痛舒膏巴布劑作用及致敏性研究※

萬思琦 魏宇斐 徐 延 徐京育

(黑龍江中醫藥大學臨床醫學院2017級碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

實驗研究

痛舒膏巴布劑作用及致敏性研究※

萬思琦 魏宇斐 徐 延1徐京育△

(黑龍江中醫藥大學臨床醫學院2017級碩士研究生，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的探討痛舒膏巴布劑的鎮痛抗炎作用及致敏性。方法將50只豚鼠隨機分為5組，即痛舒膏巴布劑高劑量組(外貼痛舒膏，5.73 g生藥/kg)，痛舒膏巴布劑中劑量組(外貼痛舒膏，3.82 g生藥/kg)，痛舒膏巴布劑低劑量組(外貼痛舒膏，1.91 g生藥/kg)，地塞米松組(外貼巴布劑基質貼劑，地塞米松0.000 81 g/kg)，賦形對照組(外貼巴布劑基質貼劑)，每組10只，每日予相應藥物貼于足底至足趾部位，并用無刺激性紗布及膠布固定，外敷6 h，7 d后用甲醛法致炎，測定豚鼠足腫脹度及血清中前列腺素E2(PGE2)和β-內啡肽(β-EP)的含量。將30只豚鼠隨機分為3組，即痛舒膏巴布劑組(外貼痛舒膏，3.82 g生藥/kg)，賦形對照組(外貼巴布劑基質貼劑)，陽性藥物組(2,4-二硝基氯代苯)，每組10只，痛舒膏巴布劑組貼藥于豚鼠背部左側脫毛區，賦形對照組貼藥于豚鼠背部左側脫毛區，陽性藥物組在豚鼠背部左側脫毛區涂抹1%的2,4-二硝基氯代苯0.2 mL外敷6 h，在第7 d和第14 d用同樣方法給藥。末次致敏后14 d，在3組動物背部右側脫毛區給藥，痛舒膏巴布劑組和賦形對照組給藥方法同前，陽性藥物組涂抹0.1%的2,4-二硝基氯代苯0.2 mL，并用無刺激性紗布膠布固定，通過致敏接觸和激發接觸給藥進行皮膚過敏實驗。結果甲醛致炎實驗中，與賦形對照組比較，痛舒膏巴布劑高、中、低劑量組和地塞米松組能明顯降低豚鼠足腫脹度(P<0.05,P<0.01)。致敏實驗中，根據皮膚致敏性評分標準，痛舒膏巴布劑組動物皮膚受試區自激發給藥后72 h內均未出現異常反應，致敏發生率為0.0±0.0。結論痛舒膏巴布劑具有很好的抗炎鎮痛作用，在一定范圍內具有濃度依賴性，且痛舒膏巴布劑對豚鼠皮膚無致敏作用，臨床用藥安全。

動物；豚鼠；超敏反應；鎮痛；中醫藥療法

痛舒膏巴布劑是由黑龍江省名老中醫李延教授總結多年臨床實踐所得的經驗方，由延胡索、金錢白花蛇、川芎等多味中藥組成，具有行氣活血、消瘀散結、通絡止痛的功效。痛舒膏巴布劑依據內病外治的治療原則，采用經皮給藥系統，以水溶性高分子化合物作為基質，與中藥提取物制成中藥貼敷劑[1]。因中藥巴布劑具有載藥量大、透氣性好、保濕型好、對皮膚無刺激性、可反復揭貼等優點[2]，具有廣闊的發展前景。本實驗采用甲醛致炎法對豚鼠足跖關節及軟組織造成急性損傷和致炎，從而探究痛舒膏巴布劑的抗炎鎮痛作用。依據巴布劑基質原料選擇條件，應著重檢測材料對皮膚的刺激性，降低變態反應[3]，通過豚鼠致敏實驗對痛舒膏巴布劑進行安全性評價，為臨床合理用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 80只清潔級豚鼠，體質量(200±30)g，雌雄各半，購于哈爾濱醫科大學實驗動物學部，動物生產許可證號：SCXK(黑)2013-001。

1.1.2 藥物與試劑 痛舒膏巴布劑(由延胡索、金錢白花蛇、葛根、雞血藤、木瓜、白芍、姜黃、川芎、僵蠶、地龍、羌活、三七、炙甘草、穿山龍等合并煎煮，濃縮成稠膏，以氫氧化鋁、檸檬酸、明膠、甘油等采用均勻設計法制成巴布劑，哈爾濱制藥六廠,批準文號：黑衛健用字(2003)第017號)、地塞米松注射液(鄭州卓峰制藥有限公司，國藥準字H41020055)、2,4-二硝基氯代苯(美國sigma公司)、甲醛(上海源葉生物公司)、水合氯醛(上海源葉生物公司)、前列腺素E2(PGE2)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(北京普博斯生物公司)、β-內啡肽(β-EP)ELISA檢測試劑盒(北京普博斯生物公司)。

