去甲基化法制備黃豆苷元和染料木黃酮及抗氧化性分析

張曉松，金 花，閆惠麗，張永忠，許 晶*

去甲基化法制備黃豆苷元和染料木黃酮及抗氧化性分析

張曉松，金 花，閆惠麗，張永忠，許 晶*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以KBr-H3PO4或KI-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)芒柄花黃素和雞豆黃素進(jìn)行去甲基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成黃豆苷元和染料木黃酮，并對(duì)產(chǎn)物的抗氧化性進(jìn)行分析。結(jié)果表明：以KBr-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)，制備黃豆苷元最佳條件為反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度120 ℃、料液比1∶45（g/mL）、最佳飽和度75%，產(chǎn)率為89.42%；制備染料木黃酮最佳條件為反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度120 ℃、料液比1∶45（g/mL）、最佳飽和度100%，產(chǎn)率為85.98%；以KI-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)，制備黃豆苷元最佳條件為反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度100 ℃、料液比1∶15（g/mL）、最佳飽和度75%，產(chǎn)率可達(dá)87.03%；制備染料木黃酮最佳條件分別為反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度100 ℃和料液比1∶45（g/mL）、最佳飽和度75%，產(chǎn)率可達(dá)88.51%。與已有合成方法相比，本實(shí)驗(yàn)方法具有反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間較短、產(chǎn)率較高等優(yōu)點(diǎn)。所制備黃豆苷元和染料木黃酮具有一定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基清除能力，以及較強(qiáng)的抗亞油酸氧化能力，表現(xiàn)出較好的抗氧化性。

去甲基化；黃豆苷元；染料木黃酮；芒柄花黃素；雞豆黃素

黃豆苷元和染料木黃酮最初在大豆中發(fā)現(xiàn)，屬于大豆異黃酮苷元物質(zhì)，也被稱為植物雌激素，因其與雌二醇結(jié)構(gòu)相似，具有活性基團(tuán)二酚羥基，能夠與雌激素靶細(xì)胞結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能[1]。大豆異黃酮不僅具有弱雌激素活性，還具有抗氧化性和抑菌性等功能，能夠有效地起到預(yù)防和抑制中老年骨質(zhì)疏松、乳腺癌、前列腺癌以及婦女更年期綜合癥等疾病的作用[2-4]。此外，國(guó)外伯克康奈爾醫(yī)學(xué)研究所、密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院和匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院等多家科學(xué)研究機(jī)構(gòu)通過(guò)對(duì)黃豆苷元的臨床實(shí)驗(yàn)還表明，黃豆苷元具有保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用[5]。但是，實(shí)際上一般大豆品種中異黃酮的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.2%，而更具生物活性和功能的苷元形式異黃酮不足大豆異黃酮總量的3%，含量極低。于是人們將目光轉(zhuǎn)向其他富含異黃酮類物質(zhì)，例如天然三葉草類植物[6-7]。其中，紅三葉草中異黃酮含量比大豆高10～30 倍，包括豐富的芒柄花黃素和雞豆黃素等[8-9]，而芒柄花黃素和雞豆黃素的結(jié)構(gòu)與黃豆苷元和染料木黃酮十分相近，是轉(zhuǎn)化黃豆苷元和染料木黃酮的最佳原料。紅三葉草可以有效避免用大豆提取異黃酮類物質(zhì)而造成的糧食資源浪費(fèi)的現(xiàn)象。

