煙曲霉素對蜜蜂微孢子蟲治療效果研究

一、前言

煙曲霉素是一種從煙曲霉中分離得到的抗生素，是目前唯一一種能夠有效治療微孢子蟲病的藥物，近六十年來被廣泛應用于西方蜜蜂微孢子蟲病的治療。最近發現它也能抑制東方微孢子蟲的繁殖。

2004年，Huang WF等發現，從中華蜜蜂中提取的東方孢子蟲可以感染意大利蜜蜂，這引起了人們對于蜜蜂健康的擔憂。在意大利和西班牙，蜜蜂的數量逐年下降，這與孢子蟲病的盛行不無關系。Pajuelo AG和Williams GR等人研究證明，在一定的濃度下，煙曲霉素不但可以控制西方孢子蟲的繁殖，對東方孢子蟲同樣有效。這導致煙曲霉素的銷量上升，蜂產品中抗生素的殘留情況也隨之加劇。因此，在美國，煙曲霉素是禁止在流蜜期使用的，蜂農在晚秋和早春施用煙曲霉素用作對微孢子蟲病的預防，流蜜期間煙曲霉素會逐漸降解，整個禁止期長達六個月。

這種間歇式的給藥方式使蜜蜂和微孢子蟲持續處于煙曲霉素的暴露當中，盡管這種方式有利于形成煙曲霉素抗性的微孢子蟲，但是Higes M，Cox-Foster DL等人研究證明，西方孢子蟲并沒有形成抗性，而東方孢子蟲卻表現出對煙曲霉素的不敏感性，這使東方孢子蟲取代西方孢子蟲成為一個趨勢。

煙曲霉素能夠抑制兔腦炎原蟲（一種以人為寄主的微孢子蟲）的甲硫氨酸氨肽酶2（MetAP2），大多數的真核生物有兩種MetAP的亞型，MetAP1和MetAP2，其中MetAP2是煙曲霉素的靶點蛋白。然而，MetAP2蛋白基因在所有的真核生物中有60%的同源性，因此，煙曲霉素雖然被用作治療微孢子蟲和某些癌癥的藥物，同時也會對人和其它脊椎動物的健康造成一定的危害。Webster TC和Rada V已經證明，攝入煙曲霉素的蜂王和工蜂壽命會縮短，但是這種抗生素對蜜蜂的潛在毒性目前研究的還較少。

本文中，Wei-Fone Huang等用低濃度的煙曲霉素來探究降解過程中的煙曲霉素對東方和西方孢子蟲的影響。為了探明不同種屬的微孢子蟲（東方孢子蟲、西方孢子蟲、熊蜂孢子蟲）對煙曲霉素敏感性的差異，他們比較了三種孢子蟲的MetAP2蛋白的基因序列。此外，他們對未感染微孢子蟲而使用了煙曲霉素的蜜蜂中腸蛋白進行了二維電泳。結果顯示：低濃度的煙曲霉素不但無法抑制微孢子蟲的增殖，反而會干擾蜜蜂中腸組織的生理機能。

二、實驗內容與結果

1.煙曲霉素給藥組微孢子蟲繁殖情況

感染孢子蟲的蜜蜂給以不同濃度的煙曲霉素處理（25 mg/l以及0.02×，0.01×，0.002×，0.001×，0.0002×，0.00006×，0.00001×，0.0000033×，0×），結果顯示，東方孢子蟲和西方孢子蟲的繁殖情況明顯不同。

對于0.01×和0.001×給藥組，東方孢子蟲的數量分別比西方孢子蟲高165%和129%，東方孢子蟲煙曲霉素空白組的數量比西方孢子蟲高30%。1.0×煙曲霉素對東西方孢子蟲均有顯著抑制作用。0.04×濃度組的東方孢子蟲數量顯著低于煙曲霉素空白組。0.02×濃度組抑制作用不顯著，并且在后期有一個重新爆發的趨勢。0.01×濃度組孢子數與煙曲霉素空白組孢子數相似。作為對照，西方孢子蟲在0.01×濃度時即受到抑制。濃度為0.002×時，煙曲霉素對兩種孢子蟲均失去效果。濃度在0.0000033×～0.01×范圍內，東方孢子蟲數量明顯高于煙曲霉素空白組。而對于西方孢子蟲來說，濃度≤0.002×范圍內，孢子數量與煙曲霉素空白組沒有明顯差異。

2.MetAP2蛋白基因序列的比較

比較了東方孢子蟲、西方孢子蟲、熊蜂孢子蟲的MetAP2基因，并與蜜蜂和人的MetAP2蛋白基因進行比較。熊蜂孢子蟲為868 bp（GenBank編號：JQ927011），西方孢子蟲為926 bp（GenBank編號：JQ927010）。這些序列在C末端缺少65個氨基酸序列的堿基對，N末端缺少2個氨基酸序列的堿基對。但是包含所有的煙曲霉素結合位點和必要的金屬離子配位點序列，足以用來探究煙曲霉素和MetAP2的相互作用。

結果顯示，東方孢子蟲和熊蜂孢子蟲相似度為83%，東方孢子蟲和西方孢子蟲相似度73%，西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲相似度82%。

