親和吸附材料應(yīng)用于血液灌流治療外源性?xún)?nèi)毒素血癥的安全性研究*

向勇平，崔輝，于杰，劉丹，劉理金，周立冬，楊建明，劉愛(ài)兵

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，北京 100039；2.武警總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039；3.天津市陽(yáng)泉醫(yī)療器械有限公司，天津 300350；4.災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100039；5.天津市港口醫(yī)院，天津 300350）

親和吸附材料應(yīng)用于血液灌流治療外源性?xún)?nèi)毒素血癥的安全性研究*

向勇平1，崔輝2，于杰3，劉丹2，劉理金4，周立冬4，楊建明5，劉愛(ài)兵2

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，北京 100039；2.武警總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100039；3.天津市陽(yáng)泉醫(yī)療器械有限公司，天津 300350；4.災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100039；5.天津市港口醫(yī)院，天津 300350）

目的評(píng)估課題組研發(fā)的親和吸附材料特異清除外源性?xún)?nèi)毒素的安全性。方法15只比格犬靜脈輸注內(nèi)毒素（Sigma）復(fù)制內(nèi)毒素血癥模型，隨機(jī)分為治療組（n=10）和對(duì)照組（n=5），治療組用課題組研發(fā)的一次性血液灌流器進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組不用該灌流器。實(shí)驗(yàn)前后監(jiān)測(cè)生命體征并于灌流開(kāi)始、灌流60及120 min采集血液標(biāo)本檢測(cè)生化、血常規(guī)和凝血功能。結(jié)果治療組體溫及呼吸在灌流后逐步下降，對(duì)照組則上升。灌流開(kāi)始、灌流120 min治療組血小板（PLT）為（222.50±14.19）×109/L、（199.00±18.18）×109/L，對(duì)照組為（233.91±12.22）×109/L、（222.07±7.62）×109/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；灌流開(kāi)始、灌流120 min治療組白細(xì)胞（WBC）為（7.14±0.10）×109/L、（6.10±0.19）×109/L，對(duì)照組為（7.17±0.11）×109/L、（5.52±0.54）×109/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、球蛋白（GLO）治療組灌流120 min與灌流開(kāi)始比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流120 min均下降；對(duì)照組灌流120 min與灌流開(kāi)始比較，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流120 min均上升。尿素（Urea）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）治療組灌流120 min后呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組則輕微上升。結(jié)論該親和吸附材料清除實(shí)驗(yàn)犬血液中的內(nèi)毒素具有安全性。

親和吸附材料；血液灌流；比格犬；內(nèi)毒素血癥；安全性

細(xì)菌釋放大量的內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，或輸入含有大量?jī)?nèi)毒素感染的液體，從而引發(fā)的一種病理表現(xiàn)稱(chēng)為內(nèi)毒素血癥（endotoxemia，ETM）[1]。臨床上治療ETM的主要方式之一是清除血液中的內(nèi)毒素，SHOJI等[2]通過(guò)血液灌流（hemoperfusion，HP）來(lái)清除血液中的內(nèi)毒素取得了顯著的效果，有研究證實(shí)[3]，不同的吸附材料對(duì)內(nèi)毒素敏感程度不同，然而不同材料的HP對(duì)人體的副作用也不盡相同。由本課題組研發(fā)的高分子吸附材料制備而成的一次性血液灌流器，已在內(nèi)毒素的清除實(shí)驗(yàn)中取得了效果，本文將探究該材料的安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 親和吸附材料 使用由天津市陽(yáng)權(quán)醫(yī)療器械有限公司用低密度聚合物特異性親和高分子吸附材料制成的一次性血液灌流器（DHC-II-340），該灌流器供本課題犬血液灌流使用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南，并通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。成年比格犬15只，體重（39±1.8）kg（由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），制造內(nèi)毒素血癥模型后隨機(jī)分為治療組（n=10）和對(duì)照組（n=5），治療組用本課題組研發(fā)的一次性血液灌流器進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組不用該灌流器。

1.1.3 主要儀器與試劑 心電監(jiān)護(hù)儀（深圳邁瑞科技有限公司ipM12），大型動(dòng)物麻醉機(jī)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)ZS-M），內(nèi)毒素（美國(guó)Sigma 公司L2880），生化分析儀（日本日立公司7180），全自動(dòng)血凝儀（日本積水公司 CP2000）。

1.2 內(nèi)毒素血癥模型的復(fù)制

犬禁食、水12 h后，用大型動(dòng)物麻醉機(jī)將犬麻醉。內(nèi)毒素0.45 mg/kg溶入生理鹽水100 ml中經(jīng)靜脈30 min完成輸注。

