花生過敏原初步分離純化及紫外光譜分析

段筱筠，張愛琳，2，苗 穎，2，陳丹香，李志文，2*

（1天津農學院食品科學與生物工程學院；2天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384）

花生過敏原初步分離純化及紫外光譜分析

段筱筠1，張愛琳1，2，苗 穎1，2，陳丹香1，李志文1，2*

（1天津農學院食品科學與生物工程學院；2天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384）

以新鮮花生仁為原料，采用丙酮和乙醚交替脫脂，PBS浸提、硫酸銨分級沉淀，再經過透析袋處理小分子蛋白和鹽離子，獲得的蛋白通過葡聚糖凝膠Sephadex G-100凝膠柱分離純化，得到花生中的主要過敏原蛋白。結果表明：該花生過敏蛋白的得率為13.5%；SDS-PAGE電泳測得花生過敏蛋白的分子量大約為15 kD和60 kD；紫外分光光度檢測顯示在210 nm處有最大吸收峰，且峰型單一，結合光學特征分析表明花生過敏原蛋白結構中含有雙鍵或三鍵結構。

花生；過敏原；分離；純化，紫外掃描

花生具有滋養補益、延年益壽的功效，其作為一味中藥，在治療營養不良、脾胃失調、咳嗽痰喘、乳汁缺少等癥狀上有明顯的作用。花生的種子蛋白含量占其種子干重的23%—33%［1］，但這些蛋白中含有很多致敏蛋白，會引起由IgE介導的過敏反應，并導致機體生理功能紊亂或組織損傷。目前，從花生中已經分離出11種花生過敏原，按照國際過敏原統一命名標準分別為 Ara h1、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5、Ara h6、Ara h7、Ara h8、Ara h9、Ara h10和Ara h11［2］。Ara hl占花生蛋白總量的12%—16%，它是分子量為63.5 kD的糖蛋白［3］，等電點為4.55［4］。食品過敏原檢測與評價是食品安全的一個重要方面［5］，目前還沒有針對花生過敏的特效療法，堅果過敏患者嚴格避免食入含堅果的食物是最佳選擇，因此堅果檢測就顯得尤為重要。理論上，堅果中任何一種蛋白都有可能是過敏原，目前普遍認為主要過敏原是糖蛋白。作為一種常見的過敏原食物，花生引起的過敏占食物過敏的1%—20%［6］。由此可見，花生所引起的過敏嚴重影響了部分人群的生活質量。此外，中國協和醫科大學變態反應科對就診人群的調查表明，北京地區約有4%的食物過敏患者對花生過敏［7］。花生致敏蛋白依舊是當今以及未來食品、醫學、變態反應學研究的重要內容。本試驗對花生中的蛋白質進行分離純化，測定其蛋白質含量，以期為臨床花生過敏性疾病的特異性診斷進一步開展分子生物學研究奠定基礎，也為低致敏原或無過敏原花生的研制及花生過敏癥的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用花生購于天津市西青區紅旗農貿農產品批發市場。

試劑及儀器設備為：考馬斯亮藍G-250，上海藍季科技發展有限公司；牛血清白蛋白、85%磷酸（分析純），天津市北方天醫化學試劑廠；Sephadex G-100、β-巰基乙醇（分析純），天津市雙船化學試劑廠；聚乙二醇20000（分析純），天津市江天化工技術有限公司；CBS-B程控多功能全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；BT-100N數顯恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司；LGR20-W高速冷凍離心機，北京京立離心機有限公司；S21-2磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生粉末的制備

稱取適量的花生，徹底除去紅衣外皮后，放入高速組織搗碎機中研磨成粉末（粉末應達到40目篩要求），稱取170 g粉末，轉移到大燒杯中。

1.2.2 花生脫脂

將上述花生粉末與丙酮按1∶3（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂2 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與丙酮按1∶2.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂1 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與無水乙醚按1∶1.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂1 h，然后靜置1 h，去除上清液；所得沉淀與丙酮按1∶0.5（W/V）混合，用磁力攪拌器在4℃條件下脫脂0.5 h，然后靜置0.5 h，去除上清液；所得沉淀在通風櫥中靜置過夜，使有機溶劑充分揮發干凈。

1.2.3 花生浸提

（1）將上述脫脂花生粉和預冷的含有0.05%EDTA·2Na和0.01 mol/Lβ-巰基乙醇的0.01 mol/L PBS（pH 7.4）的混合溶液按照1∶3（W/V）混合，在4℃條件下用磁力攪拌器緩慢攪拌過夜。（2）浸提液在4℃、13 000 g條件下離心20 min，分別合并上清液和沉淀。（3）將上述沉淀用PBS溶解后，繼續用PBS抽提4 h。（4）將浸提液在4℃、13 000 g條件下離心20 min，合并于（2）中的上清液。