3.煙曲霉素處理組蜜蜂中腸的蛋白提取和2-D凝膠電泳

0.0 ，1.0，0.01和 0.001×25 mg/l煙曲霉素處理組的未感染蜜蜂用于蛋白試驗。通過對二維電泳蛋白點的有無、數量和位置進行鑒定比較煙曲霉素對蜜蜂中腸蛋白的影響。ESI-LC/MS和Mascot (Matrix Science)數據庫鑒定出45種與能量代謝、線粒體、細胞結構和運輸有關的蛋白。在不同煙曲霉素濃度組中，α-肌動蛋白的亞型處于凝膠的不同位置，數量有所增加。α-葡萄糖苷酶Ⅱ的亞型也有所變化，其三種亞型在所有的處理組中都被發現，但是其比率有所不同。位于線粒體中的H+轉運ATP合酶β亞基的亞型Ⅰ，在不同的煙曲霉素濃度處理組中呈現不同的分子質量。另外，在所有煙曲霉素濃度組中，均發現一種依賴電壓的陰離子選擇通道蛋白，其沒有出現在煙曲霉素空白組中。

4.相關基因和蛋白的序列號信息

西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲MetAP2蛋白基因的部分序列可以在GenBank數據庫中找到，序列號分別是JQ927010和JQ927011。東方孢子蟲MetAP2蛋白的GenBank基因序列號為XM002996491。蜜蜂和人的MetAP2蛋白的氨基酸序列號分別是XP624161 和 NP006829，果蠅是AAC05144，酵母是S45411，兔腦炎原蟲是AF440270，hellem大腸桿菌是AY224694，intestinalis大腸桿菌是AY224693。

三、討論

低濃度的煙曲霉素可以促進東西方孢子蟲的繁殖，這種情況在東方孢子蟲中更加嚴重，低濃度煙曲霉素或許能影響孢子蟲和宿主的相互關系。西班牙的一個蜂場試驗報道，施用煙曲霉素三個月以后其濃度會降到0.001×，雖然美國聯邦藥物管理局禁止在流蜜期使用煙曲霉素，市場上蜂蜜檢測到的煙曲霉素的濃度仍然在60 ng/g，大約是0.0024×濃度。經過計算，煙曲霉素在蜂場中的降解速度大約是-log10/月。利用這個計算結果，推測使用煙曲霉素以后，東方孢子蟲重新增殖的時間大約是2～5.5個月，后期還需要更多的蜂場試驗來驗證這個推測。

相對于西方孢子蟲，在使用煙曲霉素以后，東方孢子蟲能夠更快的重新增殖，同一條件下其孢子蟲數量是西方孢子蟲的兩倍，而在未使用煙曲霉素的情況下，東方孢子蟲的數量僅稍多于西方孢子蟲。對煙曲霉素的低敏感性，預示著東方孢子蟲可能會取代西方孢子蟲，成為蜜蜂孢子蟲病的主要病原體。

對三種孢子蟲的MetAP2基因序列的比較也許可以揭示不同孢子蟲對煙曲霉素敏感性不同的原因，對于MetAP2的基因序列和氨基酸序列來說，東方孢子蟲和熊蜂孢子蟲更為接近，而系統發生樹分析顯示，西方孢子蟲和熊蜂孢子蟲親緣關系更近（熊蜂孢子蟲不受煙曲霉素控制）。這說明三種孢子蟲的MetAP2沒有明顯的差別，預示著MetAP2可能不是唯一影響煙曲霉素藥效的因素。蜜蜂與孢子蟲MetAP2高度的相似性預示著東方孢子蟲大量增殖時，蜜蜂也會受到某種潛在的影響。

MetAP2參與很多蛋白的翻譯修飾，但是其全部功能還不為所知。使用了煙曲霉素的蜜蜂中腸蛋白分析結果表明，低濃度的煙曲霉素不但會加速微孢子蟲的繁殖，反而會影響蜜蜂中腸正常的生理機能。與高濃度的煙曲霉素相比，0.001×濃度時，與結構和代謝相關的蛋白變化微弱，但是仍然可以觀察到。雖然沒有找到能夠抑制微孢子蟲的蛋白，但是一些蛋白的亞型例如α-肌動蛋白、葡萄糖苷酶，在不同煙曲霉素濃度處理組有所變化。肌動蛋白的變化可以作為蜜蜂成功感染胞內頂復門寄生蟲的標志，α-葡萄糖苷酶Ⅱ亞型是碳水化合物代謝所必須，其它一些變化的蛋白位于線粒體，與能量的代謝有關。這些蛋白亞型的變化有可能與MetAP2的蛋白修飾作用被干擾有關。

殺蟲劑和東方孢子蟲之間可能的協同作用之前已經被報道過，我們發現煙曲霉素的作用與這些殺蟲劑高度的相似，煙曲霉素降解成低濃度以后這種協同作用會增強。煙曲霉素的使用是為了控制微孢子蟲的繁殖，但是這種抗生素很有可能會導致東方孢子蟲的盛行和傳播。雖然說有必要進行更多的蜂場試驗來驗證煙曲霉素對孢子蟲是否有效，但是更重要的是找到一種控制孢子蟲的新方法。以孢子蟲為靶點，又不影響蜜蜂的生理機能的新的藥物的研制對于控制蜜蜂微孢子蟲的發展至關重要。