MMP-9和COX-2基因多態性與慢性阻塞性肺疾病的相關性研究

門翔，尚喜雨

（1.河南省南陽市中心醫院 呼吸內科，河南 南陽 473000；2.南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473000）

MMP-9和COX-2基因多態性與慢性阻塞性肺疾病的相關性研究

門翔1，尚喜雨2

（1.河南省南陽市中心醫院 呼吸內科，河南 南陽 473000；2.南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473000）

目的探討MMP-9和COX-2基因多態性與慢性阻塞性肺疾病的關系。方法選取71例慢性阻塞性肺疾病患者（COPD組）和同期63例急性呼吸道感染和健康體檢者（NC組）作為研究對象，PCRRFLP法測定MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）多態性，分析不同基因型與COPD的關系。結果NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因、COX-2（1195G＞A）的GG、AA基因型差異有統計學意義（P=0.010和0.021），G、A等位基因頻率差異有統計學意義（P=0.000）。MMP基因R279Q位點的G等位基因頻率基因 1195G＞A 位點的 A 等位基因頻率為COPD的危險因素。MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關性（P=0.015、0.018、0.009、0.009，0.021、0.017、0.015和0.000）。結論MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點多態性為COPD的危險因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下降及MMP-9、COX-2升高相關。

慢性阻塞性肺疾病；基質金屬蛋白酶9；環氧化酶2；基因多態性

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是以持續氣道阻塞為臨床表現的一種慢性進展性疾病，氣道和肺內對有害物質有慢性炎癥反應增強的表現[1]。目前，COPD死亡率居全球第4位，世界疾病經濟負擔指數居全球第5位，該病嚴重危害人民的健康。COPD的發病機制十分復雜，環境和遺傳因素日益受到重視。研究發現[2]，炎癥反應貫穿COPD的發生發展過程。有報道指出，基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、環氧化酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）與COPD的發生密切相關[3-4]，但目前對于MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD的關系研究報道較少。本研究旨在探討上述2種基因多態性與COPD的關系，從而為臨床基因靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2015年1月-2016年4月在南陽市中心醫院呼吸科住院診治的COPD患者71例（COPD組），其中，男性49例，女性22例，年齡45～76歲，平均（64.22±7.08）歲，通過體格檢查、詢問病史、胸部CT或X射線胸片同時結合肺功能、心電圖等證實為COPD，所有患者均符合2007年版《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的診斷標準；另選取同一時期在本院呼吸科門診就診的急性呼吸道感染和健康體檢者63例（NC組），其中，男性40例，女性23例，年齡42～71歲，平均（62.41±6.89）歲，均未出現慢性咳嗽、咳痰、氣短史等，經胸部CT或X射線胸片和肺功能（FEV1/FVC＞70%）檢查排除COPD。

1.2 一般臨床資料及生化指標檢測

詢問并記錄所有受試對象年齡、性別、吸煙史、吸煙指數，記錄肺功能指標：第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（percentage of forced expiratory volume in 1 second，FEV1%pred），FEV1/FVC（受試對象吸入支氣管擴張劑沙丁胺醇15 min后檢測）。抽取患者外周靜脈血5 ml，置于含有乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的真空管中，離心后獲得血漿，采用ELISA檢測血漿中MMP-9。

1.3 外周血標本及DNA提取

采集受試對象外周靜脈血5 ml，置于含有EDTA的真空管中，-80℃冰箱中保存。取血樣標本2 ml，采用基因組DNA快速提純試劑盒（Promega生物試劑公司，美國）提取DNA，保存于-40℃冰箱中備用。

1.4 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性應用

1.4.1 引物合成 按照相關文獻[5]設計引物，由上海英駿生物科技工程有限公司合成。采用Light Scanner Primer Design軟件設計MMP-9和COX-2基因相應位點引物，均采用小片段擴增引物。聚合酶鏈反應（PCR）引物：其中MMP-9（R279Q）（G）正向：5'-CATCGCTACTATTCTGGCCTTAAAGCGCATA-3'，反向：5'-GGCCTATAAGGGCCGAGCGGGTCGTAGGCC ATC-3'，PCR產物片段的長度在237 bp；COX-2（1195G＞A）（G）正向：5'-CCGGTACATGGCCTATTAAC GTGCATACGG-3'，反向：5'-CGTTGCGCAATGCTGAC CGATCA-3'，PCR產物片段的長度在124 bp。