1.1.3 實驗儀器 全自動酶標儀Infinite F50(瑞士TECAN公司)、高速冷凍離心機GL10M(凱特實驗儀器有限公司)、電熱恒溫水浴箱HH-W600(瑞華儀器制造有限公司)、電子分析天平FA2104S(上海恒平科學儀器有限公司)、游標卡尺、手術線、毫米尺、手術器械等。

1.2 方法

1.2.1 甲醛致炎實驗操作[4]取50只豚鼠，雌雄各半，隨機分為5組，即痛舒膏巴布劑高劑量組(外貼痛舒膏，5.73 g生藥/kg)、中劑量組(外貼痛舒膏，3.82 g生藥/kg)、低劑量組(外貼痛舒膏，1.91 g生藥/kg)，地塞米松組(外貼巴布劑基質貼劑，地塞米松0.000 81 g/kg)，賦形對照組(外貼巴布劑基質貼劑)，每組10只，每組受試動物予相應藥物貼于足底至足趾部位，并用無刺激性紗布及膠布固定，避免藥物因豚鼠行走舔舐等原因脫落。外敷6 h，連續7 d。7 d后用5%的甲醛0.1 mL皮下注入豚鼠足跖部。

1.2.2 致敏實驗操作 將30只豚鼠隨機分為3組，即痛舒膏巴布劑組(外貼痛舒膏，3.82 g生藥/kg)，賦形對照組(外貼巴布劑基質貼劑)，陽性藥物組(2,4-二硝基氯代苯)，每組10只。將3組動物于給受試藥物前24 h背部兩側脫毛3 cm×3 cm。首先致敏，痛舒膏巴布劑組貼痛舒膏巴布劑2 cm×2 cm于豚鼠背部左側脫毛區，賦形對照組貼巴布劑基質貼劑2 cm×2 cm于豚鼠背部左側脫毛區，陽性藥物組在豚鼠背部左側脫毛區涂抹1%的2,4-二硝基氯代苯0.2 mL，給藥后用無刺激性紗布及膠布固定，避免豚鼠因疼痛舔舐引起中毒。6 h后將殘留藥物用溫水洗凈。在第7 d和第14 d用同樣方法給藥。末次致敏后14 d，在3組動物背部右側脫毛區給藥，痛舒膏巴布劑組和賦形對照組給藥方法同前，陽性藥物組涂抹0.1%的2,4-二硝基氯代苯0.2 mL，并用無刺激性紗布膠布固定。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 甲醛致炎實驗檢測指標

1.3.1.1 足跖關節及軟組織腫脹度的測定[5]測量方法針對豚鼠參照文獻[5]做了改進，于0 h(注射甲醛前)、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h分別測定豚鼠足跖關節處周長及足跖軟組織腫脹處厚度(每次測定位置固定)，并計算腫脹率=(致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度)/致炎前足跖厚度×100%。以足跖關節處周長變化及腫脹率作為觀察指標。

1.3.1.2 豚鼠血清PGE2和β-EP水平的測定[6]各組豚鼠用7%的水合氯醛豚鼠腹腔注射0.5 mL/100g，麻醉后由腹主動脈取血，采用ELISA法測定豚鼠血清PGE2和β-EP水平，具體操作流程嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.3.2 致敏實驗檢測指標 6 h后去掉受試藥并溫水洗凈殘留藥物。即刻觀察并記錄1、24、48及72 h皮膚出現紅斑、水腫情況，同時觀察動物是否有流涕、哮喘、噴嚏、站立不穩、休克等現象。評分按照文獻[7]的評分標準進行評分(見表1、表2)。

