精神分裂癥患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代謝組學研究

鄭慧斐 王文強 賴國銀 劉發榮 章家新 徐志忠 何玨

精神分裂癥患者的UHPLC-Q-TOF MS尿液代謝組學研究

鄭慧斐1王文強1賴國銀2劉發榮1章家新1徐志忠1何玨1

目的 利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF MS）對精神分裂癥患者和健康對照人群的尿液進行代謝組學研究，尋找精神分裂癥患者尿液中的差異代謝物，為精神分裂癥患者代謝綜合征的早期篩查提供科學依據。方法 尿液樣品經稀釋過濾后進樣分析，利用主成分分析方法分析所采集的數據。結果 根據譜庫共篩選了7個表征標記物，并進行了結構鑒定。結果發現，精神分裂癥患者較對照組尿液代謝表型有顯著差異，主成分分析得分散點圖中對照組與精神分裂癥患者組分類良好。結論 精神分裂癥患者糖、脂、氨基酸等代謝通路均發生紊亂，可能在代謝綜合征發生發展中有重要作用。

精神分裂癥；代謝組學；超高效液相色譜；飛行時間質譜

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS），與心血管病緊密相關，是一種涉及多種代謝異常的疾病，主要表現為患者體重增加（腹型肥胖）、胰島素抵抗、糖代謝調節異常、高血壓和脂代謝異常，MS患者心腦血管疾病的患病風險顯著高于普通人群。作為我國重點防治重性精神疾病之一的精神分裂癥，其患者合并MS的風險顯著高于普通人群，按照美國國家膽固醇教育計劃成人治療組第三次指南（NCEP-ATP III）的標準，精神分裂癥患者MS患病率是普通人群的4倍多，合并MS已成為精神分裂癥預后不良的重要原因[1-2]。代謝組學是利用對照組和實驗組的代謝組（metabolome，某一生物的所有代謝物組分）進行比較，以尋找代謝譜差異的研究方法。超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF MS）是一種先進的分離分析技術，具有高分辨率、高靈敏度，和高精確性等優點，尤其對于非靶標代謝組學分析，是目前公認最好的復雜樣品分析技術之一[3]。同時，基于LC-Q-TOF MS采集的數據，可結合統計分析軟件MPP進行主成分分析和患者模型的建立。

本研究利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF MS）檢測精神分裂癥患者（經廈門市仙岳醫院副高級以上的精神科醫生根據ICD-10精神分裂癥診斷標準進行診斷）尿液中代謝物成分的變化，通過主成分分析篩查潛在的生物學標記物，研究精神分裂癥患者合并MS的發生發展機制，為MS的早期篩查及早期臨床診治提供依據。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6540 UHD高分辨飛行時間質譜儀（美國Agilent公司），配備Mass Hunter Data Acquisition實時采集工作站和鞘流雙電噴霧離子源（dual Jet Stream ESI）；Agilent 1290系列超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配備自動進樣裝置、在線脫氣系統、柱溫箱、四元泵；Mass profiler professional；5804 R型高速離心機（德國Eppendorf公司）。乙酸銨（分析純）；乙腈，甲酸（HPLC級，德國Merk試劑公司）。實驗用超純水使用MILLI-Q系統獲得。

1.2 樣本來源

精神分裂癥患者組尿樣30例和健康對照組尿樣30例來源于福建省廈門市仙岳醫院（采集于2016年11月—2017年5月）。研究通過廈門市仙岳醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署過知情同意書。患者經廈門市仙岳醫院副高級以上的精神科醫生根據ICD-10精神分裂癥診斷標準進行診斷確診為精神分裂癥。患者組和健康對照組人群都在清晨留取中段尿，尿樣標本經過尿常規檢測，排除了血尿、菌尿和膽紅素尿等異常尿樣。尿樣采集后以3 000 r/min離心10 min，以去除尿液雜質，吸取上清樣本存入-80℃冰箱備用。

