS1、DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的樣品耐咀性低于空白組，表明腐敗導致耐咀性的降低。樣品回復性值介于0.13～0.31之間，差異不顯著。腐敗程度越高，其硬度、彈性、膠著性、耐咀性越低，可以看出DY1a、DY1b、DY2a、DY3腐敗較嚴重。

2.3.3 菌落總數

表6 接種腐敗細菌豆桿貯藏7 d后的菌落對數值、TVB-N、蛋白酶活力、pH值Table 6 Colony counts, TVB-N, protease activity and pH of Dougan inoculated with the heat-resistant isolates and stored at 37 ℃ for 7 days

對發生腐敗的樣品進行細菌總數計數，由表6可知，空白對照豆桿樣品菌落總數對數值為5.86，表明樣品仍殘存有耐高溫細菌，如耐熱芽孢桿菌。而接種腐敗細菌樣品菌落總數對數值均大于7.0，其中DY3、DY1a、DY1b三株菌株的菌落總數對數值相對較高，分別為9.60、9.48、9.41，表明這3 株菌在免泡豆桿中的生長繁殖速度相對較快，是產品腐敗點的優勢菌，更易導致產品腐敗發生。

2.3.4 TVB-N

TVB-N主要是由于腐敗菌分泌一系列胞外酶，從而引起脫氨、脫羧作用，導致蛋白質分解而形成的產物。在富含蛋白質的免泡豆桿中，TVB-N對產品腐敗程度具有重要指示意義。由表6可見，對照組樣品TVB-N為10.14 mg/100 g，除了DS1樣品外其他數值均高于對照組，即表明實驗樣品已發生不同程度腐敗。接種DY1a、DY1b、DY2a、DY2d、DY3的樣品TVB-N均超過30 mg/100 g，即已發生腐敗的嚴重程度高于其他菌株。其中接種菌株DY1a的豆桿樣品TVB-N值最高，其次分別是DY1b、DY2a、DY3，結果與樣品感官評價基本一致。

2.3.5 蛋白酶活力

由表6可知，除了DA1、DM3外，其他接種豆桿樣品均有較高的蛋白酶活力。其中接種DY1a豆桿樣品蛋白酶最高，為926.21 U/g。其次依次是接種DY1b、DY3、DY2a、DS2、DA2、DY2c、DA1豆桿樣品。樣品蛋白酶活力越高，表明該菌株對豆桿大豆蛋白的分解能力越強，腐敗程度越高。

2.3.6 pH值

由表6可知，除了DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY3，其他腐敗樣品的pH值均低于空白對照組。說明接種了以上菌株的腐敗樣品中蛋白質被微生物分泌的蛋白酶類分解，產生的氨和胺類等堿性含氮物，使樣品pH值升高[27]。部分菌株接種樣品pH值低于未接種對照樣品，是與糖類等營養物質被菌株分解代謝產生有機酸，導致pH值降低有關[28]。

2.3.7 耐高溫優勢腐敗菌致腐能力比較

表7 4 株耐高溫優勢腐敗細菌TVB-N產量因子Table 7 Yield factors of TVB-N of four heat-resistant spoilage strains

由表7可知，4株腐敗菌腐敗能力大小依次為DY1a＞DY1b＞DY3＞DY2a，與感官評價結果一致。菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3為免泡豆桿的耐高溫優勢腐敗菌。

2.4 腐敗細菌鑒定

2.4.1 形態特征與生理生化特性

菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3在PCA平板上37 ℃培養24 h后，菌落均呈圓形或橢圓形，邊緣不規則，液體靜置培養有菌膜產生。菌株DY1a（圖1A）、DY1b（圖1B）菌落乳白色不透明，表面干燥；菌株DY2a（圖1C）、DY3（圖1D）菌落透明，外層有透明圈，表面光滑濕潤。4 株菌菌體細胞分別呈長桿和短桿狀，革蘭氏染色陽性（圖1E～圖1H）。

圖1 4 株耐高溫腐敗細菌形態特征Fig. 1 Colonial morphology and micrograph of four heat-resistant spoilage bacterial strains

表8 4 株耐高溫腐敗細菌生理生化特性Table 8 Physiological and biochemical characteristics of four heat-resistant spoilage strains

由表8可知，4 株腐敗細菌均可利用葡萄糖、側金盞醇、木糖、棉子糖，分解尿素；靛基質、葡萄糖酸鹽、賴氨酸、鳥氨酸實驗結果呈陽性；MR、VP、苯丙氨酸、硫化氫實驗結果呈陰性。菌株DY1a、DY1b不能利用山梨醇，菌株DY1a、DY2a不能利用枸櫞酸鹽。

