大鼠股骨Masquelet誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ偷慕?/h1>
2018-01-06 02:30:50曾志奎黃楓黃培鎮(zhèn)李悅蔡群斌周琦石姜自偉李定鄭升鵬
山東醫(yī)藥 2017年48期 關(guān)鍵詞：模型
曾志奎，黃楓，黃培鎮(zhèn)，李悅，蔡群斌，周琦石，姜自偉，李定，鄭升鵬
(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
·論著·
大鼠股骨Masquelet誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>
曾志奎1，黃楓2，黃培鎮(zhèn)2，李悅2，蔡群斌2，周琦石2，姜自偉2，李定1，鄭升鵬1
(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
目的建立一種用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀７椒ㄟx取雄性SD大鼠24只，隨機分為觀察組和對照組各12只。兩組均在股骨中段取出4 mm骨塊，均采用鋼板固定，觀察組置入PMMA骨水泥塊，對照組不置入骨水泥塊。統(tǒng)計兩組術(shù)后進(jìn)食、排便、行走、切口愈合及并發(fā)癥發(fā)生情況。造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍誘導(dǎo)膜組織及對照組截骨區(qū)誘導(dǎo)膜組織進(jìn)行HE染色，觀察組織病理學(xué)變化；對兩組術(shù)肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況，以及鋼板、螺釘在位情況。結(jié)果兩組術(shù)后均能正常進(jìn)食及排便，術(shù)后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組1只大鼠術(shù)后出現(xiàn)術(shù)肢持續(xù)腫脹、膝關(guān)節(jié)活動受限。觀察組誘導(dǎo)膜組織中含有大量細(xì)胞，形成豐富血管網(wǎng)及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導(dǎo)膜中所含血管明顯少于觀察組。兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。結(jié)論成功建立了用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀?/p>
骨缺損；誘導(dǎo)膜；Masquelet技術(shù)；大鼠
嚴(yán)重創(chuàng)傷、骨感染、慢性骨髓炎、骨不連、骨腫瘤保肢節(jié)段性切除等各種原因均可導(dǎo)致大段骨缺損。大段骨缺損治療難度大，帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等傳統(tǒng)治療方法均有不足[1～4]。2000年法國醫(yī)生Masquelet提出了“誘導(dǎo)膜”的概念即誘導(dǎo)膜技術(shù)，該技術(shù)是在骨缺損處填充PMMA骨水泥塊，4～6周骨水泥塊周圍形成誘導(dǎo)膜后，取出填充物植骨，有望應(yīng)用于治療大段骨缺損[5]。為深入研究誘導(dǎo)膜技術(shù)用于治療負(fù)重肢體骨缺損的可行性，建立精確、可重復(fù)性強的實驗?zāi)Ｐ椭陵P(guān)重要。國內(nèi)文獻(xiàn)對誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ蛨蟮郎跎?，國外文獻(xiàn)亦鮮有關(guān)于誘導(dǎo)膜模型精確截骨的描述。我們于2016年10月進(jìn)行本研究，擬建立一種用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀，F(xiàn)將制模過程及結(jié)果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料 ①動物：SPF級成年雄性SD大鼠24只，鼠齡 8～10周，體質(zhì)量260～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(粵)2013-0020。大鼠分籠飼養(yǎng)，4只/籠，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，光照時間晝14 h、夜10 h，自由進(jìn)水及飲食，1周后用于實驗。②器材：自制不銹鋼大鼠股骨截骨導(dǎo)板及自制不銹鋼6孔鋼板(圖1)，1.5 mm皮質(zhì)骨自攻螺釘(江蘇蘇州悅來醫(yī)療器械有限公司)、0.42 mm超細(xì)金剛砂鋸條(河北唐山鑫誠五金機電有限公司)，定制 0.5 mm克氏針(天津希翼瑞豐醫(yī)療器械有限公司)，JJ-12J組織脫水機、JB-P5生物組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，Leica Autostainer XL自動染色機(Leica Biosystems，德國)，Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)。
注：A為截骨導(dǎo)板，長15.37 mm、寬6 mm、高6 mm、厚1 mm，凹槽深5 mm；B為6孔鋼板，長22.5 mm、寬3.5 mm、厚1 mm。