目前，黃豆苷元主要從植物中提取純化后再經(jīng)過(guò)水解和化學(xué)合成兩種途徑獲得。其中水解法試劑成本較高、終產(chǎn)品純化過(guò)程繁雜、環(huán)境污染嚴(yán)重，所以并不適于實(shí)際應(yīng)用。另外，制備黃豆苷元的化學(xué)合成法主要為脫氧安息香路線[10-11]，通過(guò)脫氧安息香中間體閉環(huán)制得異黃酮。此外，Li等[12]以4-芐氧基鄰羥基苯甲醛的Wittig反應(yīng)、氧烷基化反應(yīng)、二次Wittig反應(yīng)生成烯烴，烯烴再經(jīng)Grubbs催化閉環(huán)、硼氫化、氧化脫水和去芐基、甲基化，從而最終獲得黃豆苷元。Biegasiewicz等[13-14]則采用2,4-二羥基苯甲醛為起始物質(zhì)，首先制得其烯胺化合物，然后烯胺化合物經(jīng)碘化閉環(huán)、Suzuki偶聯(lián)和去甲基化制得了較高產(chǎn)率的黃豆苷元產(chǎn)物。由此可見，化學(xué)合成法存在著明顯反應(yīng)步驟多（3步以上）、時(shí)間長(zhǎng)的不足。

然而，鑒于芒柄花黃素和雞豆黃素與黃豆苷元和染料木黃酮結(jié)構(gòu)相近，可在催化劑作用下發(fā)生親核取代反應(yīng)，醚鍵斷裂，實(shí)現(xiàn)去甲基化的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，制備黃豆苷元和染料木黃酮。本實(shí)驗(yàn)以KBr/KI-H3PO4為催化劑，反應(yīng)開始時(shí)，芒柄花黃素和雞豆黃素先與質(zhì)子結(jié)合形成烊鹽，烊鹽的生成使得C—O鍵變?nèi)酰虼耍静灰纂x去的基團(tuán)—OR（強(qiáng)堿）變成了較易離去的基團(tuán)HOR（弱堿），X-（Br-/I-）作為親核試劑進(jìn)攻烊鹽底物的中心碳原子，而使醚鍵斷裂，芳基醚水解生成酚羥基，通過(guò)一步反應(yīng)得到黃豆苷元和染料木黃酮產(chǎn)物。具體反應(yīng)原理如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)克服了已有方法的缺點(diǎn)，以芒柄花黃素和雞豆黃素為起始原料，通過(guò)一步去甲基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物黃豆苷元和染料木黃酮，產(chǎn)率高達(dá)80%以上，并對(duì)其反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了討論，分析總結(jié)了制備產(chǎn)物的抗氧化活性，為紅三葉草異黃酮轉(zhuǎn)化黃豆苷元和染料木黃酮的應(yīng)用提供理論依據(jù)，具有一定現(xiàn)實(shí)參考意義。

圖1 去甲基化反應(yīng)原理Fig. 1 Reaction mechanism of demethylation of formononetin and biochanin A

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒柄花黃素（純度98.83%）、雞豆黃素（純度98%）陜西森弗生物有限責(zé)任公司；黃豆苷元（純度98%）美國(guó)Fluka公司；染料木黃酮（純度≥98%） 無(wú)錫高潤(rùn)杰科技有限公司；甲醇（光譜純）、超純水、硅膠GF254 美國(guó)Dikma公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海華巖儀器設(shè)備有限公司；FTIR-8400S紅外光譜儀 日本島津儀器公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用有限責(zé)任公司；1100 Series型高效液相色譜儀、色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm） 美國(guó)Agilent公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃豆苷元和染料木黃酮的制備

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的芒柄花黃素或雞豆黃素于100 mL圓底燒瓶中，加入不同飽和度的KBr-H3PO4（按每毫升濃磷酸含1.5～3.0 g KBr溶液，每克原料加5 mL KBr-H3PO4），或加入不同飽和度的KI-H3PO4（按每毫升濃磷酸含2.5～3.5 g KI溶液，每克原料加15 mL的KI-H3PO4）溶液。將混合好的反應(yīng)溶液置于超聲波清洗器中，持續(xù)加熱振蕩，以溶解芒柄花黃素和雞豆黃素。待其充分溶解之后，將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至油浴中加熱回流，待反應(yīng)結(jié)束后，將體系靜置冷卻，至室溫。然后進(jìn)行產(chǎn)物純化，首先用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物3～5 次。再用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行反向萃取3～5 次。將萃取后的上層溶液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中初步濃縮。冷凍干燥所得濃縮液，直至完全干燥。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析進(jìn)一步純化，并應(yīng)用高效液相色譜測(cè)定提純產(chǎn)物中黃豆苷元和染料木黃酮的含量。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為60% CH3OH溶液；柱溫：常溫；流速：1.0 L/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm。根據(jù)液相色譜圖產(chǎn)物樣品的保留時(shí)間對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，并通過(guò)外標(biāo)法對(duì)其定量分析，根據(jù)公式（1）計(jì)算產(chǎn)率。