1.2.4 硫酸銨分級沉淀

（1）向花生去脂提取液中加入67 g硫酸銨粉末，使硫酸銨的質量分數達到25%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；然后在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀1，收集全部上清液，即25%原液。在所得上清液中加入73 g硫酸銨粉末，使得硫酸銨的質量分數達到50%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；接著在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀2，收集全部上清液，即50%原液。在所得上清液中加入79.5 g硫酸銨粉末，使得硫酸銨的質量分數達到75%，邊攪拌邊緩慢加入，使硫酸銨徹底溶解，在0℃下放置4 h；最后在11 000 g、4℃條件下離心30 min，得沉淀3，收集全部上清液，即75%原液。（2）將上述得到的3種沉淀分別裝入事先處理過的8 000—14 000 kD分子量透析孔的透析袋中，用透析夾封口，放入蒸餾水中進行透析，期間多次更換透析液，直到用1%氯化鋇溶液在透析液中檢測，不產生絮狀沉淀為止。

1.2.5 聚乙二醇濃縮

在透析得到的目標蛋白液表面于4℃下覆蓋一層薄薄的聚乙二醇（PEG，Mr20 000），待透析袋表面的聚乙二醇因吸水變濕后輕輕抹去聚乙二醇，按照上述過程對3個梯度的沉淀分別進行濃縮，濃縮至25%硫酸銨分級沉淀最終收集11.5 mL，50%硫酸銨分級沉淀最終收集10.5 mL，75%硫酸銨分級沉淀最終收集10 mL。

1.2.6 凝膠柱純化

用凝膠柱Sephadex G-100進行分離純化。操作參數為：上樣前用PBS溶液先洗脫平衡2個柱體積，再上樣，上樣體積為1 mL，上樣流速為1 mL/min，共洗脫2個柱體積，利用自動分布收集器自動收集。每種沉淀收集20個離心管，每管5 mL。

1.2.7 考馬斯亮藍法測定蛋白含量［8］

1.2.7.1 牛血清標準品蛋白含量的測定

取6支干凈的試管，按表1的要求分別加入所需試劑，搖勻，暗處靜置5 min后，立即在595 nm條件下用可見分光光計測其吸光度，繪制標準曲線，用蒸餾水調零。

表1 牛血清標準品蛋白含量測定所需試劑Table 1 Reagent needed for determ ination of protein content in standard bovine serum

2.1.7.2 樣品蛋白含量的測定

凝膠柱層析之前，用蒸餾水調零，在干凈管中分別加入1 mL稀釋10倍的樣品和5 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，暗處靜置5 min后，立即在595 nm條件下用可見分光光度計測其吸光度。

凝膠柱層析之后，用PBS調零，在干凈管中分別加入1 mL樣品和5 mL考馬斯亮藍溶液，搖勻，暗處靜置5 min后，立即在595 nm條件下用可見分光光度計測其吸光度。

1.2.8 紫外分光光度計檢測花生過敏蛋白

選取經考馬斯亮藍測得蛋白含量較高的樣品，用PBS稀釋10倍之后，以PBS調零，于紫外分光光度計上測其波峰，確定花生過敏蛋白質種類。

1.2.9 SDS-PAGE凝膠電泳檢測花生中蛋白質分子量的分布［9］

①準備標品及樣品；②制備分離膠和濃縮膠；③上樣；④電泳；⑤染色；⑥脫色；⑦凝膠成像。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的標準曲線

以牛血清中蛋白質含量為橫坐標、OD595值為縱坐標繪制牛血清中蛋白質的標準曲線。由圖1可見，牛血清蛋白質含量的標準曲線方程為y＝0.0064x+0.0411，R2＝0.9852，線性相關。根據此標準曲線，可以計算出待測蛋白的含量。

圖1 蛋白質標準曲線圖Fig.1 Standard curve of protein

2.2 硫酸銨鹽析后的蛋白質含量

通過硫酸銨鹽析可使溶液中蛋白質含量減少，隨著硫酸銨濃度的增加，蛋白質含量顯著下降，即不同濃度的硫酸銨可以分離不同分子量的蛋白質，具有明顯的分離效果。結合牛血清蛋白的標準曲線可以計算出25%硫酸銨分級沉淀中的蛋白質含量為16.491 mg，50%硫酸銨分級沉淀中的蛋白質含量為15.057 mg，75%硫酸銨分級沉淀中的蛋白質含量為14.26 mg。根據鹽溶鹽析規則，25%硫酸銨飽和溶解的花生蛋白在經過鹽溶鹽析處理過程后，計算出花生中蛋白質的最終得率為13.5%。

2.3 凝膠柱純化之后的蛋白質含量

由圖2a可以看出：2號管蛋白質含量比較多；由圖2b可以看出：4號管蛋白質含量比較多；由圖2c可以看出：3、4號管蛋白質含量比較多；可以進一步測定其波峰，確定蛋白質種類。同時可以看出，所分離出來的蛋白質含量峰值出現在2—5號管；由凝膠分離的特性可知，所分離的蛋白質分子量較大。

圖2 不同濃度硫酸銨分級沉淀蛋白含量Fig.2 Fractionated precipitation protein content of ammonium sulfate with different concentrations