圖1自制大鼠股骨鋼板及截骨導(dǎo)板
1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組12只。兩組禁食24 h、不禁水， 5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.8 mL/100 g)；取左側(cè)臥位，右腿備皮，75%乙醇消毒術(shù)區(qū)；股骨外側(cè)皮膚縱行切口，切開皮膚及筋膜，于股外側(cè)肌及股二頭肌肌間隙進(jìn)入，鈍性分離，自股骨大轉(zhuǎn)子至股骨髁顯露股骨外側(cè)面；放置6孔不銹鋼鋼板，調(diào)整好位置，使其位于股骨外側(cè)面中心，遠(yuǎn)近端各鉆入兩枚克氏針臨時固定；將第2、5兩孔的克氏針穿過截骨導(dǎo)板孔后放置截骨導(dǎo)板于鋼板上方，助手用兩把彎鉗固定導(dǎo)板并維持股骨位置，將線鋸穿過導(dǎo)板凹槽分別行遠(yuǎn)近端截骨至股骨高度2/3，不完全截斷；拔出第1孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第6孔同前；取出截骨導(dǎo)板，再拔出第2孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第5孔同前；鋼板完全固定后，重復(fù)上述步驟將股骨遠(yuǎn)近端完全截斷，取出4 mm骨塊。將兩根1-0絲線穿過鋼板第3、4孔，觀察組在骨缺損區(qū)卡入PMMA骨水泥塊，絲線捆綁固定防止骨水泥塊移位，對照組不放置骨水泥塊。生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，采用強生 4-0Vicryl可吸收縫線依次縫合肌肉、深筋膜，1-0 絲線縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)5天每日給予青霉素(青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，160萬U/瓶，國藥準(zhǔn)字 H13020655)8萬U肌內(nèi)注以預(yù)防感染。術(shù)后禁水、禁食12 h，完全負(fù)重活動，單籠飼養(yǎng)4天至皮膚切口基本愈合后合籠。
1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①一般情況：觀察兩組術(shù)后進(jìn)食、排便、行走、切口愈合情況，統(tǒng)計術(shù)后4周內(nèi)并發(fā)癥發(fā)生情況。②誘導(dǎo)膜組織病理學(xué)觀察：造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍及對照組截骨區(qū)的誘導(dǎo)膜組織，10%甲醛固定48 h，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，組織切片機切取 5 μm厚薄片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。③截骨斷端影像學(xué)表現(xiàn)：造模4周時對兩組術(shù)肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況以及鋼板、螺釘在位情況。
2 結(jié)果
2.1 兩組一般情況 兩組術(shù)后均能正常進(jìn)食、排便，術(shù)后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組術(shù)后1只大鼠術(shù)肢持續(xù)腫脹、膝關(guān)節(jié)活動受限。
2.2 兩組誘導(dǎo)膜組織病理學(xué)改變 觀察組誘導(dǎo)膜組織中含有大量細(xì)胞，形成豐富的血管網(wǎng)及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導(dǎo)膜中所含血管明顯減少。
2.3 兩組截骨斷端影像學(xué)表現(xiàn) 術(shù)后4周時兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。
3 討論
目前，臨床治療節(jié)段性骨缺損的方法主要有帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等，但帶血管腓骨移植需局部顯微外科技巧、易損傷神經(jīng)血管；外支架骨搬運治療周期長，易導(dǎo)致針眼感染、對接端骨不連；自體髂骨移植供區(qū)骨量有限，可導(dǎo)致感染、血腫形成等[1～4]。Moghaddam等[6]報道，誘導(dǎo)膜技術(shù)可用于治療大段骨缺損。但隨著Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)的發(fā)展，暴露出骨源不足、骨爬行替代慢等問題；與骨組織工程技術(shù)有效結(jié)合可能是解決Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)上述不足的途徑[6～8]。建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)膜動物模型是研究其應(yīng)用的前提。既往報道的誘導(dǎo)膜動物模型存在截骨長度難掌控、固定物不牢靠、操作困難等問題[9,10]。故有必要建立一種穩(wěn)定、操作簡單的誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ汀?/p>