式中：w為反應(yīng)后的實(shí)際產(chǎn)量；w0為理論產(chǎn)量。

1.3.3 黃豆苷元和染料木黃酮制備的單因素試驗(yàn)

以黃豆苷元和染料木黃酮產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、KI/KBr在濃磷酸中的飽和度、料液比4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。確定各因素對(duì)產(chǎn)率的影響及各因素適宜范圍。

黃豆苷元和染料木黃酮單因素試驗(yàn)條件范圍：設(shè)定料液比1∶15（g/mL）、飽和度75%、反應(yīng)時(shí)間4 h的條件下，改變反應(yīng)溫度為60、80、100、120、140 ℃進(jìn)行試驗(yàn)；料液比1∶15（g/mL）、飽和度100%、反應(yīng)溫度120 ℃，改變反應(yīng)時(shí)間為2、3、4、5、6 h進(jìn)行試驗(yàn)；料液比1∶15（g/mL）、反應(yīng)溫度110 ℃、反應(yīng)時(shí)間4 h的條件下，調(diào)整飽和度分別為50%、75%、100%、120%進(jìn)行試驗(yàn)；反應(yīng)溫度110 ℃、反應(yīng)時(shí)間4 h、飽和度100%，調(diào)整料液比分別為1∶2.5、1∶5、1∶9、1∶15、1∶45（g/mL）進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.4 黃豆苷元和染料木黃酮制備工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、KI/KBr在濃磷酸中的飽和度、料液比4 個(gè)因素建立四因素三水平的正交試驗(yàn)，以黃豆苷元和染料木黃酮產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步選取最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used for orthogonal array design

1.3.5 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定

參照Chung等[15]的測(cè)定方法，將黃豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品、制備產(chǎn)物黃豆苷元、染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和制備產(chǎn)物染料木黃酮配制成相同質(zhì)量濃度梯度（0.074 2、0.247 2、0.370 8、0.500 0、0.718 0、1.000 0 mg/mL）的異黃酮樣液，取樣液0.3 mL，先加入0.1 mL Tris-HCl緩沖液（pH 7.9），再加100 μmol/L的DPPH-甲醇溶液0.6 mL，搖勻后室溫避光靜置30 min，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處吸光度（A517nm），實(shí)驗(yàn)設(shè)置蒸餾水為空白組，測(cè)定空白組吸光度（Ablank），另設(shè)未添加異黃酮測(cè)試組為對(duì)照組，測(cè)定吸光度（Ac）。以VC、VE作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算見公式（2）。

1.3.5.2 羥自由基清除能力測(cè)定

采用α-脫氧核糖氧化法進(jìn)行測(cè)定[16]。分別配制4 種不同質(zhì)量濃度梯度（1、5、10、20、25 μg/mL）的異黃酮樣液，設(shè)置測(cè)定波長(zhǎng)為532 nm，蒸餾水作參比，測(cè)定吸光度（As）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)比組和空白組，分別測(cè)定吸光度Ac和A0，則羥自由基清除能力計(jì)算見公式（3）。