1.3 血液灌流的治療

灌流器肝素化的處理：?jiǎn)?dòng)血泵，用含有肝素的生理鹽水沖洗灌流器，排除灌流管道和灌流器中的空氣。灌流治療：內(nèi)毒素輸注完45 min后，分離犬左側(cè)股動(dòng)脈，連接灌流導(dǎo)管、血泵和灌流器，形成閉合體外循環(huán)通路，對(duì)復(fù)制模型后的犬使用1次性血液灌流器進(jìn)行灌流。灌流120 min后，采用空氣回血法讓血液流回犬體內(nèi)，縫合傷口。

1.4 生命體征的監(jiān)測(cè)

在復(fù)制模型前及灌流前后監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)犬的體溫、呼吸頻率等生命體征。

1.5 血液標(biāo)本的采集與送檢

在灌流開(kāi)始、灌流60及120 min采集靜脈血，送解放軍254醫(yī)院做血常規(guī)、凝血及生化分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生命體征的比較

復(fù)制模型前、灌流開(kāi)始、灌流60及120 min實(shí)驗(yàn)犬體溫、呼吸頻率監(jiān)測(cè)見(jiàn)圖1。復(fù)制模型后實(shí)驗(yàn)犬體溫、呼吸頻率都上升直到灌流開(kāi)始，治療組灌流60 min后體溫和呼吸頻率與灌流開(kāi)始比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流60 min后均有所下降；對(duì)照組灌流120 min后體溫、呼吸頻率與灌流開(kāi)始比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流120 min后均上升。經(jīng)灌流120 min后治療組體溫比較平穩(wěn)（37.5±0.63）℃，呼吸頻率也保持在（26.85±0.69）次/min。

2.2 血常規(guī)的比較

治療組、對(duì)照組灌流開(kāi)始、灌流60及120 min血常規(guī)各指標(biāo)的變化見(jiàn)表1。治療組與對(duì)照組灌流開(kāi)始、灌流60及120 min相應(yīng)的血常規(guī)指標(biāo)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的白細(xì)胞（WBC）有差別（F=7.542，P=0.011），紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）及血小板（PLT）無(wú)差別（P＞0.05）；②治療組與對(duì)照組的WBC、PLT有差別（F=8.658和119.802，P=0.021和0.000），RBC、Hb無(wú)差別，治療組與對(duì)照組相比WBC量高，PLT量低；③治療組和對(duì)照組 WBC、RBC、Hb、PLT 變化趨勢(shì)無(wú)差別（P＞0.05）。

2.3 血生化的比較

治療組與對(duì)照組灌流開(kāi)始、灌流120 min肝腎功能各指標(biāo)見(jiàn)圖2。治療組灌流120 min與灌流開(kāi)始比較，肝腎功能各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流120 min均下降（見(jiàn)圖2A、B）；對(duì)照組肝腎功能各指標(biāo)灌流120 min與灌流開(kāi)始比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），灌流120 min都有所上升（見(jiàn)圖2C、D）。

2.4 凝血指標(biāo)的比較

治療組、對(duì)照組灌流開(kāi)始、灌流60及120 min對(duì)凝血各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)見(jiàn)表2。治療組與對(duì)照組灌流開(kāi)始、灌流60及120 min相應(yīng)的凝血指標(biāo)比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的凝血酶原時(shí)間（PT）有差別（F=5.892，P=0.021），治療組、對(duì)照組灌流前后PT縮短；凝血酶時(shí)間（TT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、纖維蛋白原（FIB）無(wú)差別（P＞0.05）；②治療組與對(duì)照組的PT、TT、APTT、FIB無(wú)差別（P＞0.05）；③治療組與對(duì)照組的PT、TT、APTT、FIB變化趨勢(shì)無(wú)差別（P＞0.05）。

2.5 電解質(zhì)的比較

治療組、對(duì)照組血清中 K+、Na+、Cl-、Ca2+、P3-、Mg2+及二氧化碳結(jié)合力（ECO2）的水平在灌流前后各時(shí)間點(diǎn)都趨于平穩(wěn)狀態(tài)，且各指標(biāo)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 3。

圖1 兩組體溫及呼吸頻率變化比較

表1 兩組灌流前后血常規(guī)的比較 （±s）

表1 兩組灌流前后血常規(guī)的比較 （±s）

WBC（×109/L） 7.17±0.11 6.60±0.17 5.52±0.54 RBC（×1012/L） 6.05±0.18 5.80±0.23 5.73±0.45 Hb（g/L） 144.80±4.38 146.00±6.36 150.60±5.50

圖2 兩組灌流前后肝腎功能各指標(biāo)變化

表2 兩組灌流前后凝血指標(biāo)的比較 （±s）

表2 兩組灌流前后凝血指標(biāo)的比較 （±s）

PT/s 12.51±0.53 11.98±0.46 12.09±0.42 TT/s 16.25±0.29 16.44±0.44 16.23±0.11 APTT/s 25.72±0.91 25.07±0.10 25.40±0.38