能否做到精確至毫米的截骨是影響誘導(dǎo)膜模型制模效果的重要因素。目前多數(shù)研究采用SD大鼠建立誘導(dǎo)膜模型，但大鼠骨骼細(xì)小，做到精確截骨非常困難。傳統(tǒng)先用克氏針打孔再截骨的方法往往容易導(dǎo)致骨骼劈裂甚至造模失敗。本課題組自行設(shè)計了截骨導(dǎo)板，并與鋼板有效結(jié)合，截骨端非常整齊，范圍精確，且操作方法容易掌握。
既往研究中對誘導(dǎo)膜骨缺損模型固定的方法主要有鋼板、髓內(nèi)釘、外支架、克氏針等[11～13]。Zhao等[13]采用單邊外支架成功制備了SD大鼠股骨極限骨缺損模型，經(jīng)12周觀察未見松動跡象，認(rèn)為這種外支架能為負(fù)重部位極限骨缺損的早期活動提供穩(wěn)定性保證。但外支架可導(dǎo)致針眼感染、周圍組織激惹等并發(fā)癥；同時，大鼠負(fù)重時外支架中不同克氏針的應(yīng)變將導(dǎo)致其周圍骨質(zhì)承受不同的應(yīng)力，一旦這種應(yīng)力達(dá)到極限可能導(dǎo)致局部骨溶解，引起外支架松動。Wingerter等[14]對比鋼板和克氏針固定SD大鼠股骨臨界骨缺損模型的效果，造模4周拆除內(nèi)固定物，組織學(xué)顯示克氏針組呈現(xiàn)出特有的纖維愈合模式，只有少量新生骨痂形成，固定的機械性不穩(wěn)定引起微動是纖維愈合產(chǎn)生的原因；鋼板組出現(xiàn)自缺損遠(yuǎn)近端向中心生長的自然內(nèi)向性新生骨痂，源于鋼板固定的臨界骨缺損模型為骨愈合提供了穩(wěn)定的愈合環(huán)境。有學(xué)者提出，髓內(nèi)釘不適合固定大鼠的股骨骨缺損，原因是操作困難、抗旋轉(zhuǎn)差、易出現(xiàn)術(shù)中骨折及鎖釘失效等并發(fā)癥[15]。骨折周圍的機械微環(huán)境對骨折愈合非常重要，其決定了骨折愈合的方式。機械環(huán)境如軸向、剪切、骨碎片間微動對骨修復(fù)均有影響。Heiner等[16]研究了鋼板和髓內(nèi)釘固定對SD大鼠股骨骨折愈合局部相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明大部分生長因子、神經(jīng)因子和造血因子等隨著骨折而出現(xiàn)mRNA表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn)，髓內(nèi)釘固定可明顯上調(diào)與軟骨、炎癥、細(xì)胞分化及乙酰膽堿相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，鋼板固定則上調(diào)與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[16]。
本研究采用鋼板固定誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ汀Ｒ驗檎T導(dǎo)膜組織在造模后第4周時新生血管活性最強，誘導(dǎo)膜中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)含量最高，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、TGF-β表達(dá)達(dá)到高峰[17～19]，故本研究在術(shù)后4周取材進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，術(shù)后4周X線顯示兩組鋼板、螺釘未見松動。HE染色顯示，觀察組形成有效的誘導(dǎo)膜組織；對照組形成的膜結(jié)構(gòu)中僅見少量血管，觀察組則形成更為豐富的血管網(wǎng)，符合文獻(xiàn)報道的典型誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)[20]。由此可見該誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ偷慕⒎桨甘强尚械?。但在整個造模過程需要注意的事項較多；此外，大鼠股骨直徑較小，術(shù)中操作空間有限，鋼板螺釘固定時往往只有一次機會，所以要非常謹(jǐn)慎。術(shù)中需注意以下細(xì)節(jié)：①鋼板放置時近端要稍偏向內(nèi)側(cè)，因外側(cè)大轉(zhuǎn)子非常薄，可供螺釘固定的長度非常短。②螺釘長度要合適，尤其是最近端及最遠(yuǎn)端螺釘要足夠長，一般不少于7 mm。因近端可能會打中小轉(zhuǎn)子，且遠(yuǎn)端靠近股骨髁為松質(zhì)骨。③于遠(yuǎn)端1/3分離肌肉間隙時注意保護血管。據(jù)文獻(xiàn)報道，大鼠此處有一恒定血管經(jīng)過，損傷此血管可導(dǎo)致大量出血[10]。本研究觀察組有1只大鼠傷及此血管，術(shù)后出現(xiàn)大腿血腫、膝關(guān)節(jié)伸直受限。④麻醉藥物濃度不宜太高。本課題組早期預(yù)實驗采用10%水合氯醛麻醉，大鼠術(shù)后出現(xiàn)腸麻痹，改用5%水合氯醛麻醉未出現(xiàn)此并發(fā)癥，且麻醉效果滿意，亦未發(fā)生呼吸停止、死亡等。⑤術(shù)后前4天大鼠需分籠飼養(yǎng)，1只/籠，以防止互相撕咬引起傷口感染，待傷口穩(wěn)定后合籠，建議4只/籠。經(jīng)過不斷的完善實驗流程和總結(jié)經(jīng)驗，本課題組已建立了一種相對成熟的大鼠股骨誘導(dǎo)膜造模方法，該方法具有以下優(yōu)點：①因截骨導(dǎo)板的距離固定為4 mm，故截骨長度非常精確；②操作簡單，學(xué)習(xí)曲線短，手術(shù)時間短，對動物的損傷?。虎鄄牧蟽r格低廉；④實驗動物術(shù)后麻醉清醒后即可完全負(fù)重活動。