1.3.5.3 抗亞油酸氧化能力的測(cè)定

參照Yen等[17]報(bào)道的硫氰酸鐵法測(cè)定。分別取0.5 mL配制好的4 個(gè)樣液（100 μg/mL），37 ℃恒溫避光保存，每12 h取液0.1 mL，然后向試液中加入9.7 mL 75%乙醇溶液和0.1 mL 30%硫氰酸胺溶液，混合均勻，再加入0.1 mL 20 mmol/L硫酸亞鐵溶液，反應(yīng)3 min。反應(yīng)結(jié)束后，以蒸餾水為空白，測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處吸光度（A500nm）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，結(jié)果均以平均值表示。采用SPSS V20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Excel 2007軟件、Origin V8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率的影響結(jié)果

由圖2可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，異黃酮產(chǎn)率快速升高。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，黃豆苷元、染料木黃酮產(chǎn)率分別可達(dá)到87%和89%。之后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，產(chǎn)率稍有下降。這可能是因?yàn)樵诟邷貤l件下異黃酮不穩(wěn)定，會(huì)分解成為其他物質(zhì)，所以隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，異黃酮反應(yīng)物和產(chǎn)物均會(huì)受到溫度影響，使得產(chǎn)率下降[18]。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為4 h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)黃豆苷元（A）和染料木黃酮（B）產(chǎn)率的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the yield of daidzein (A) and genistein (B)

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)率的影響結(jié)果

由于異黃酮類物質(zhì)對(duì)溫度較為敏感，高溫條件下易分解或發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，所以反應(yīng)溫度對(duì)異黃酮產(chǎn)率的影響也較為顯著。如圖3可知，在KBr-H3PO4和KI-H3PO4兩種介質(zhì)中，當(dāng)溫度低于100 ℃時(shí)，黃豆苷元和染料木黃酮的產(chǎn)率均隨溫度升高而快速增加。而超過(guò)100 ℃后，KBr-H3PO4介質(zhì)中異黃酮產(chǎn)率下降，在KI-H3PO4介質(zhì)中，120 ℃后產(chǎn)率也呈下降趨勢(shì)。由此可知，反應(yīng)溫度不宜過(guò)高，綜合考慮KBr-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，最佳反應(yīng)溫度為120 ℃，KI-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，最佳反應(yīng)溫度為100 ℃。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)黃豆苷元（A）和染料木黃酮（B）產(chǎn)率的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the yield of daidzein (A) and genistein (B)

2.1.3 料液比對(duì)產(chǎn)率的影響

圖4 料液比對(duì)黃豆苷元（A）和染料木黃酮（B）產(chǎn)率的影響Fig. 4 Effect of solid-to-solvent ratio on the yield of daidzein (A) and genistein (B)

由圖4可知，隨著反應(yīng)體系中提取溶劑用量的增大，產(chǎn)率逐漸升高，但升高趨勢(shì)漸緩。這是因?yàn)樵黾犹崛∪軇┯昧浚谟H核試劑HBr和HI濃度較低時(shí)，由于反應(yīng)底物充足，體系中的HBr和HI數(shù)量增加，Br-/I-與中心碳原子的作用增強(qiáng)，利于親核取代的發(fā)生，使得反應(yīng)速率加快，反應(yīng)進(jìn)行更加充分，提高了反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率。但是，當(dāng)提取溶劑用量增加到一定程度之后，反應(yīng)底物提供的中心碳原子飽和，限制了親核取代的進(jìn)行，從而減緩了產(chǎn)率的提高。因此，當(dāng)反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到90%以上，增加過(guò)高的提取溶劑用量對(duì)提高反應(yīng)產(chǎn)率的意義已經(jīng)不大，反而會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)溶劑的浪費(fèi)和環(huán)境的負(fù)擔(dān)。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶45（g/mL）。

2.1.4 飽和度對(duì)產(chǎn)率的影響

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)使體系中Br-/I-的物質(zhì)的量超過(guò)芒柄花黃素和雞豆黃素的物質(zhì)的量，以保證反應(yīng)物的轉(zhuǎn)換率較高，因此，設(shè)定飽和度為50%、75%、100%和120%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖5可知，改變KBr/KI-H3PO4介質(zhì)的飽和度對(duì)異黃酮產(chǎn)率的影響相對(duì)較小。在反應(yīng)介質(zhì)KBr-H3PO4中，飽和度為100%時(shí)獲得黃豆苷元和染料木黃酮最大產(chǎn)率，而KI-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)時(shí)，最大產(chǎn)率對(duì)應(yīng)的飽和度為75%。

