耐受性枯草芽孢桿菌的脈沖強光誘變篩選及產酶活力分析

趙天惠，張佰清*

耐受性枯草芽孢桿菌的脈沖強光誘變篩選及產酶活力分析

趙天惠，張佰清*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

采用脈沖強光對枯草芽孢桿菌進行誘變處理，通過耐受性測試，在抗性菌株中篩選出優良耐受菌株，并與原始菌株對比分析產酶活力及遺傳穩定性，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較分析菌體蛋白質表達的差異。結果表明，在脈沖電壓2 450 V，照射距離5 cm，脈沖40 次條件下，篩選出8 株抗性菌株；經初篩和復篩得到兼具高溫耐受、強酸耐受和高濃度膽鹽耐受性變異菌株B3和B7，產α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力分別比原始菌株提高了67%和77%（P＜0.01）、56%和71%（P＜0.01）、34%和42%（P＜0.05），變異菌株產酶穩定性較高（P＞0.05），可遺傳變異；誘變前后菌體蛋白表達出現差異；結果證明脈沖強光用于枯草芽孢桿菌的誘變具有可行性。

耐受性；枯草芽孢桿菌；脈沖強光；誘變篩選；產酶活力

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是工業生產中重要的食品級益生菌，在發酵食品方面具有悠久歷史[1-2]。人工誘變篩選出的優良枯草芽孢桿菌可以在加工貯藏中更好地耐受不良環境影響仍保持高活性，而且其發酵產酶水平高，因此誘變篩選優良菌株已然成為研究熱點。常見的誘變方法（如化學誘變和紫外誘變等）對菌株的篩選均存在一定缺陷[3-5]，因此，探索新型物理方法應用于枯草芽孢桿菌誘變育種已成為當前生產中急待解決的問題。近年來，國外Cregenzán-Alberti等[6]利用高溫脈沖電場誘變處理枯草芽孢桿菌內生孢子，得到的突變株在123 ℃條件下更具耐熱性；Ma Yingfang等[7]利用常壓室溫等離子體誘變篩選高產重組蛋白枯草芽孢桿菌突變株，獲得的突變株WB600 mut-12#重組α-淀粉酶活力較野生菌株提高了35%。

脈沖強光誘變裝置利用瞬間放電以脈沖的形式激發燈管中的惰性氣體，發出與太陽光譜相近、強烈的閃光[8]，進行誘變微生物。經脈沖強光處理過的菌體核酸結構受到影響，而細胞中的DNA修復機制不發生作用，因此該方法可以誘導微生物發生變異[9-10]。目前，國內張佰清[11]、趙春燕等[12]利用脈沖強光對啤酒酵母、乳酸乳球菌進行誘變處理，使菌株發酵性能有所提高。國外有人研究發現，脈沖強光會改變菌體細胞內蛋白質結構，從而引起細胞變異[13-14]，并且證明，脈沖強光誘變微生物具有處理時間短、污染小、操作容易控制等優點，具有可行性。

本研究利用脈沖強光誘變篩選出具有良好耐高溫、耐強酸、耐膽鹽性的枯草芽孢桿菌株B3和B7，其產酶能力也高于原始菌株，該優良性狀能夠穩定遺傳，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析得出誘變前后菌體蛋白表達出現差異，證明了脈沖強光對枯草芽孢桿菌的誘變具有可行性，為工業微生物誘變育種開辟了新的途徑，對促進酶制劑工業的發展具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

枯草芽孢桿菌（B. subtilis）由沈陽農業大學土地與環境學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

脈沖強光裝置（脈沖寬度為2 0 μ s，波長為200～1 100 nm，輸出最大電壓為5 000 V，輸入最大能量為644 J）由沈陽農業大學食品學院自行設計。HZQ-F160A恒溫振蕩器、PHS-3C型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱手提式高壓蒸汽消毒鍋 上海三申醫療器械有限公司；紫外-可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司；3K15型離心機 美國Sigma公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋、旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-28A型垂直板電泳槽、DYY-8C型電泳儀電源 北京六一生物科技有限公司；Spectrophotometer1510酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

牛肉膏蛋白胨培養基、淀粉平板培養基、酪蛋白平板培養基參照郝林[15]的方法配制。三丁酸甘油脂平板培養基參照郭威[16]的方法配制。

發酵培養基：α-淀粉酶發酵培養基（1 L）：可溶性淀粉12 g、蛋白胨8 g、牛肉膏2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、pH 7.2；蛋白酶發酵培養基（1 L）：可溶性淀粉5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、KH2PO40.3 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、pH 7.2；脂肪酶發酵培養基（1 L）：蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、(NH4)2SO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、橄欖油1.0 mL、pH 7.2。