2.4 紫外分光光度計測定結果

2.4.1 凝膠柱純化之前

由圖3可知，25%、50%原液的峰譜圖峰值較多，即所含有的蛋白質種類較復雜；75%原液的峰譜圖峰值較少，即所含有的蛋白質種類較簡單。其中25%原液在399 nm處有最大吸收峰2.7215；50%原液在431 nm處有最大吸收峰2.2445；75%原液在358 nm處有最大吸收峰1.4447；表明利用不同飽和濃度的硫酸銨可以獲得花生蛋白質的不同組分。

圖3 凝膠層析前蛋白峰譜Fig.3 Protein peak spectra before gel chromatography

2.4.2 凝膠分離純化之后

由圖4可知，花生過敏蛋白在210 nm附近有最大吸收峰。可以判定，所測物質的結構中含有雙鍵或三鍵，符合蛋白質的結構。蛋白質波峰單一且較明顯，提示經凝膠柱層析后，花生過敏蛋白質得以純化。

圖4 蛋白純化峰譜Fig.4 Peak spectra of protein purification

2.4.3 花生過敏原SDS-PAGE鑒定分析

由圖5可知，經SDS-PAGE鑒定，4號管的蛋白主要有2條帶，其中一條分子質量為43—66 kD，與Ara h1蛋白分子量相符；另一條為14—20 kD，與Ara h2蛋白分子量相符。另外，也有少量的雜蛋白條帶。

圖5 75%硫酸銨分級純化后4號管的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE electrophoresismap of No.4 tube after classification and purification of 75%ammonium sulfate

3 結論

本試驗以市售花生仁為材料，經去脂、浸提、硫酸銨分級沉淀及透析等方法獲得不同分子量的蛋白質，結果表明蛋白質得率為13.5%；通過凝膠柱的分離純化獲得花生的主要蛋白質，并對其進行紫外光譜檢測，結合電泳方法確定花生中的主要過敏原蛋白質是Ara h1和Ara h2。在210 nm處有最大吸收峰，且峰型單一，光學特征表明花生過敏原蛋白結構中含有雙鍵或三鍵結構。

［1］廖斌，盧春斌，王蕾，等.花生種子發育和萌發過程中貯藏蛋白的合成和降解［J］.植物生理與分子生物學學報，2004，30（1）：115-118.

［2］FINKELMAN F D.Peanut allergy and anaphylaxis［J］.Current Opinion in Immunology，2010，22：783-788.

［3］PARK CW，KIM G，LEE C.A comparison study on allergen components between Korean（Arachis fasgigiata Shinpung）and American peanut（Arachis hypogaea Runner）［J］.Korean Med Sci，2000，15（4）：387-392.

［4］BURKSAW.Identification of amajor peanut allergen，Ara hI，in patientswith atopic dermatitis and positive peanut challenges［J］.Allergy Clin Immunol，1991，88（2）：172-177.

［5］黃欽田，馬建吟，陳丙鶯.油菜花粉變應原的分離純化及變應原性實驗研究［J］.免疫學雜志，1995，11（1）：20-22.

［6］EMMETT SE，ANGUSF J，FRY JS，etal.Perceived prevalence of peanutallergy in Great Britain and its association with other atopic conditions and with peanut allergy in other household members［J］.Allergy，1999，54（4）：380-385.

［7］李宏.花生變應原研究［D］.北京：中國協和醫科大學，2000.

［8］李娟，張耀庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白質含量［J］.中國生物制品學，2000，13（2）：118-120.

［9］盧婷.毛蚶酶解液及營養評價［D］.鄭州：鄭州大學，2013.

Prelim inary separation and purification and ultraviolet spectrum analysis of peanut allergens

DUAN Xiao-yun1，ZHANG Ai-lin1，2，MIAO Ying1，2，CHEN Dan-xiang1，LIZhi-wen1，2*

（1College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University；2Tianjin Engineering and Technology Center of Agricultural Products Processing，Tianjin300384，China）

Taking fresh peanuts as raw material，through alternately degreasing with acetone and ether，PBS extraction，fractionated precipitation with ammonium sulfate，treating small molecule protein and salt ions by dialysis bag，separation and purification by Sephadex G-100 gel column，the main allergens in peanuts were obtained.The results showed that the yield of peanut allergens was 13.5%；the molecular weight of peanut allergensmeasured by SDS-PAGE electrophoresiswas about15 kD and 60 kD.UV spectrophotometry showed that there was amaximum absorption peak at 210 nm，and the peak type was single.Combined with optical feature analysis，there were double or triple bond structure in peanut allergen protein.

Peanut；Allergen；Separation；Purification；UV scan

2016-04-14

天津市優秀博士后國際化培養計劃（2015018）；2015年大學生國家創新項目（201510061088）

段筱筠（1996—），女，本科，主要從事食品安全檢測技術研究。E-mail：1569667215＠qq.com

*通信作者：李志文（1981—），女，博士，副教授，研究方向：食品科學

R392.8

A

1000-3924（2017）06-091-05

閆其濤）