圖5 飽和度對(duì)黃豆苷元（A）和染料木黃酮（B）產(chǎn)率的影響Fig. 5 Effect of degree of saturation on the yield of daidzein (A) and genistein (B)

2.2 黃豆苷元和染料木黃酮制備正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 制備黃豆苷元正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表2 黃豆苷元制備正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（KBr-H3PO4介質(zhì)）Table 2 Orthogonal array design with experimental values of daidzein yield in KBr-H3PO4 solution

由表2可知，在KBr-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中，影響產(chǎn)率的最主要因素為D（料液比），其次是C（飽和度）和B（反應(yīng)溫度），A（反應(yīng)時(shí)間）的影響最小，各因素對(duì)黃豆苷元產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)镈＞C＞B＞A，最優(yōu)組合為A3B3C2D3，即反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度120 ℃、飽和度75%、料液比1∶45（g/mL）。由表3可知，在KI-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中，影響產(chǎn)率的最主要因素同樣也是D（料液比），各因素對(duì)黃豆苷元產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，最優(yōu)組合為A2B2C2D2，即反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度100 ℃、飽和度75%、料液比1∶15（g/mL）。

因以上2 個(gè)組合不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，故需要按照以上條件平行進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，按照優(yōu)選工藝A3B3C2D3和A2B2C2D2，在KBr-H3PO4和KI-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中黃豆苷元產(chǎn)率分別為89.42%和87.03%，均比設(shè)計(jì)試驗(yàn)的最佳條件結(jié)果要高。因此確定芒柄花黃素轉(zhuǎn)化黃豆苷元的最優(yōu)工藝條件為在KBr-H3PO4介質(zhì)中，反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度120 ℃、飽和度75%、料液比1∶45（g/mL）；在KI-H3PO4介質(zhì)中，反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度100 ℃、飽和度75%、料液比1∶15（g/mL）。

表3 黃豆苷元制備正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（KI-H3PO4介質(zhì)）Table 3 Orthogonal array design with experimental values of daidzein yield in KI-H3PO4 solution

2.2.2 制備染料木黃酮正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表4 染料木黃酮正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（KBr-H3PO4介質(zhì)）Table 4 Orthogonal array design with experimental values of genistein yield in KBr-H3PO4 solution

表5 染料木黃酮正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（KI-H3PO4介質(zhì)）Table 5 Orthogonal array design with experimental values of genistein yield in KI-H3PO4 solution

由表4和表5可知，通過(guò)極差分析，在KBr-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中，影響產(chǎn)率的最主要因素為D（料液比），其次是B（反應(yīng)溫度）和A（反應(yīng)時(shí)間），C（飽和度）的影響最小。各因素對(duì)染料木黃酮產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，最優(yōu)組合為A3B3C3D3。在KI-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中，各因素對(duì)染料木黃酮產(chǎn)率影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，最優(yōu)組合為A3B2C2D3。因2 個(gè)組合均不在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，故按最優(yōu)組合條件平行進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，按照優(yōu)選工藝A3B3C3D3和A3B2C2D3，在KBr-H3PO4和KI-H3PO4反應(yīng)介質(zhì)中染料木黃酮產(chǎn)率分別為85.98%和88.51%，均比設(shè)計(jì)試驗(yàn)的最佳條件結(jié)果要高。因此確定雞豆黃素轉(zhuǎn)化染料木黃酮的最優(yōu)工藝條件為在KBr-H3PO4介質(zhì)中，反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度120 ℃、飽和度100%、料液比1∶45（g/mL）；在KI-H3PO4介質(zhì)中，反應(yīng)時(shí)間5 h、反應(yīng)溫度100 ℃、飽和度75%、料液比1∶45（g/mL）。