1.3.2 菌株活化和菌懸液的制備

將枯草芽孢桿菌接種到固體斜面培養基上，放入恒溫箱中于32 ℃培養24 h，即得到活化菌株。取活化好的菌株2環接種于裝有牛肉膏蛋白胨液體培養基（30 mL/250 mL三角瓶）中，32 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養12 h，形成種子液。取2 mL種子液轉接到另一個液體培養基（10 mL/100 mL三角瓶）中，相同條件下，培養6 h后形成處于對數生長期的培養液，配成濃度為106個/mL的菌懸液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.3 脈沖強光處理方法與誘變參數的確定

在無菌環境下，將放置在培養皿中的菌懸液放入脈沖裝置處理室，使培養皿與氙燈垂直，進行脈沖強光處理。在預備實驗的基礎上，設定脈沖電壓為2 450 V，照射距離為5 cm，脈沖次數分別為8、14、21、27、34、40 次和47 次。分別取出經脈沖強光處理后的菌懸液稀釋至10-3個/mL，取0.1 mL涂布于固體平板培養基上，未處理的稀釋菌懸液為對照，32 ℃暗處倒置培養36 h，利用平板菌落計數法測定菌落總數，計算不同處理條件下菌株的致死率，見公式（1）：

1.3.4 菌株的抗性篩選

通常認為脈沖強光誘變時，菌株致死率達到90%以上，菌株具有抗性，最容易發生變異[11,17]。從脈沖強光處理后第1～5代致死率均達到90%以上的菌株中挑選菌落呈圓形或橢圓形，呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皺，中央突起的抗性菌株8 株，接種至固體斜面培養基上備用。

1.3.5 菌株初篩

將供初篩的抗性菌株活化24 h后，分別對其進行耐受性測試[18-19]，以菌株耐受效果作為初篩標準。

1.3.6 菌株復篩

將初篩得到的菌株活化24 h后配制成菌懸液，吸取0.1 mL菌懸液，分別均勻涂布于淀粉平板培養基、酪蛋白平板培養基上，32 ℃倒置培養48 h，測量單菌落周圍形成透明水解圈直徑與菌落直徑的比值，與原始菌株相比，比值增加10%以上的菌株初步認為其發生了正突變，挑取至斜面保存[20]。產α-淀粉酶菌株的篩選方法參照游玟娟[21]的方法；產蛋白酶菌株的篩選方法參照Philip[22]的方法；產脂肪酶菌株的篩選方法參照郭威[16]的方法，分別測量直徑比值A/a、P/p與Z/z。1.3.7 酶活力測定

1.3.7.1 粗酶液的制備

將復篩得到的菌株制成培養液，按照5%接種量分別接入50 mL液體α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶發酵培養基中，于32 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養48 h，得到發酵液。將發酵液于8 000 r/min離心10 min，棄菌體沉淀取上清液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.7.2 發酵產α-淀粉酶活力的測定

參照Yoo[23]改良法：在可溶性淀粉溶液中加入粗酶液（稀釋10倍），55 ℃保溫反應10 min，冷卻后加入稀硫酸終止反應，加入稀碘液，顯色20 min，660 nm波長處測定吸光度。以蒸餾水作空白，以煮沸失活的粗酶液為對照。酶活力單位定義為1 mL酶液在55 ℃、pH 6.0條件下，10 min內水解1 mg可溶性淀粉所需的酶量為一個酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據公式（2）計算：

式中：E0、E分別為對照和反應液的吸光度；100為系數；稀釋倍數為10。

1.3.7.3 發酵產蛋白酶活力的測定

L-酪氨酸標準曲線的繪制：配制質量濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的L-酪氨酸標準溶液，用分光光度計分別測定其吸光度OD680nm。以吸光度為縱坐標，L-酪氨酸的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

蛋白酶活力的測定方法：采用福林-酚法[24]。在酪蛋白溶液中加入粗酶液（稀釋10倍），40 ℃保溫反應10 min，加入三氯乙酸溶液，離心，取上清液，加入碳酸鈉溶液和福林-酚試劑使用液，顯色20 min，測定OD680nm值。測定空白對照時，先加三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液。酶活力單位定義為1 mL酶液在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min內水解干酪素產生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據公式（3）計算：