過敏反應平均值=(紅斑形成總分+水腫形成總分)/合計動物數

致敏反應發生率=有過敏反應動物數(無論程度輕重)/合計動物數×100%

表1 皮膚反應程度評分標準

表2 皮膚致敏性評分標準

2 結 果

2.1 甲醛致炎實驗結果

2.1.1 各組不同時間跖周長比較 見表3及圖1。

表3 各組不同時間足跖周長比較

與賦形對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05

由見表3及圖1可見，在足跖關節周長測定中，受試藥物組足跖腫脹從2 h后開始逐漸緩解消退，賦形對照組足跖腫脹從4 h后開始逐漸緩解消退。與賦形對照組比較，痛舒膏巴布劑高、中劑量組和地塞米松組能明顯降低豚鼠足跖關節腫脹度(P<0.05,P<0.01);痛舒膏巴布劑高劑量組作用效果優于地塞米松組(P<0.05),痛舒膏巴布劑中劑量組抗炎效果與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05),痛舒膏巴布劑低劑量組作用效果較地塞米松組弱(P<0.05);其中各劑量巴布劑組兩兩比較，隨著劑量的增加，豚鼠足跖關節腫脹緩解度越大(P<0.05)。

圖1 豚鼠足跖周長變化折線圖

2.1.2 各組不同時間足跖腫脹率比較 見表4。

由表4可見，在腫脹率的測定中，豚鼠足底軟組織腫脹從2 h后開始逐漸緩解消退。與賦形對照組比較，痛舒膏巴布劑高、中劑量組和地塞米松組能明顯降低豚鼠軟組織腫脹度(P<0.05,P<0.01);痛舒膏巴布劑高劑量組效果優于地塞米松組(P<0.05),痛舒膏巴布劑中劑量組作用效果與地塞米松組相當(P>0.05),痛舒膏巴布劑低劑量組作用效果較地塞米松組弱(P<0.05);其中各劑量巴布劑組兩兩比較，隨著劑量的增加，豚鼠足底軟組織腫脹緩解度越大(P<0.05)。

表4 各組不同時間足跖腫脹率比較

與賦形對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05

與賦形對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與地塞米松組比較，△P<0.05

由表5可見,與賦形對照組比較，痛舒膏巴布劑高、中、低劑量組與地塞米松組豚鼠血清中PGE2含量均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，同時痛舒膏巴布劑高劑量組PGE2含量明顯低于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑低劑量組PGE2含量高于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑中劑量組PGE2含量與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與賦形對照組比較，痛舒膏巴布劑高、中、低劑量組與地塞米松組豚鼠血清中β-EP含量均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，同時痛舒膏巴布劑高劑量組β-EP含量明顯高于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑低劑量組β-EP含量低于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑中劑量組β-EP含量與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組不同時間致敏發生率比較 見表6。

表6 各組不同時間致敏發生率比較 分，

由表6可見，陽性藥物組動物皮膚受試區均出現不同程度的過敏反應，皮膚出現紅斑及水腫，甚至出現站立不穩等現象，致敏發生率達100%，表現為極度致敏性。痛舒膏巴布劑組和賦形對照組動物皮膚受試區自激發給藥后72 h內均未出現異常反應，致敏發生率為0.0±0.0，實驗表明：痛舒膏巴布劑對皮膚無致敏性。

3 討 論

軟組織損傷是由于筋骨和脈絡的損傷，血離經脈，凝聚成瘀，瘀積不散，經絡受阻，氣血不通，腫痛即作[8]。臨床研究發現，五倍子膏巴布劑在臨床使用中對于患者頭痛、挫傷、骨病及風濕類疾病療效顯著[9]。研究表明，β-EP具有較強的中樞及外周鎮痛作用，其鎮痛機制是通過抑制神經元的痛覺傳導和傷害性感受器的興奮，從而抑制疼痛信息的傳遞[10]。PGE2是一種重要的疼痛介質，組織在收到損傷和炎癥時局部可釋放出PGE2等炎性致痛物質引起疼痛，且PEG2可直接刺激神經末梢引起疼痛，提高痛覺感受器對其他致痛因子的敏感性[11]。本實驗通過測定甲醛致炎后各組豚鼠血清中PGE2和β-EP的水平，結果表明痛舒膏巴布劑高、中、低劑量組與地塞米松組豚鼠血清中PGE2含量較賦形對照組均明顯降低(P<0.05)，同時痛舒膏巴布劑高劑量組PGE2含量明顯低于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑低劑量組PGE2含量明顯高于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑中劑量組PGE2含量與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明痛舒膏巴布劑對軟組織損傷引起的炎性反應有明顯的抑制作用，一定程度上呈劑量依賴性，且痛舒膏高劑量組的抗炎作用優于地塞米松組，痛舒膏巴布劑中劑量組與地塞米松組抗炎作用程度相當，低劑量組的效果較地塞米松組差。豚鼠足跖關節周長及腫脹率的測定從宏觀數據上印證了該結論。在β-EP的測定中，痛舒膏巴布劑高、中、低劑量組與地塞米松組豚鼠血清中β-EP含量均明顯升高(P<0.05)，同時痛舒膏巴布劑高劑量組β-EP含量明顯高于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑低劑量組β-EP含量低于地塞米松組(P<0.05)，痛舒膏巴布劑中劑量組β-EP含量與地塞米松組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明痛舒膏巴布劑具有明顯的鎮痛效果，一定程度上呈劑量依賴性，且痛舒膏巴布劑高劑量組鎮痛作用優于地塞米松組。