2.3 抗氧化性結(jié)果分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力結(jié)果

圖6 黃豆苷元和染料木黃酮制備產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品清除DPPH自由基能力Fig. 6 DPPH radical scavenging capacities of daidzein and genistein

由圖6可知，制備產(chǎn)物黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)DPPH自由基均有一定的清除作用。并且，隨著產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，制備產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)。其中，染料木黃酮的DPPH自由基清除率比黃豆苷元稍高。這是由于酚羥基的數(shù)目和位置、單體結(jié)構(gòu)的空間位阻都會(huì)對(duì)自由基清除能力產(chǎn)生影響，從而影響其抗氧化性[19-20]。劉科梅等[21]曾利用量子化學(xué)計(jì)算研究了黃豆苷元和染料木黃酮分子清除自由基的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)異黃酮分子清除自由基能力與其各羥基位電子轉(zhuǎn)移能力和脫氫能力有關(guān)，并且證明4’-OH是黃豆苷元和染料木黃酮最主要的羥基活性部位，通過(guò)對(duì)羥基位的量化參數(shù)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，表明染料木黃酮具有比黃豆苷元稍強(qiáng)的抗氧化活性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但染料木黃酮和黃豆苷元的DPPH自由基清除能力都稍弱于陽(yáng)性對(duì)照組VC和VE。

2.3.2 羥自由基清除能力

由圖7可知，黃豆苷元和染料木黃酮均有一定的羥自由基清除能力，并且染料木黃酮的清除能力要比黃豆苷元稍強(qiáng)。另外，染料木黃酮的羥自由基清除能力受物質(zhì)質(zhì)量濃度影響較大，改變?nèi)玖夏军S酮質(zhì)量濃度為1～20 μg/mL，其清除率由45%上升至65%，而黃豆苷元對(duì)羥自由基清除率變化則不明顯。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[3]一致。但是當(dāng)黃豆苷元和染料木黃酮質(zhì)量濃度繼續(xù)增加至25 μg/mL，黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)羥自由基清除能力均發(fā)生下降，說(shuō)明黃豆苷元和染料木黃酮的羥自由基清除能力與質(zhì)量濃度不完全呈正相關(guān)關(guān)系[22]。

圖7 黃豆苷元、染料木黃酮制備產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品清除羥自由基能力Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging capacities of daidzein and genistein

2.3.3 抗亞油酸氧化能力

黃豆苷元和染料木黃酮中所含有的酚羥基作為供氧體能與自由基反應(yīng)使之生成相應(yīng)的離子或分子，終止油脂自由基的連鎖反應(yīng)，使之表現(xiàn)出抗油脂自動(dòng)氧化的效果[23-24]。因此，可以通過(guò)對(duì)異黃酮物質(zhì)的抗油脂氧化的測(cè)定，分析其抗氧化能力的強(qiáng)弱。由圖8可知，黃豆苷元和染料木黃酮對(duì)亞油酸氧化的抑制作用較強(qiáng)。在反應(yīng)的前7 d，曲線平穩(wěn)上升趨勢(shì)較弱，無(wú)出峰跡象，這說(shuō)明前7 d亞油酸氧化基本被抑制。7 d之后，曲線上升明顯，在第13天左右達(dá)到峰值。比較可知染料木黃酮的抗亞油酸氧化能力較黃豆苷元稍強(qiáng)。

圖8 黃豆苷元、染料木黃酮制備產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品抗亞油酸氧化能力Fig. 8 Inhibitory effects of daidzein and genistein on linoleic acid oxidation