式中：A為樣品OD值（查標準曲線可得相對應的酪氨酸質量/μg）；4為反應試劑總體積/mL；10為反應時間/min；N為粗酶液的稀釋倍數。

1.3.7.4 發酵產脂肪酶活力的測定

采用橄欖油乳化法[25]。向底物溶液和磷酸緩沖液中加入待測粗酶液，40 ℃恒溫反應15 min，加入乙醇終止反應，加入酚酞指示劑，加入NaOH標準溶液，滴定至出現微紅色并保持30 s不褪色。測定空白對照時，先加乙醇溶液，后加待測粗酶液。酶活力單位定義為1 mL酶液于40 ℃，pH 7.5的條件下，每分鐘水解脂肪產生1 μmol脂肪酸所需的酶量為一個酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據公式（4）計算：

式中：V為樣品消耗的NaOH 標準溶液的體積/mL；V0為空白消耗的NaOH標準溶液體積/mL；c為NaOH標準溶液的濃度/（mol/L）；N為粗酶液的稀釋倍數，取值為10；t為反應時間15 min。

1.3.8 菌株發酵產酶穩定性的分析

變異菌株進行遺傳穩定性實驗，將其接種到斜面上連續傳代培養5 代，每代均接種到3 種酶的發酵培養基上進行發酵產酶實驗，測定各代的α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力。

1.3.9 菌株SDS-PAGE分析

參照石坡[26]的方法制備電泳蛋白樣品；采用考馬斯亮藍G-250法測定菌體蛋白濃度，繪制蛋白濃度標準曲線，測定吸光度以計算蛋白濃度；配制電泳溶液和緩沖溶液，進行SDS-PAGE，在考馬斯亮藍染色的凝膠中觀察分離的蛋白條帶。

1.4 數據處理

采用SPSS Version 17.0軟件進行數據統計分析。數據均以 ±s表示（n=3）。

2 結果與分析

2.1 誘變參數的確定結果

菌株在脈沖電壓為2 450 V，照射距離為5 cm，脈沖次數分別為0、8、14、21、27、34、40 次和47次的處理后，菌株致死效果如圖1所示。

圖1 脈沖次數對菌株致死效果的影響Fig. 1 Effect of pulse number on mortality

由圖1可知，菌株的致死率隨脈沖次數增加而增大。當脈沖21 次時，致死率為76.4%；當脈沖40 次時，致死率達到92.5%；當脈沖次數大于47 次時，菌株幾乎全部死亡。因此，選取菌株致死率高于90%并保證有一定數量存活菌株的誘變參數，此時菌株具有抗性，最容易發生變異，即選擇脈沖電壓2 450 V，照射距離5 cm，脈沖40 次，誘變效果良好。

2.2 抗性篩選結果

表1 枯草芽孢桿菌對脈沖強光的抗性篩選結果Table 1 Resistance of Bacillus subtilis to pulsed light

根據上述誘變參數處理菌株，選取存活菌種進行斜面培養基試管培養，反復處理至第5代，該菌株第1代到第5代的致死率均在90%以上，差異不顯著（P＞0.05），表現出一定的抗性。因此，從第5代存活的菌種進行篩選，得到編號分別為B1～B8的8 株菌株，并接種到斜面培養基試管中冷藏保存備用。

2.3 初篩結果

2.3.1 高溫耐受性菌株篩選

枯草芽孢桿菌屬于益生菌，通常被制成微生物飼料添加劑，飼料加工過程中的高溫處理對菌種的存活率有影響，從而制約了動物對飼料營養的吸收利用。分別將原始菌株B0和B1～B8抗性菌株經60、70、80、90 ℃水浴處理10 min，菌株存活率在80%以上作為篩選指標。

圖2 溫度對菌株存活率的影響Fig. 2 Effect of temperature on survival rate of the original and mutant strains

由圖2可知，抗性菌株B1、B3、B4、B5、B7、B8的存活率均高于原始菌株B0，大部分均在80%以上；B2、B6的耐高溫能力較差，當溫度達到90 ℃時，菌株存活率未達到80%，與原始菌株B0差異不顯著（P＞0.05）。因此，從8 株抗性菌株中篩選出B1、B3、B4、B5、B7、B8六株耐高溫性的菌株進行下一步實驗。

2.3.2 強酸耐受性菌株篩選

益生菌進入動物體內須經過胃酸環境才能到達腸道發揮作用，因此益生菌必須具有良好的耐酸能力。分別對原始菌株B0和B1、B3、B4、B5、B7、B8抗性菌株在pH 2、pH 3和pH 4的人工胃液中37 ℃作用3 h，以存活率不低于60%作為篩選標準。

圖3 人工胃液對菌株存活率的影響Fig. 3 Survival rate of the original and mutant strains in different artif i cial gastric juices