2.4.2 16S rRNA序列分析

分別以腐敗菌株的基因組DNA模板擴增16S rRNA的DNA片段，擴增到大小約1 500 bp的PCR特征性條帶。4 株優勢腐敗菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的16S rRNA測序結果長度分別為1 354、1 425、1 378 bp和1 398 bp。4 株菌與芽孢桿菌屬多個近緣種的16S rRNA基因相似性均在99%以上，其中菌株DY1a的16S rRNA（GenBank登錄號：KY290587）與暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis KCTC 13613）、死亡谷芽孢桿菌（B. vallismortis DSM 11031）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens NBRC 15535）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus NBRC 15539）相似性分別為99.85%、99.85%、99.78%、99.63%、99.56%；菌株DY1b的16S rRNA（GenBank登錄號：KY290588）與上述對比菌株序列相似性分別為99.44%、99.23%、99.16%、99.44%、99.23%。菌株DY2a的16S rRNA（GenBank登錄號：KY290589）與枯草芽孢桿菌（B. subtilis subsp. subtilis str.168）、莫哈韋芽孢桿菌（B.mojavensis NBRC 15718）、B. axarquiensis LMG 22476、B. malacitensis CR-95相似性分別為99.93%、99.71%、99.57%、99.71%；菌株DY3的16S rRNA（GenBank登錄號：KY290590）與上述菌株序列相似性分別為100%、99.78%、99.71%、99.78%、99.63%。

圖2 基于16S rRNA 序列的4 株腐敗細菌系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，菌株DY1a、DY1b與暹羅芽孢桿菌、死亡谷芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均在同一分支；菌株DY2a、DY3與枯草芽孢桿菌、莫哈韋芽孢桿菌、B. axarquiensis、B. malacitensis聚在同一分支。細菌16S rRNA序列分析是目前確定細菌分類地位的常用分子生物學手段。由于16S rRNA的高度保守性，對相似率極高的近緣種（如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬等）只能做到屬水平上的鑒定，無法進行不同種的有效聚類區分[29-30]。本研究利用16S rRNA序列測序結果構建菌株系統發育樹，發現其與芽孢桿菌屬的多個種相似度均在99%以上，且聚在16S rRNA系統發育樹的同一分支，并不能與其他種的模式菌株明顯區分開，因此采用16S rRNA序列并不能將4 株腐敗芽孢桿菌準確鑒定到種，不少研究者也得出了相同結論[25-26]。

2.4.3 gyrB基因序列分析

將4 個菌株的基因組DNA為模板擴增gyrB的DNA片段，擴增到大小約1 200 bp的PCR特征性條帶。4 株優勢腐敗菌DY1a、DY1b、DY2a和DY3的gyrB基因測序結果長度分別為1 155、1 155、1 158 bp和1 152 bp。由圖3可知，菌株DY1a（GenBank登錄號：KY315725）、DY1b（GenBank登錄號：KY315726）與解淀粉芽孢桿菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性為100%；菌株DY2a（GenBank登錄號：KY315727）、DY3（GenBank登錄號：KY315728）和枯草芽孢桿菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性為100%。故將菌株DY1a、DY1b鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株DY2a、DY3為枯草芽孢桿菌。通過16S rRNA序列很難鑒別出芽孢桿菌的近緣種，gyrB基因是編碼細菌DNA促旋酶B亞基（gyrB）的基因，進化速率較16S rRNA基因快，構建的系統發育樹分辨率更高，可用于芽孢桿菌屬內近緣種的分類鑒定[25-26]。通過gyrB基因序列分析能區分出枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），并將4 株腐敗芽孢桿菌準確鑒定到種。

圖3 基于gyrB基因序列的4 株腐敗細菌系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of four spoilage bacterial strains based on gyrB sequences

3 討 論

豆桿是川渝地區一種傳統腐竹類非發酵豆制品，目前對其腐敗微生物的分離鑒定及其腐敗能力的研究鮮見報道。本實驗采用選擇性培養基從四川隆昌免泡豆桿腐敗樣品中分離純化到20 株細菌，其中12 株能夠耐受110 ℃、20 min高溫處理，且產蛋白酶能力較強。將其接種到無菌免泡豆桿中進行腐敗能力分析比較，結果表明導致豆桿發生嚴重腐敗的4 株優勢腐敗菌均為芽孢桿菌。目前國內外研究結果表明，耐熱性芽孢細菌是非發酵豆制品主要腐敗菌，主要來源于加工原料[9-10]。此外在各類腐敗樣品中還存在成團腸桿菌、溶酪葡萄球菌、戊糖片球菌等非耐熱細菌[4-11]，由于豆制品加工過程高溫煮漿會將大部分非耐熱菌殺死，而這類細菌主要來源于生產、包裝、儲藏等環節的二次污染[10]，只要嚴格保證生產各環節環境衛生和工藝要求，基本上可避免非耐熱菌導致的腐敗現象。而來自原料的耐熱性芽孢桿菌在常規殺菌條件下很難將其徹底殺死，而采用較強的殺菌條件雖能減少耐熱腐敗菌的殘留，但會對產品質構帶來嚴重破壞，影響感官品質。因此耐熱性芽孢類腐敗菌的殺菌控制是保證免泡豆桿貯藏品質與安全的關鍵點和難點。目前控制豆制品微生物污染方法主要有高熱殺菌和化學防腐劑處理，考慮維持產品口感與營養成分，應結合非熱殺菌技術進行處理來控制其中的耐熱芽孢類細菌。