3 結(jié) 論

以KBr/KI-H3PO4為反應(yīng)介質(zhì)對(duì)芒柄花黃素和雞豆黃素進(jìn)行去甲基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成黃豆苷元和染料木黃酮。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。同時(shí)，對(duì)制備產(chǎn)物黃豆苷元和染料木黃酮的抗氧化活性進(jìn)行分析，證明黃豆苷元和染料木黃酮具有一定的DPPH自由基和羥自由基清除能力，以及較強(qiáng)的抗亞油酸氧化能力。由于單體結(jié)構(gòu)原因?qū)е氯玖夏军S酮的抗氧化性相對(duì)稍強(qiáng)。

紅三葉草中含有豐富的芒柄花黃素和雞豆黃素，也是異黃酮類物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。目前，許多研究報(bào)道了對(duì)紅三葉草異黃酮的抗氧化性和生理性能[25]。結(jié)果顯示，紅三葉草中的芒柄花黃素和雞豆黃素類異黃酮物質(zhì)能夠保護(hù)神經(jīng)元[26]、提高生物體生長(zhǎng)性能[27]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[28]和降低炎癥發(fā)生率[29]。可見，紅三葉草異黃酮具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。但是，與芒柄花黃素和雞豆黃素相比，黃豆苷元和染料木黃酮的抗氧化活性和生物功能要更高[30]，所以能夠有效地將芒柄花黃素和雞豆黃素轉(zhuǎn)化成為性能更加優(yōu)異的黃豆苷元和染料木黃酮，將進(jìn)一步提高其紅三葉草異黃酮的應(yīng)用效果和利用價(jià)值具有現(xiàn)實(shí)意義。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅三葉草及其他富含異黃酮作物的有效利用提供了一定的參考數(shù)據(jù)。

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Preparation of Daidzein and Genistein by Demethylation Reaction and Their Antioxidant Activity

ZHANG Xiaosong, JIN Hua, YAN Huili, ZHANG Yongzhong, XU Jing*
(College of Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Daidzein and genistein were derived from the demethylation of formononetin and biochanin A in KBr-H3PO4or KI-H3PO4solution, respectively. The antioxidant activities of daidzein and genistein were also evaluated. The optimal conditions for preparing daidzein in KBr-H3PO4solution were determined as follows:reaction time 5 h, reaction temperature 120 ℃, ratio of solid to solvent 1:45 (g/mL), and degree of saturation 75%,providing maximum reaction yield of 89.42%, while those for preparing genistein were 5 h, 120 ℃, 1:45 (g/mL),and 100%, providing maximum reaction yield of 85.98%; the optimal conditions for preparing daidzein in KI-H3PO4solution were determined as 4 h, 100 ℃, 1:15 (g/mL) and 75% for reaction time, temperature, ratio of solid to solvent and degree of saturation, respectively, providing maximum reaction yield of 87.03%, while those for preparing genistein were 5 h, 100 ℃, 1:45 (g/mL) and 75%, respectively, providing maximum reaction yield of 88.51%. Compared with the traditional synthesis methods, the proposed method in this study had many advantages such as simpler reaction process,milder reaction conditions, shorter reaction time and higher yield. The daidzein and genistein had 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and hydroxyl radical scavenging ability and a potent inhibitory effect on linoleic acid oxidation suggesting good antioxidant activity.

demethylation; daidzein; genistein; formononetin; biochanin A

10.7506/spkx1002-6630-201802038

TS201.1

A

1002-6630（2018）02-0240-07

張曉松, 金花, 閆惠麗, 等. 去甲基化法制備黃豆苷元和染料木黃酮及抗氧化性分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 240-246.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802038. http://www.spkx.net.cn

2017-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301600）；中國(guó)博士后特別資助項(xiàng)目（2014T70306）；

黑龍江省博士后啟動(dòng)基金項(xiàng)目（LBH-Q16012）

張曉松（1982—），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樘烊簧锘钚晕镔|(zhì)提取及應(yīng)用。E-mail：liuxing167@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：許晶（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：xujing@neau.edu.cn

ZHANG Xiaosong, JIN Hua, YAN Huili, et al. Preparation of daidzein and genistein by demethylation reaction and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2018, 39(2): 240-246. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802038. http://www.spkx.net.cn