由圖3可知，抗性菌株B1、B3、B4和B7在3 個pH值梯度的人工胃液中的存活率均高于原始菌株B0，都高于60%；B5、B8在pH 2環境中存活率低于60%，且B8存活率顯著低于B0（P＜0.05）。因此，篩選得到B1、B3、B4和B7這4 株菌株繼續實驗。

2.3.3 膽鹽耐受性菌株的篩選

十二指腸中的膽汁酸鹽對益生菌具有抑制作用，菌體只有具備較高的膽鹽耐受性，才能保持足夠的活菌數，從而發揮益生作用。分別對原始菌株B0和B1、B3、B4、B7四株抗性菌株在膽鹽質量濃度為0.1、0.2 g/100 mL和0.3 g/100 mL中處理180 min，篩選指標設定為存活率超過70%。

圖4 膽鹽對菌株存活率的影響Fig. 4 Effect of bile salt concentration on survival rate

由圖4可知，抗性菌株B3、B4和B7在不同膽鹽質量濃度中的存活率均高于原始菌株B0，且都不低于70%；菌株B1在膽鹽質量濃度為0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL時存活率較高，當質量濃度達到0.3 g/100 mL時，其耐受性較差，存活率不足70%，顯著低于原始菌株B0（P＜0.05）。因此，只有B3、B4和B7三株菌株符合耐膽鹽性的標準。

由以上結果可知，脈沖強光可以篩選出具有耐高溫性、耐強酸性和耐膽鹽性的優越抗性菌株B3、B4和B7，將這3 株菌株接種斜面培養基保存，用于復篩。

2.4 復篩結果

表2 產α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶菌株篩選結果Table 2 α-Amylase, protease and lipase activity of selected mutants

由表2可知，與原始菌株相比，經脈沖強光誘變的菌株產α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶3 種酶周圍形成透明水解圈直徑與菌落直徑的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）更大，菌株B4的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）比原始菌株增加量小于10%，只有菌株B3和B7的比值增加量遠超過10%，差異顯著（P＜0.05），因此篩選出發生正突變的菌株B3和B7，其產酶能力有較大提高。

2.5 酶活力測定結果及產酶遺傳穩定性分析

2.5.1 α-淀粉酶活力測定結果及菌株產酶穩定性分析

表3 菌株產α-淀粉酶活力的測定結果及遺傳穩定性Table 3 Genetic stability of mutants B3 and B7 for α-amylase production

由表3可知，變異菌株B3和B7的α-淀粉酶活分別為（114.06±0.43）U/mL和（120.89±0.32） U/mL，是原始菌株B0酶活（68.3±0.14）U/mL的1.67倍和1.77倍，差異極顯著（P＜0.01）。將變異菌株B3、B7分別傳代培養5 次，酶活變化幅度很小，差異不顯著（P＞0.05），說明變異菌株產酶能力穩定。

2.5.2 L-酪氨酸標準曲線

根據標準曲線的線性回歸方程y=0.010x＋0.002 5，R2=0.998 8，說明此方法在L-酪氨酸質量濃度為0～100 μg/mL時具有良好的線性關系。

2.5.3 蛋白酶活力測定結果及菌株產酶穩定性分析

表4 菌株產蛋白酶活力的測定結果及遺傳穩定性Table 4 Genetic stability of mutants B3 and B7 for protease production

由表4可知，變異菌株B3和B7的蛋白酶活分別為（88.3±0.35）U/mL和（96.79±0.26）U/mL，比原始菌株B0酶活（56.6±0.21）U/mL提高了56%和71%，差異極顯著（P＜0.01），經傳代培養5 次，B3和B7的酶活力趨于穩定，差異不顯著（P＞0.05），因此，脈沖強光誘變處理得到的變異菌株產蛋白酶能力可良好穩定遺傳。

2.5.4 脂肪酶活力測定結果及菌株產酶穩定性分析

表5 菌株產脂肪酶活力的測定結果及遺傳穩定性Table 5 Genetic stability of mutants B3 and B7 for lipase production

由表5可知，變異菌株B3和B7的脂肪酶活分別為（16.21±0.27）U/mL和（17.18±0.36）U/mL，是原始菌株B0酶活（12.1±0.15）U/mL的1.34 倍和1.42 倍，差異顯著（P＜0.05），傳代培養5 次，B3、B7各代酶活力變化不大，差異不顯著（P＞0.05），因此，變異菌株B3、B7的產脂肪酶遺傳性能很穩定。