綜上所述，本研究成功建立了用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ?，該模型具有操作簡單、可重?fù)性高、創(chuàng)傷小、易掌握、成本低等優(yōu)點，可用于研發(fā)大段骨缺損治療藥物及生物材料。
[1] Zeng Z, Yuan L, Jiang P, et al. Treatment of 10 year humeral shaft nonunion with segment bony defect: a case report [J]. Int J Clin Exp Med, 2016,9(10):20242-20246.
[2] Jiang Y, Guo YF, Meng YK, et al. A report of a novel technique: the comprehensive fibular autograft with double metal locking plate fixation (cFALP) for refractory post-operative diaphyseal femur fracture non-union treatment[J]. Injury, 2016,47(10):2307-2311.
[3] Aktuglu K, Günay H, Alakbarov J. Monofocal bone transport technique for bone defects greater than 5 cm in tibia: our experience in a case series of 24 patients[J]. Injury, 2016,47(Suppl 6):S40-S46.
[4] 李宗軍.骨搬移技術(shù)用于脛骨骨髓炎伴長段骨缺損臨床觀察[J].山東醫(yī)藥,2016,56(20):86-88.
[5] Masquelet AC, Fitoussi F, Begue T, et al. Reconstruction of the long bones by the induced membrane and spongy autograft[J]. Ann Chir Plast Esthet, 2000,45(3):346-353.
[6] Moghaddam A, Zietzschmann S, Bruckner T, et al. Treatment of atrophic tibia non-unions according to ′diamond concept′: results of one- and two-step treatment[J]. Injury, 2015,46(Suppl 4):S39-S50.
[7] Giannoudis PV, Faour O, Goff T, et al. Masquelet technique for the treatment of bone defects: tips-tricks and future directions[J]. Injury, 2011,42(6):591-598.
[8] 周思睿,鄧江.修復(fù)臨界及超臨界骨缺損的組織工程材料研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2016,56(48):103-105.
[9] Chu TM, Warden SJ, Turner CH, et al. Segmental bone regeneration using a load-bearing biodegradable carrier of bone morphogenetic protein-2[J]. Biomaterials, 2007,28(3):459-467.
[10] Jager M, Sager M, Lensing-Hohn S, et al. The critical size bony defect in a small animal for bone healing studies (Ⅱ): implant evolution and surgical technique on a rat′s femur[J]. Biomed Tech (Berl), 2005,50(5):137-142.
[11] Morelli I, Drago L, George DA, et al. Masquelet technique: myth or reality? A systematic review and meta-analysis[J]. Injury, 2016,47(Suppl 6):S68-S76.
[12] 曾景奇,黃楓,姜自偉,等.一種牽張成骨大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕J].中國實驗動物學(xué)報,2016,24(1):43-46.
[13] Zhao Z, Yang D, Ma X, et al. Successful repair of a critical-sized bone defect in the rat femur with a newly developed external fixator[J]. Tohoku J Exp Med, 2009,219(2):115-120.