1.3 樣品處理

尿液上清樣本用四倍稀釋法，從-80℃冰箱取出標本后0℃下溶解，離心（12 000 r/min，4℃，5 min），取100 μl上清液，加超純水稀釋至400 μl，經過渦旋處理，用0.45 μm濾膜過濾樣品，所得待測樣品供UHPLC-Q-TOF MS分析。為了檢驗系統的穩定性，避免系統誤差，每分析5個實驗樣本后，用質控樣本（quality control）分析一次，QC樣本是分別隨機從10個精神分裂癥患者和10個健康對照的尿液樣本中取等量樣本混合后所得。

1.4 UHPLC-Q-TOF MS代謝組學分析條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流動相A：超純水（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨）；流動相B：乙腈。梯度洗脫：0～5 min，30%B；5～8 min，30%～80%B；8～12 min，80%～85% B；12～15 min，85% ～ 95%B；15～ 20 min，95%B；20～ 21 min，95% ～ 100%B；21～ 22 min，100% ～ 10%B；22～ 25 min，10%B。流速0.4 ml/min；柱溫35℃；進樣量2 μl。

1.4.2 質譜條件 應用鞘流雙電噴霧離子源在正離子掃描方式下采集數據，參比離子m/z為121.050 9和922.009 8，離子掃描范圍m/z 100～1 100。毛細管電壓3 500 V，碎裂電壓110 V，霧化氣壓力241 kpa，干燥氣為高純N2，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速11 L/min，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速9 L/min。二級質譜參數中碰撞能量設定為10～40 eV。樣品測試前，需用調諧液進行質量軸校準。

1.5 數據處理

液相-質譜聯用數據由Mass Hunter Acquisition（Agilent公司）采集，采集數據導入Mass Hunter定性分析軟件，將結果轉化成CEF格式文件，其中包含化合物的保留時間和質荷比信息。將CEF文件導入Mass Profiler Professional （MPP，Agilent Technologies，USA）軟件，進行濾噪、歸一化后，多變量數據進行主成分分析（Principal component analysis，PCA），將多維的數據壓縮成四維主成分（PCs）來描述數據內部的特征。分析PCA載荷圖（Loading plot），發現可作為生物標記物的化合物，予以鑒定。然后根據偏最小二乘判別分析（Partial least square discriminant analysis，PLSDA）法建立相關的預測模型。

2 結果

2.1 質控（QC）樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

尿液樣本進行檢測分析時每分析5個實驗樣本，用QC樣本分析一次，通過對所有QC樣本UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖進行疊加，可見QC樣本的重現性良好，檢測系統穩定。

2.2 精神分裂癥患者和正常人尿液UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

患者組及對照組尿液樣品經UHPLC-Q-TOF MS在正離子模式下進行檢測分析。圖1中曲線1為精神分裂癥患者組尿液混合液（隨機選取10個患者尿液標本各吸等量），曲線2為健康對照組尿液混合液（隨機選取10個健康對照尿液標本各吸等量）進樣的總離子流圖（Total ion current，TIC），在正離子模式下，二組色譜峰存在明顯的差別，推測兩組的尿液代謝成分中存在濃度差異物質（關于圖1的詳細解讀，見www.chsmzz.com）。

圖1 尿液混合液UHPLC-Q-TOF MS總離子流圖

圖2 樣本的PCA得分圖

2.3 數據分析

2.3.1 特征化合物的篩選 在Mass Hunter 軟件的分子特征識別模式下，共提取到653個化合物，通過Filter by Flag排除僅在一個樣本中出現的化合物，而不存在于其他樣本中，這些化合物沒有普遍性，不適用于統計學分析。剩下的328個化合物以出現頻率（frequency）為70%，變異系數（coefficient of variation，CV）小于30.0%，豐度（abundance）信號強度值為10 000.0～18 925 010.0進行過濾篩選，共得到167個化合物。