現代醫學中各種軟組織和關節疾病，如風濕性關節炎、腰肌勞損、肩關節周圍炎、頸椎病等均屬于中醫學痹證范疇。其病機主要為邪氣痹阻經脈，即風、寒、濕、熱、痰、瘀等邪氣滯留于肢體筋脈、關節、肌肉、筋脈，氣血閉阻不通，不通則痛。清代王清任強調血瘀發病的重要性，治療上擬定以活血化瘀為主的身痛逐瘀湯，擴充了痹證方劑的思路。痛舒膏巴布劑方中延胡索為活血化瘀、行氣止痛之妙品，能行血中氣滯，故專治一身上下諸痛；川芎活血行氣，祛風止痛，與延胡索配伍，既能行血中之氣，又能行氣中之血，氣暢血行，通則不痛；雞血藤活血舒筋，養血調經，白芍養血柔肝，緩急止痛，二者配伍，共奏和血養血、通絡止痛之效；金錢白花蛇祛風通絡，定驚止痙，地龍熄風止痙，通經活絡，羌活發散風寒，勝濕止痛，三藥合用，增加祛濕除痹、通絡止痛之力；木瓜祛風舒筋，除濕通絡；三七散瘀止血，活血定痛；穿山龍祛風除濕，消癰散結。全方配伍精妙，對于痹證所致的筋脈拘攣、氣血瘀滯、為腫為痛具有良好的效果。

巴布劑通過透皮給藥系統，可直接作用于靶部位發揮療效，在較長時間內維持恒定的血藥濃度，降低藥物的毒副作用，臨床用藥方便[12-13]。巴布劑非常適合中藥多組分、大劑量的用藥特點，其發展潛力巨大[14]。2000年版《中華人民共和國藥典》將巴布劑收入制劑通則，并在2015年版《中華人民共和國藥典》第四部將“巴布劑”更名為“凝膠貼膏”，進一步規范了相應的質量標準[15]。本巴布劑對傳統藥物劑型進行了改革，充分體現活血化瘀、舒筋活絡、行氣止痛的思想，嚴格按照巴布劑的制備工藝標準，制成透皮給藥貼劑。以往軟組織損傷，中藥治療多用傳統的中藥與飴糖等介質調和而成的外敷藥膏，雖然損傷部位也能直接給藥、費用少、療效明顯，但臨床應用污染衣物，且不易攜帶，同時易引起皮膚瘙癢、皮疹等過敏現象[16]。本實驗研究顯示，貼敷痛舒膏巴布劑的豚鼠均未出現紅斑、水腫等過敏反應，其致敏率為0，表明痛舒膏巴布劑在透皮給藥過程中安全性高，為后期進一步研究及臨床用藥提供安全依據。

[1] 馬曉輝.中藥透皮給藥系統的研究進展[J].中國實用醫藥，2015，10(2)：246-248.

[2] 孟凡敏，王延科，賀吉香.對近年國內中藥巴布劑體外透皮吸收研究進展綜述[J]，2016，18(2)：212-215.

[3] 張影，陳小勇.淺談中藥巴布劑的研究現狀[J].中醫藥信息，2015，32(5)：116-118.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京:人民衛生出版社，2006:107-109.

[5] 匡建軍，張信成,蔡萍,等.腫痛消巴布膏鎮痛抗炎作用實驗研究[J].新中醫，2012，44(2):113-115.

[6] 李永平，李向陽，灑玉萍，等.秦艽止痛巴布劑對大鼠佐劑性關節炎IL-1β、PGE2的影響[J].時珍國醫國藥，2013，24(2)：287-288.

[7] 朱文翔，劉原君，程發峰，等.麻芥平喘巴布劑皮膚用藥安全性實驗研究[J].北京中醫藥大學學報，2016，39(5)：372-375.

[8] 胡陽廣，竹劍平.傷痛巴布劑治療急性軟組織損傷93例臨床療效觀察[J].浙江中醫藥大學學報，2010，34(3)：320-321.

[9] 崔巖飛，馬國玲，胡欣，等.五倍子膏巴布劑治療肺結核盜汗臨床觀察[J].浙江中西醫結合雜志，2015，25(10)：930-932.