[14] Wingerter S, Calvert G, Tucci M, et al. Comparison of two different fixation techniques for a segmental defect in a rat femur model[J]. J Invest Surg, 2009,20(3):149-155.
[15] Ryhanen J, Kallioinen M, Serlo W, et al. Bone healing and mineralization, implant corrosion, and trace metals after nickel-titanium shape memory metal intramedullary fixation[J]. J Biomed Mater Res, 1999,47(4):472-480.
[16] Heiner DE, Meyer MH, Frick SL, et al. Gene expression during fracture healing in rats comparing intramedullary fixation to plate fixation by DNA microarray[J]. J Orthop Trauma, 2006,20(1):27-38.
[17] Henrich D, Seebach C, Nau C, et al. Establishment and characterization of the Masquelet induced membrane technique in a rat femur critical-sized defect model[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016,10(10):E382-E396.
[18] Pelissier PH, Masquelet AC, Bareille R, et al. Induced membranes secrete growth factors including vascular and osteoinductive factors and could stimulate bone regeneration[J]. J Orthop Res, 2004,22(1):73-79.
[19] Aho OM, Lehenkari P, Ristiniemi J, et al. The mechanism of action of induced membranes in bone repair[J]. J Bone Joint Surg Am, 2013,95(7):597-604.
[20] Nau C, Seebach C, Trumm A, et al. Alteration of Masquelet′s induced membrane characteristics by different kinds of antibiotic enriched bone cement in a critical size defect model in the rat′s femur[J]. Injury, 2016,47(2):325-334.
EstablishmentofratfemurexperimentalmodelforstudyingMasqueletinducedmembrane
ZENGZhikui1,HUANGFeng,HUANGPeizhen,LIYue,CAIQunbin,ZHOUQishi,JIANGZiwei,LIDing,ZHENGShengpeng
(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)
ObjectiveTo establish an SD rat femur experimental model for studying the Masquelet induced membrane.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the observation group and control group, with 12 rats in each. A 4 mm bone block from the femur was removed in each of the two groups, and we used the steel plate to fix. The space was filled with PMMA cement spacers in the observation group, while in the control group, we did not do. The postoperative eating, defecation, walking, incision healing and complications were recorded. At 4 weeks after operation, the induced membrane tissues in the area around PMMA cement blocks of the observation group and in the osteotomy area of the control group were collected; HE staining was used to observe the histopathological changes; X-ray films were taken on the limbs of the two groups to observe the alignment of the osteotomy ends and the looseness of the steel plates and screws.ResultsIn both of the two groups, no rats had postsurgery symptoms of dysporia and eating disorder; rats walked normally on the second day after the surgery; no wound problem and infection were found. In the observation group, one rat's surgery limb had sustained swelling and knee movement restriction. In the observation group, the induced membrane was richly cellular, and the formation of large vascular network as well as bres oriented parallel to the PMMA could easily be identified. Histology analysis showed significantly decreased blood vessels in the control group. In the two groups, the steel plates and screws were in place with no loose.ConclusionsA SD rat femur experimental model for studying the induced membrane is successfully established.