表3 兩組灌流前后電解質(zhì)指標(biāo)的比較 （±s）

表3 兩組灌流前后電解質(zhì)指標(biāo)的比較 （±s）

灌流開(kāi)始 4.39±0.24 135.56±0.93 112.20±1.40 2.27±0.12 1.81±0.06 0.83±0.05 23.52±0.25

3 討論

臨床上針對(duì)ETM的治療主要有血液置換，藥物控制，灌流吸附清除[4]。藥物治療中多采用多黏菌素B破壞致病菌（革蘭陰性菌）膜的通透性減少內(nèi)毒素的釋放源[5]，但是在殺滅的致病菌本身也會(huì)釋放部分內(nèi)毒素而引起反跳效應(yīng)，同時(shí)多黏菌素B也可以結(jié)合細(xì)胞膜的磷脂從而破壞機(jī)體細(xì)胞的完整性與穩(wěn)定性致使細(xì)胞溶解，使其使用受限[6]，因此HP應(yīng)用于臨床血液毒素的清除已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注[7-8]。灌流中灌流材料與血液直接接觸要具備如下要求[9]：無(wú)毒、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)對(duì)機(jī)體安全，理化學(xué)性能穩(wěn)定與血液接觸耐磨不發(fā)生形變脫落更無(wú)化學(xué)反應(yīng)，有良好的血液相容性，效果明顯等。本課題組選擇親水單烯和疏水芳香雙烯單體制得“雙親性”大孔共聚物，再引入間隔臂將此共聚物與含大量氨基酸的配基相連制成“雙親型”親和吸附材料，可以滿(mǎn)足以上要求。

實(shí)驗(yàn)中在復(fù)制模型后體溫、呼吸頻率都上升至灌流開(kāi)始，灌流開(kāi)始后治療組體溫、呼吸頻率有所下降并保持平穩(wěn)，對(duì)照組體溫、呼吸頻率保持上升趨勢(shì)直到灌流120 min。體溫、呼吸頻率的升降與犬體內(nèi)的內(nèi)毒素水平有關(guān)，治療組在灌流開(kāi)始后隨著內(nèi)毒素被清除，減輕了內(nèi)毒素的致熱作用導(dǎo)致了體溫下降，呼吸頻率穩(wěn)定。對(duì)照組中內(nèi)毒素持續(xù)作用致使體溫上升，呼吸頻率增快。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察灌流對(duì)血常規(guī)的影響，RBC、Hb在灌流前后沒(méi)有變化，提示灌流治療對(duì)RBC、Hb沒(méi)有影響；而WBC和PLT數(shù)量有所下降；內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致WBC貼壁，數(shù)小時(shí)內(nèi)造成周?chē)篧BC下降[2]，雖然灌流會(huì)清除血液中的內(nèi)毒素，但復(fù)制模型時(shí)血液中的內(nèi)毒素急劇升高，此過(guò)程就已經(jīng)對(duì)WBC產(chǎn)生了影響，對(duì)照組WBC下降程度大于治療組，這與治療組內(nèi)毒素的清除有關(guān)；HP和一定劑量的肝素都會(huì)影響PLT含量[10]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但WBC和PLT數(shù)的下降程度并不大且在可控范圍。

治療組肝功能中ALT、AST、ALP、TP、GLO，腎功能中的Urea、Cr、UA都下降，而治療組中的相應(yīng)指標(biāo)則持續(xù)上升，說(shuō)明內(nèi)毒素可使肝腎功能各指標(biāo)上升，但隨著治療組HP對(duì)內(nèi)毒素的清除，解除了內(nèi)毒素對(duì)肝腎的直接損傷導(dǎo)致各指標(biāo)下降。治療組、對(duì)照組血清中 K+、Na+、Cl-、Ca2+、P3-、Mg2+及 ECO2等電解質(zhì)各指標(biāo)都趨于平穩(wěn)，說(shuō)明沒(méi)有出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂。灌流過(guò)程中PT有所縮短但APTT、TT、FIB都趨于正常，這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]肝素會(huì)延長(zhǎng)PT、APTT相矛盾，因此針對(duì)凝血功能的作用有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本課題組研發(fā)的親和吸附材料通過(guò)灌流治療清除血液中的內(nèi)毒素，對(duì)血常規(guī)影響甚微，對(duì)肝臟、腎臟具有保護(hù)作用，沒(méi)有出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂和血液凝集異常。結(jié)果表明，親和吸附材料應(yīng)用于HP治療外源性ETM副作用小，具有安全性。

[1]蔣慶軍. 內(nèi)毒素檢測(cè)在內(nèi)毒素血癥治療中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 17(33): 5229-5232.

[2]SHOJI H. Extracorporeal endotoxin removal for the treatment of sepsis: endotoxin adsorption cartridge (Toraymyxin)[J]. Ther Apher Dial, 2003, 7(1): 108-114.