1.4.2 目的基因擴增 PCR擴增體系為25 ml，其中含有5 ml PCR 混合物，正反向引物各0.5 ml，1 ml LC Green和1 ml DNA模板，剩余加入雙蒸水。MMP-9（R279Q）的擴增反應條件為：95℃預變性2 min，945℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 45 s，94℃變性30 s，30℃退火30 s，共計40個循環，完成后采用73℃延伸5 min，限制性內切酶為MspⅠ；COX-2（1195G＞A）的擴增反應條件為：95℃預變性2 min，93℃變性30 s，55℃退火30 s，73℃延伸45 s，93℃變性45 s，45℃退火30 s，共計40個循環，完成后采用72℃延伸5 min，限制性內切酶為RsaⅠ。取PCR產物10μl，在含有2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外線透射儀觀察PCR擴增是否成功，鑒定其特異性。全部測序均由ABI3100測序分析儀（美國ABI公司）完成。為準確測定基因分型結果，隨機選取10%的樣本采用直接測序法進行驗證。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，符合正態分布資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，計數資料以%表示，采用χ2檢驗。群體基因型采用Hardy-Weinberg平衡檢驗。基因多態性與COPD的遺傳效應之間的相關性采用非條件的Logistic回歸分析，并經多重檢驗P值的Bonferroni進行校正。ROC曲線分析MMP-9、COX-2對COPD的預測價值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料及生化指標檢測結果

兩組FEV1%pred、FEV1/FVC比較，差異有統計學意義（P=0.000），COPD組低于NC組，兩組MMP-9及COX-2比較，差異有統計學意義（P=0.000），COPD組高于NC組。見表1。

2.2 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型及擴增結果

MMP-9（R279Q）位點酶切中呈現1條亮的且長度為124 bp的條帶為AA型，出現58、66和124 bp 3條亮帶的為GA型，出現在58和66 bp 2條帶為GG型；COX-2（1195G＞A）位點酶切中呈現1條亮的且長度為237 bp的條帶為AA型，出現53、220和237 bp 3條亮帶的為GA型，出現在53和220 bp 2條帶為GG型。隨機選取MMP-9（R279Q）基因型、COX-2（1195G＞A）的PCR擴增產物行基因測序，結果顯示堿基的改變與酶切結果一致。見圖1。

2.3 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因型分布比較

NC 組 與 COPD 組MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）位點G、A等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明符合群體代表性。NC組與COPD組MMP-9（R279Q）基因GG、AA基因型差異有統計學意義（P=0.010），G、A等位基因頻率差異有統計學意義（P=0.000）；NC組與COPD組COX-2（1195G＞A）基因GG、AA基因型差異有統計學意義（P=0.021），G、A等位基因頻率差異有統計學意義（P=0.000）。見表2。

表1 兩組一般臨床資料及生化指標檢測結果

圖1 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因擴增電泳圖

2.4 COPD危險因素的多變量回歸分析

將臨床資料與生化檢測指標中差異有統計學意義的因素行多變量的Logistic回歸分析，以子COPD為因變量，以FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9和R279Q基因的G等位基因頻率、COX-2和1195G＞A的A等位基因頻率為自變量。結果顯示，FEV1%predR279Q基因的G等位基因頻率1195G＞A基因的A等位基因頻率為COPD的危險因素。

2.5 MMP-9、COX-2對COPD的預測價值

ROC曲線分析顯示，Youden指數在最大時，MMP-9、COX-2臨界值分別為 53.26μg/L、75.15 ng/ml，曲線AUC顯示，MMP-9、COX-2的AUC分別為0.754、0.779（P=0.017和0.012）。見圖2、表3。

2.6 MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）與COPD影響因素的關系

相關性分析結果顯示，MMP-9（R279Q）、COX-2（1195G＞A）基因多態性與FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關性（P=0.015、0.018，0.009、0.009，0.021、0.017、0.015 和 0.000）。見表 4。

表2 兩組MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）基因型分布比較

表3 MMP-9、COX-2診斷效能分析

表4 MMP-9（R279Q）、COX-2（1 195G＞A）與COPD影響因素的關系 例（%）

圖2 MMP-9、COX-2 的ROC曲線

3 討論

COPD是一種臨床表現為不完全可逆、呈進行性發展的氣流阻塞為特征的疾病，該病主要是由長期氣道阻塞導致患者肺泡缺氧以及二氧化碳潴留，引起肺血管收縮、肺血管重構，從而導致肺動脈高血壓、易出現COPD患者出現右心衰竭和死亡[6]。肺血管重塑是導致COPD進一步發生惡化的關鍵原因，導致肺血管重塑的原因有慢性炎癥、低氧或者缺氧等。低氧導致肺內高血壓，從而促進肺動脈纖維母細胞和內皮細胞的促有絲分裂因子、生長因子的釋放，而這些因子的釋放進一步促進平滑肌細胞、成纖維細胞的增殖并進一步刺激細胞外基質的產生，導致肺動脈血管壁增厚，加重氣道阻塞[7]。隨著分子生物學的不斷發展，環境和基因因素在COPD的發生、發展過程中存在著相互影響，關系很復雜。研究COPD的易感基因其相關因素對于防治COPD具有重要意義：①通過研究COPD的易感基因可以確定COPD發生發展的相關基因，從而尋找基因治療的靶點；②對易感基因人群進行早期篩查和診斷，有助于早期應用藥物進行干預，同時根據不同個體制定個體化COPD治療方案。