[10] 王洋.中藥止痛貼鎮痛藥效及作用機制的實驗研究[D].沈陽：遼寧中醫藥大學，2012.

[11] 羅燕，趙林鋼.清涼巴布劑鎮痛作用及其機制的實驗研究[J].江蘇中醫藥，2013，45(2)：74-75.

[12] 劉亞男，樊金偉.巴布劑的研究現狀及發展前景[J].黑龍江醫藥，2010，23(5)：766-768.

[13] 李光華.中藥巴布劑的研究現狀與展望[J].天津藥學，2016，28(4)：48-50.

[14] 白才堂，呂竹芬，謝清春，等.正交試驗優選竭紅跌打巴布劑基質處方[J].中國藥房，2011，22(31)：2911-2913.

[15] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015:22.

[16] 魏國俊，王志勇，董林，等.骨刺消巴布劑對大鼠急性軟組織損傷模型的治療作用及機理研究[J].西部中醫藥，2014，27(10)：14-16.

StudyontheeffectsandsensitizationofTongshugaocataplasm

WANSiqi*,WEIYufei,XUYan,etal.*

2017-GradeMasterofClinicalMedicalCollegeofHeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Heilongjiang,Haerbin150040

ObjectiveTo explore the analgesic and anti-inflammation effects of Tongshugao cataplasm.Methods50 guinea pigs were randomly divided into five groups. The high dosage of Tongshugao cataplasm group was treated with Tongshugao for external by 5.73 g/kg of crude drug, the middle dosage of Tongshugao cataplasm group was treated with Tongshugao for external by 3.82 g/kg of crude drug, the low dosage of Tongshugao cataplasm group was treated with Tongshugao for external by 1.91 g/kg of crude drug, the dexamethasone group was treated with substrate patch of cataplasm by 0.000 81 g/kg, the shaped control group was treated with substrate patch of cataplasm, and 10 guinea pigs in each group. And giving the external application of corresponding drugs affixed to plantar and toe parts with non-irritating gauze and tape fixed for 6 h in each group. After 7 d, formaldehyde method was used to induce inflammation. The feet swelling degree and the content of serum prostaglandin E2(PEG2) and β-endorphin (β-EP) in guinea pigs was measured. 30 guinea pigs were randomly divided into three groups. The Tongshugao cataplasm group was treated with Tongshugao for external by 3.82 g/kg of crude drug, the shaped control group was treated with substrate patch of cataplasm, and the positive drug group was treated with 2, 4-Dinitrochlorobenzene, and 10 guinea pigs in each group. The paste of Tongshugao cataplasm group and shaped control group were posted on the left hair removal area on back of guinea pig. The paste of positive drug group was posted on the left hair removal area on back of guinea pig with smear 0.2 mL of 1% 2, 4-Dinitrochlorobenzene for 6 h, and the same method was used on the 7thd and 14thd. On the 14thday after the last sensitization, administration was given to the left hair removal area on back of guinea pig in three groups. The administration in Tongshugao cataplasm group and shaped control group were as the same as the previous one, the positive drug group was treated with 0.2 mL of 0.2% 2, 4-Dinitrochlorobenzene and fixed with non-irritating gauze. The skin allergy test was conducted by sensitized contact and stimulated contact.ResultsIn the experiment of formaldehyde induced inflammation, compared with the control group, the high, middle, and low dosage of Tongshugao cataplasm group and the dexamethasone group can significantly reduce the foot swelling degree of guinea(P<0.05,P<0.01).In the experiment of sensitization, the animal skin test area in Tongshugao cataplasm group has no abnormal reaction since the onset of drug administration within 72 h, and the allergic reaction rate was 0.0±0.0.ConclusionTongshugao cataplasm has good effects of anti-inflammatory and analgesic, which in a certain range with a concentration-dependent, and Tongshugao cataplasm has no sensitized effect on guinea pigs skin, clinical drug application safety.

Animal; Guinea pig; Hypersensitivity; Analgesia;Traditional Chinese medicine therapy

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.12.021

R-332;R287;R392.33

A

1002-2619(2017)12-1852-06

※ 項目來源：黑龍江中醫藥大學科研基金項目(編號：035105)

△ 通訊作者：黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院心血管四科，黑龍江 哈爾濱 150040

1 黑龍江省哈爾濱市中醫醫院急診科，黑龍江 哈爾濱 150002

萬思琦(1993—)，女，碩士研究生在讀，學士。研究方向：中醫內科學。

2017-09-13)

董軍杰)