2.6 原始菌株和變異菌株的SDS-PAGE分析

將3 個菌體蛋白進行SDS-PAGE分析，經凝膠成像分析系統分析并拍照形成電泳圖，如圖6所示。

圖5 各部分蛋白成分的比較Fig. 5 Comparison of protein components of the original strains and mutants B3 and B7

由圖5可知，原始菌株和變異菌株蛋白條帶存在有無和明暗的差異。3 株菌株在分子質量大小約為28 kDa處均出現清晰的條帶，但變異菌株B7、B3的條帶比原始菌株B0顏色更深更明顯；B7、B3比B0多出一條分子質量大小約為16 kDa的條帶；B7在分子質量約為19 kDa的條帶比B3更寬一些，B7蛋白表達更多；B3、B7在分子質量大小約為21、36 kDa處均出現條帶，在相同兩處B0卻沒有條帶，說明原始菌株經誘變處理，促進了某些蛋白質的合成；3株菌株在分子質量大小為58～62 kDa之間出現明顯的條帶，B7、B3的蛋白表達量更高。以上結果說明，菌株經脈沖強光處理后蛋白發生改變，是因為脈沖強光處理菌株對其核酸造成影響，使某些基因的表達發生變化，改變了某些蛋白質的合成。

3 結論與討論

本研究采用脈沖強光對枯草芽孢桿菌進行誘變處理，在脈沖電壓2 450 V、照射距離5 cm、脈沖40 次的條件下，篩選出兼具耐受高溫、耐受強酸和耐受高濃度膽鹽的變異菌株B3和B7，產α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力分別是原始菌株的167%和177%（P＜0.01）、156%和171%（P＜0.01）、134%和142%（P＜0.05），變異菌株產酶穩定性較高且可遺傳變異，SDS-PAGE凝膠電泳顯示菌體誘變前后蛋白表達出現差異性，該方法應用于枯草芽孢桿菌誘變育種領域具有可行性。

本實驗誘變篩選出了高耐受性變異枯草芽孢桿菌，并且其α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的產生能力得到了顯著提高。根據相關報道，以上耐受性和幾種產酶能力的增強對菌株用于抵抗動物胃腸道內的不良環境[18]、肉類嫩化處理[28]、定向改變食品組分以提高特定營養成分的比例[29]等方面均具有積極作用。因此，脈沖強光處理枯草芽孢桿菌取得了良好的誘變效果，在枯草芽孢桿菌誘變育種領域發展潛力巨大，在微生物工業酶制劑中應用前景廣闊。

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Pulsed Light Mutagenesis and Screening of Bacillus subtilis for Improved Tolerance and Extracellular Enzymatic Activities of Screened Mutants

ZHAO Tianhui, ZHANG Baiqing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Pulsed light was applied to mutagenize Bacillus subtilis. The resulting mutants were screened for improved tolerance. The extracellular enzymatic activity and genetic stability of the selected mutants were analyzed and compared with those of the original strain and the differential protein expression of the original strain and the mutant strains was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed that 8 resistant mutant strains were generated under the conditions of pulse voltage of 2 450 V, distance of 5 cm and pulse number of 40.After primary and secondary screening, the mutant strains B3 and B7 with good tolerance to high temperature tolerance, acid and high concentration of bile salt were obtained. Their α-amylase activity, protease activity, lipase activity was increased by 67% and 77% (P ＜ 0.01), 56% and 71% (P ＜ 0.01), and 34% and 42% (P ＜ 0.05), compared with those of the original strain,respectively. The enzymatic activity of the obtained mutants was stable (P ＞ 0.05) and showed genetic variation. The protein expression level was different between before and after mutagenesis. These fi ndings proved the feasibility of application of pulsed light to mutagenize B. subtilis.

tolerance; Bacillus subtilis; pulsed light; mutagenesis and screening; enzymatic activity

10.7506/spkx1002-6630-201802030

TS201.3

A

1002-6630（2018）02-0192-06

趙天惠, 張佰清. 耐受性枯草芽孢桿菌的脈沖強光誘變篩選及產酶活力分析[J]. 食品科學, 2018, 39(2): 192-197.

10.7506/spkx1002-6630-201802030. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Tianhui, ZHANG Baiqing. Pulsed light mutagenesis and screening of Bacillus subtilis for improved tolerance and extracellular enzymatic activities of screened mutants[J]. Food Science, 2018, 39(2): 192-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802030. http://www.spkx.net.cn

2017-01-24

趙天惠（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品非熱加工技術。E-mail：1183412100@qq.com

*通信作者簡介：張佰清（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品工程技術的開發和應用。E-mail：sybaiqingxl@sina.com