2.3.2 主成分分析（PCA） 以篩選后的167個化合物為基礎，采用主成分分析考察精神分裂癥患者和健康人群尿液代謝物變化，圖2顯示樣本的PCA得分圖，共得到4個主成分，PC1、PC2、PC3、和PC4的貢獻率分別為45.06%、7.95%、6.6%和4.73%，累計貢獻率為64.34%。PCA圖中每一個點表示一個對應樣本，經過對圖中的精神分裂癥患者組尿液樣本、健康對照組尿液樣本，質控樣本進行分析可知，患者組基本聚在一起，與對照組之間的分離明顯。每個樣本所處位置由自身的代謝決定，相同病理生理狀態下的樣本通常具有相似代謝物，所以在得分圖上也處于相似位置，彼此間距離越遠，表明其病理生理狀態相差越大（關于圖2的詳細解讀，見www.chsmzz.com）。

2.3.3 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 前面的非監督PCA統計中，可觀察到兩組有明顯分離趨勢。使用有監督式方法PLSDA進行建模分析，以進一步尋找差異物質，分析顯示精神分裂癥患者組和健康對照組的樣本可完全區分，所建立的模型穩定，預測率也很高，代表模型預測率Q2＝0.96，具有較好的預測能力。

2.3.4 潛在標志物鑒定 表1是根據精確分子量、串聯質譜結果以及與數據庫比對，進行的生物標記物鑒定，譜庫篩選了7個表征標記物，從而提示精神分裂癥患者的糖、脂、氨基酸等代謝通路均發生了紊亂，可能在MS的發生發展中有重要的作用[4]。

3 討論

尿液中葡萄糖、丙氨酸含量顯著異常，提示腎小管對低分子量化合物重吸收的異常，是腎臟損傷的重要標志[5-6]。馬尿酸及馬尿酸前體物質由腸道菌群代謝產生，腸道環境的改變導致兩組馬尿酸差異[7]。吡咯啉羧酸（Pyrroline hydroxycarboxylic acid）在羥脯氨酸氧化酶作用下，可氧化生成谷氨酸和吡咯啉烷羥基羧酸[8]。因此，吡咯啉羧酸的異常提示精神分裂癥組脯氨酸代謝通路異常。而脯氨酸由谷氨酸合成，是蛋白膠原的主要成分，而膠原作為動脈粥樣硬化斑塊的主要成分，在冠心病的不穩定性和發展過程中發揮重要作用。二氫神經鞘氨醇是神經酰胺的重要合成前體，而神經酰胺參與血管緊張素Ⅱ誘導內皮細胞凋亡，可能通過內皮細胞損傷影響機體的血壓狀態[9]。因此，二氫神經鞘氨醇的異常提示精神分裂癥組患者的血壓異常可能與二氫神經鞘氨醇的磷脂代謝相關，與MS的發病緊密相關。

代謝組學可通過質譜、核磁共振等技術，對代謝物質的代謝途徑以及這些物質產生代謝變化的規律采集數據，讓數據表達成代謝指紋圖譜，再利用化學計量學方法對信息深入提取與挖掘。代謝組學的研究對象為生物體液，例如血液、尿液、唾液、膽汁等。人類代謝組學研究通過檢測人體內代謝物成分的變化來顯示人體在疾病或藥物的作用下代謝網絡之變化規律[10]。本文即為應用UPLC-Q-TOF MS技術的代謝組學方法，并結合多元統計分析精神分裂癥患者和健康對照組的尿液代謝譜圖變化情況的研究。結果表明，精神分裂癥患者的尿液代謝譜與正常對照組有顯著差異。通過譜庫篩選，對可能的代謝差異物進行鑒定，發現了多種標記物。從代謝物組學的角度分析精神分裂癥患者合并MS的發生和發展機制，為MS早期篩查及早期臨床診治提供依據。同時，本研究為小樣本量的初步研究，后續研究需增加樣本例數，評估精神分裂癥患者的疾病分期和臨床癥狀，探討精神分裂癥患者代謝差異物與所服用的精神科藥物相關性，并且從精神分裂癥患者首診開始跟蹤代謝物的差異和變化，以更好地為臨床治療提供支持和依據。

表1 基于UHPLC-Q-TOF MS的尿液代謝差異物

[1]吳文源. 精神分裂癥患者代謝綜合征的預防[J]. 中華精神科雜志，2014，47（3）：171-172.