[3]ANISIMOVA N Y, GROMOVA E G, KUZNETSOVA L S, et al.Dynamics of elimination of bacterial endotoxins and cytokines from the blood of tumor patients with sepsis in hemoperfusion using carbon adsorbents[J]. Bull Exp Biol Med, 2011, 151(5): 622-624.

[4]曾振國(guó), 劉芬. 高容量血液濾過(guò)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷犬肺表面活性蛋白的影響[J]. 中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué), 2006, 12(18):25-26.

[5]安茂竹, 孫靜, 孟建中. 內(nèi)毒素吸附[J]. 國(guó)際移植與血液凈化雜志, 2007, 3(5): 8-10.

[6]RUDNICK M R, GOLDFARB S, WEXLER L, et al. Nephrotoxicity of ionicand nonionic contrastmedia in 1196 patients: a randomized trial. The iohexol cooperative study[J]. Kidney Int, 1995, 47(1):254-261.

[7]AOKI H, KODAMA M, TANI T, et al. Treatment of sepsis byextracorporeal elimination of endotoxin using polymyxin B-immobilized fi ber[J]. Am J Surg, 1994, 167(4): 412-417.

[8]STAUBACH K H, BOEHME M, ZIMMERMANNM, et al.Anewendotoxin adsorption device in gram-negative sepsis: use of immobilizedalbumin with the MATISSE adsorber[J]. Transfus Apher Sci, 2003, 29(1): 93-98.

[9]田爽, 李濤. 用血液灌流治療內(nèi)毒素血癥的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志, 2009, 32(1): 50-54.

[10]趙彬, 梅丹, 李擁軍, 等. 肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥[J]. 中國(guó)藥師, 2007, 10(8): 822-824.

[11]趙嵩, 安蓮英, 彭麗霞, 等. 子癇前期患者應(yīng)用低分子肝素鈉輔助治療對(duì)其凝血功能及腎功能的影響[J]. 疑難病雜志,2016, 15(7): 716-719.

Safety of af fi nity adsorption material used in hemoperfusion in treatment of exogenous endotoxemia*

Yong-ping Xiang1, Hui Cui2, Jie Yu3, Dan Liu2, Li-jin Liu4, Li-dong Zhou4,
Jian-ming Yang5, Ai-bing Liu2
(1. Postgraduate Traning Base in General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Jinzhou Medical University, Beijing 100039, China; 2. Medical Experimental Center, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China; 3. Tianjin Yangquan Medical Instrument Limited
Company, Tianjin 300350, China; 4. Beijing Key Laboratory of Disaster Rescue Medicine, Beijing 100039, China; 5. Tianjin Port Hospital, Tianjin 300350, China)

ObjectiveTo evaluate the safety of affinity adsorption material for the removal of exogenous endotoxin.MethodsFifteen beagle dogs were randomly divided into treatment group (n= 10) and control group(n= 5) after intravenous infusion of endotoxin. The treatment group was treated with a blood perfusion apparatus developed by our team, while the control group did not use it. Vital signs were monitored before and after the experiment. Blood samples were collected to detect the biochemical indexes, blood routine and coagulation function at the beginning of perfusion, after perfusion for 60 and 120 min.ResultsAfter treatment, the body temperature and respiratory rate of the treatment group gradually decreased, while those of the control group increased. At the beginning of perfusion and 120 min of perfusion, PLT was (222.50 ± 14.19) × 109/L and (199.00 ± 18.18) × 109/L in the treatment group, and (233.91 ± 12.22) × 109/L and (222.07 ± 7.62) × 109/L in the control group, there were signi fi cant differences between the two groups (P＜ 0.05); WBC was (7.14 ± 0.10) × 109/L and (6.10 ± 0.19) × 109/L in the treatment group, and (7.17 ± 0.11) × 109/L and (5.52 ± 0.54) × 109/L in the control group, there were signi fi cant differences between the two groups (P＜ 0.05). Liver function indexes including ALT, AST, ALP, TP and GLO of the treatment group at 120 min of perfusion were signi fi cantly lower than those at the beginning of perfusion (P＜ 0.05),while the indexes of the control group at 120 min of perfusion were higher than those at the beginning of perfusion(P＜ 0.05). Renal function indices including urea, creatinine and uric acid also showed downward trends after perfusion for 120 min in the treatment group, while increased slightly in the control group.ConclusionsIt is safe to remove the endotoxin in the blood of the dog by af fi nity adsorption material.

af fi nity adsorption material; hemoperfusion; beagle dog; endotoxemia; safety

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.002

1005-8982（2018）01-0006-05

2017-02-23

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（No：2015AA033904）

劉愛(ài)兵，E-mail：doctor_liuaibing@aliyun.com

R-332

A

（張蕾 編輯）