COPD的發病機制目前尚不清楚。基質金屬蛋白酶（MMPs）是蛋白酶/抗蛋白酶系統中的重要成員，與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）、高血壓、2型糖尿病、肺癌、COPD以及腫瘤轉移等有一定的關系[8]，MMPs成員中MMP-1、9和12均與COPD、肺氣腫的發生發展密切相關，其中MMP-9是位于染色體20q11和2q13.1，具有13個外顯子和9個內含子[9]。目前有研究報道[10]，MMP-9基因C-1 562T位可能存在C突變成T，而這種突變將影響到MMP-9基因的轉錄從而引發疾病，也有研究證實了MMP-9基因R279Q位點多態性可能為COPD易感性的危險因素。本研究在以往研究的基礎上，證實了MMP-9基因R279Q位點多態性與COPD相關，值得提出的是本研究進一步探討了MMP-9基因R279Q位點A突變成G基因與FEV1%pred、FEV1/FVC降低以及MMP-9、COX-2升高相關，說明MMP-9基因R279Q位點多態性對COPD患者肺功能、炎癥反應有明顯的刺激作用，導致COPD的發生發展。

COX-2是由花生四烯酸代謝過程中的重要限速酶，在前炎癥因子的刺激下，機體處于驗證狀態后其呈高表達[11]。有文獻報道指出，COX-2與多種炎性介質相互參與了COPD患者氣道炎癥反應過程，如IL-1、MMP-2、MMP-9等[12]，這也是本研究選擇COX-2、MMP-9作為研究對象的原因，旨在探討二者相互作用促進COPD的發生發展。COX-2基因的表達及其穩定性受到啟動子區和3’端非編碼區的多種轉錄調控因子的影響，因此其調控區域可能存在多態性改變從而影響基因表達，進而改變機體對疾病的易感性。目前有研究報道指出[13]，COX-2基因765G＞C位點基因多態性可能為COPD的易感基因位點。目前對于COX-2基因1195G/A基因位點與與膀胱癌、老年人阿司匹林抵抗有關[14]，而與COPD的關系研究報道較少。通過本研究發現，COX-2基因1195G＞A的A等位基因頻率為COPD的危險因素，進一步研究證實發現，COX-2（1195G＞A）基因多態性 與 FEV1%pred、FEV1/FVC、MMP-9及COX-2具有相關性，說明MMP-9基因R279Q位點多態性對COPD患者肺功能、炎癥反應有明顯的刺激作用，導致COPD的發生發展。

需要指出的是，本研究采用ROC曲線分析MMP-9、COX-2對COPD的預測價值，主要有2個方面的原因：①MMP-9、COX-2均已證實通過參與炎癥反應，導致COPD的發生發展，通過繪制ROC曲線分析2者在COPD中的預測價值，為臨床診斷COPD進程提供依據；②繪制ROC曲線，分析獲得MMP-9、COX-2的最佳臨界值，從而有利于臨床COPD的發生，也便于MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點與MMP-9、COX-2的關系研究。

綜上所述，MMP-9基因R279Q位點、COX-2基因1195G＞A位點多態性為COPD的危險因素，與FEV1%pred、FEV1/FVC下 降 及MMP-9、COX-2升高相關。

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Association ofMMP9andCOX2gene polymorphisms with chronic obstructive pulmonary disease

Xiang Men1, Xi-yu Shang2(1. Department of Respiratory Medicine, Nanyang City Center Hospital, Nanyang, Henan 473000, China;2. Nanyang Medical College, Nanyang, Henan 473000, China)

ObjectiveTo investigate the relationship betweenMMP9andCOX2gene polymorphisms and chronic obstructive pulmonary disease.MethodsA total of 71 patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD group) and 63 cases of acute respiratory infection and healthy persons as the objects of study. PCR-RFLP method was used to determine the polymorphisms ofMMP9(R279Q) andCOX2(1195G＞A). The relationships between different genotypes and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) were analyzed.ResultsDifferences inMMP9gene R279Q and GG and AA genotypes ofCOX2(1195G＞A) between the NC group and the COPD group had statistical significance (P= 0.010 and 0.021), the differences in the frequency of G and A alleles had statistical significance (P= 0.000). The G allele frequency atMMP9R279Q locusand the A allele frequency ofCOX2gene 1195G＞A locuswere the risk factors for COPD.MMP9R279Q andCOX21195G＞A polymorphisms had correlations with FEV1%pred, FEV1/FVC, MMP-9 and COX-2 (P= 0.015, 0.018, 0.009, 0.009, 0.021, 0.017, 0.015 and 0.000 respectively).ConclusionsMMP9gene R279Q andCOX2gene 1195G＞A polymorphisms are the independent risk factors for COPD, and correlated with decrease of FEV1%pred and FEV1/FVC and increase of MMP-9 and COX-2.

chronic obstructive pulmonary disease; matrix metalloproteinase 9; cyclooxygenase 2; gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.010

1005-8982（2018）01-0050-06

2017-02-16

尚喜雨，E-mail：shangxiyu163@163.com；Tel：13525660096

R563.9

A

（張西倩 編輯）