[2]Yang CY，Lo SC，Peng YC. Prevalence and predictors of metabolic syndrome in people with schizophrenia in inpatient rehabilitation wards[J]. Biol Res Nurs，2016，18（5）：558-566.

[3]Yue R，Zhao L，Hu Y，et al. Rapid-resolution liquid chromatography TOF-MS for urine metabolomic analysis of collagen-induced arthritis in rats and its applications[J]. J Ethnopharmacol，2013，145（2）：465-475.

[4]譚慶榮. 精神分裂癥伴發代謝綜合征的處理[J]. 中華精神科雜志，2014，47（3）：172-173.

[5]皮子鳳，門麗慧，張靜，等. 五味子治療大鼠糖尿病腎病作用機制的血清代謝組學研究[J]. 分析化學，2015，43（2）：169-175.[6]董飛俠，黃迪，何立群，等. Ⅲ期慢性腎病腎陽虛證患者尿液代謝組學特征的研究[J]. 中華中醫藥雜志，2008，23（12）：1109-1113.

[7]王娟，李中峰，趙慧輝，等. 冠心病不穩定心絞痛血瘀證患者尿液代謝組學特征的研究[J]. 北京中醫藥大學學報，2012，35（4）：284-288.

[8]Zimmerli LU，Schiffer E，Zurbig P，et al. Urinary proteomics biomarkers in coronary artery disease[J]. Mol Cell Proteomics，2008，7：290.

[9]張潔，嚴麗娟，林琳，等. 基于UPLC-oa-TOF-MS的糖尿病及糖尿病腎病的代謝組學研究[J]. 高等學校化學學報，2008，29（11）：2171-2173.

[10]Kim OY，Lee JH，Sweeney G. Metabolomic profiling as a useful tool for diagnosis and treatment of chronic disease：focus on obesity，diabetes and cardiovascular diseases[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther，2013，11（1）：61-68.

Study on Urine Metabonomics of Schizophrenia Patients by UHPLC-Q-TOF MS

ZHENG Huifei1 WANG Wenqiang1 LAI Guoyin2 LIU Farong1 ZHANG Jiaxin1 XU Zhizhong1 HE Jue1 1 Laboratory of Mental Health, Xiamen Xianyue Hospital, Xiamen Fujian 361012, China; 2 Laboratory of Food Chemistry, Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen Fujian 361026, China

Objective An ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometric (UHPLC-Q-TOF MS)method is developed for the study on metabolic variations of urine from schizophrenia patients and healthy volunteers.And the study will provide a scienti fi c basic for early screening of schizophrenia comorbied with metabolic syndrome. Methods The urine samples would analyze after they were diluted and fi ltered, then principal component analysis method was used on the collected data.Results A total of 7 characterization markers were selected and the structural identi fi cation was carried out.PLS-DA was used for group differentiation and potential biomarkers selection. As shown in the scores plot, the distinct clustering among schizophrenia patients and healthy volunteers was observed. Conclusion It is suggested that the metabolic pathways such as carbohydrate,lipid and amino acid in schizophrenia can be disturbed, and show the metabolic disturbance in schizophrenia patients may play an important role in the development of metabolic syndrome.

schizophrenia; metabolome; UPLC; TOF MS

R965

A

1674-9316（2017）27-0155-04

10.3969/j.issn.1674-9316.2017.27.082

福建省衛生計生委青年科研課題項目（2014-2-77）

1福建省廈門市仙岳醫院精神衛生研究室，福建 廈門361012；2廈門出入境檢驗檢疫局技術中心食品理化實驗室，福建 廈門 361026

王文強