隆昌豆桿以其筋道細膩的口感深受消費者歡迎。豆制品貯藏過程不僅會發生主要營養物質成分的變化，還會導致產品質構特性變化，喪失原有產品良好的口感，感官品質下降[28]。本研究在感官評價結果基礎上，對接種腐敗菌豆桿樣品的質構特性測定結果表明，主要腐敗菌導致豆桿硬度、彈性、膠著性、耐咀性等顯著降低，與感官評價中發現樣品硬度降低、彈性下降，黏度增加等腐敗現象及程度相符，表明產品硬度、彈性、膠著性和耐咀性與免泡豆桿腐敗后感官品質存在一定的相關性，可與主觀感官評價手段相結合評價免泡豆桿品質的優劣。

4 結 論

導致免泡豆桿腐敗變質的優勢腐敗細菌均為芽孢桿菌屬，包括2 株解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和2 株枯草芽孢桿菌（B. subtilis）。4 株腐敗芽孢桿菌均具有較強的耐高溫和產蛋白酶能力，可引起免泡豆桿TVB-N和pH值升高，導致產品硬度、彈性、膠著性、耐咀性降低，其中解淀粉芽孢桿菌DY1a對免泡豆桿腐敗能力最強。

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Isolation, Identif i cation and Evaluation of Dominant Spoilage Bacteria from Vacuum-Packaged Nonrehydrated Dougan, a Chinese Traditional Rod-Shaped Soybean Product Prepared with Protein-Lipid Film

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui*, ZHANG Zhiqing, LI Chenfeng, CHEN Anjun, LI Shanshan, WU Hejun, LUO Songming
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The purpose of this study was to isolate and identify the bacteria responsible for spoilage of vacuum-packaged nonrehydrated Dougan (a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm) and to evaluate the spoilage potential of the heat-resistant bacteria. The bacteria were isolated using various selective media. The dominant spoilage bacteria were identif i ed by morphological observation, physiological and biochemical characterization, and 16S rRNA and gyrB gene sequence analysis. The heat-resistant spoilage bacteria with higher protease-producing capacity were inoculated into sterilized Dougan to evaluate the spoilage potential according to the sensory quality, textural properties,total volatile basic nitrogen (TVB-N) content, protease activity and pH of Dougan. A total of 20 bacterial strains were isolated from spoiled nonrehydrated Dougan, and among these isolates, 12 strains with higher protease-producing capacity could survive autoclaving at 110 ℃ for 20 min. The Dougan inoculated with strains DY1a, DY1b, DY2a and DY3 showed obvious signs of spoilage after storage at 37 ℃ for 7 days. The TVB-N, protease activity and pH value of the inoculated samples were signif i cantly higher than those of the non-inoculated control. Texture prof i le analysis indicated that hardness, springiness, gumminess and chewiness of the inoculated sample decreased significantly compared with control samples. All four specif i c spoilage bacteria belonged to the Bacillus genus. According to the TVB-N yield factors(Y (TVB-N/CFU) values), the spoilage potential of B. amyloliquefaciens DY1a was the strongest among the spoilage bacteria isolated, followed subsequently by B. amyloliquefaciens DY1b, B. subtilis DY2a and B. subtilis DY3.

nonrehydrated Dougan; Bacillus spp.; gyrB gene; spoilage capability; textural properties

10.7506/spkx1002-6630-201802028

TS254.4

A

1002-6630（2018）02-0177-08

2017-02-14

四川農業大學校企合作項目（060H0301）；四川省教育廳川菜發展研究中心重點規劃項目（CC2017Z01）；

四川農業大學“雙支計劃”項目（03572107）

鄭麗君（1993—），女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：ZhengLiJJJ@163.com

*通信作者簡介：申光輝（1985—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：shenghuishen@163.com

鄭麗君, 申光輝, 張志清, 等. 真空包裝免泡豆桿優勢腐敗細菌分離鑒定及其致腐能力分析[J]. 食品科學, 2018, 39(2):177-184.

10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Lijun, SHEN Guanghui, ZHANG Zhiqing, et al. Isolation, identification and evaluation of dominant spoilage bacteria from vacuum-packaged nonrehydrated Dougan, a Chinese traditional rod-shaped soybean product prepared with protein-lipid fi lm[J]. Food Science, 2018, 39(2): 177-184. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802028. http://www.spkx.net.cn