bone defect; induced membrane; Masquelet technique; rats
國家自然科學(xué)基金資助項目(81603640)；廣東省中醫(yī)藥管理局項目(20161135)。
曾志奎(1984-)，男，博士研究生在讀，研究方向為中藥防治骨與關(guān)節(jié)損傷。E-mail： zengzhekui185@163.com
黃培鎮(zhèn)(1984-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為骨與關(guān)節(jié)損傷。E-mail： 174635247qq.com
10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.001
R683
A
1002-266X(2017)48-0001-04
2017-07-25)
猜你喜歡
一半模型童話王國·奇妙邏輯推理(2024年5期)2024-06-19 16:03:38 一種去中心化的域名服務(wù)本地化模型網(wǎng)絡(luò)安全與數(shù)據(jù)管理(2022年1期)2022-08-29 03:15:20 適用于BDS-3 PPP的隨機模型導(dǎo)航定位學(xué)報(2022年4期)2022-08-15 08:27:00 提煉模型 突破難點中學(xué)生數(shù)理化·中考版(2022年8期)2022-06-14 06:55:24 函數(shù)模型及應(yīng)用新世紀(jì)智能(數(shù)學(xué)備考)(2021年9期)2021-11-24 01:14:36 p150Glued在帕金森病模型中的表達(dá)及分布成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(2021年2期)2021-07-19 08:35:14 函數(shù)模型及應(yīng)用新世紀(jì)智能(數(shù)學(xué)備考)(2020年9期)2021-01-04 00:25:14 重要模型『一線三等角』中學(xué)生數(shù)理化·七年級數(shù)學(xué)人教版(2020年10期)2020-11-26 08:24:50 重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計的漸近分布數(shù)學(xué)物理學(xué)報(2020年2期)2020-06-02 11:29:24 3D打印中的模型分割與打包光學(xué)精密工程(2016年6期)2016-11-07 09:07:19
曾志奎，黃楓，黃培鎮(zhèn)，李悅，蔡群斌，周琦石，姜自偉，李定，鄭升鵬
(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
·論著·
大鼠股骨Masquelet誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>
曾志奎1，黃楓2，黃培鎮(zhèn)2，李悅2，蔡群斌2，周琦石2，姜自偉2，李定1，鄭升鵬1
(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)
目的建立一種用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀７椒ㄟx取雄性SD大鼠24只，隨機分為觀察組和對照組各12只。兩組均在股骨中段取出4 mm骨塊，均采用鋼板固定，觀察組置入PMMA骨水泥塊，對照組不置入骨水泥塊。統(tǒng)計兩組術(shù)后進(jìn)食、排便、行走、切口愈合及并發(fā)癥發(fā)生情況。造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍誘導(dǎo)膜組織及對照組截骨區(qū)誘導(dǎo)膜組織進(jìn)行HE染色，觀察組織病理學(xué)變化；對兩組術(shù)肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況，以及鋼板、螺釘在位情況。結(jié)果兩組術(shù)后均能正常進(jìn)食及排便，術(shù)后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組1只大鼠術(shù)后出現(xiàn)術(shù)肢持續(xù)腫脹、膝關(guān)節(jié)活動受限。觀察組誘導(dǎo)膜組織中含有大量細(xì)胞，形成豐富血管網(wǎng)及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導(dǎo)膜中所含血管明顯少于觀察組。兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。結(jié)論成功建立了用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀?/p>
骨缺損；誘導(dǎo)膜；Masquelet技術(shù)；大鼠
嚴(yán)重創(chuàng)傷、骨感染、慢性骨髓炎、骨不連、骨腫瘤保肢節(jié)段性切除等各種原因均可導(dǎo)致大段骨缺損。大段骨缺損治療難度大，帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等傳統(tǒng)治療方法均有不足[1～4]。2000年法國醫(yī)生Masquelet提出了“誘導(dǎo)膜”的概念即誘導(dǎo)膜技術(shù)，該技術(shù)是在骨缺損處填充PMMA骨水泥塊，4～6周骨水泥塊周圍形成誘導(dǎo)膜后，取出填充物植骨，有望應(yīng)用于治療大段骨缺損[5]。為深入研究誘導(dǎo)膜技術(shù)用于治療負(fù)重肢體骨缺損的可行性，建立精確、可重復(fù)性強的實驗?zāi)Ｐ椭陵P(guān)重要。國內(nèi)文獻(xiàn)對誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ蛨蟮郎跎?，國外文獻(xiàn)亦鮮有關(guān)于誘導(dǎo)膜模型精確截骨的描述。我們于2016年10月進(jìn)行本研究，擬建立一種用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ汀，F(xiàn)將制模過程及結(jié)果報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料 ①動物：SPF級成年雄性SD大鼠24只，鼠齡 8～10周，體質(zhì)量260～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(粵)2013-0020。大鼠分籠飼養(yǎng)，4只/籠，溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，光照時間晝14 h、夜10 h，自由進(jìn)水及飲食，1周后用于實驗。②器材：自制不銹鋼大鼠股骨截骨導(dǎo)板及自制不銹鋼6孔鋼板(圖1)，1.5 mm皮質(zhì)骨自攻螺釘(江蘇蘇州悅來醫(yī)療器械有限公司)、0.42 mm超細(xì)金剛砂鋸條(河北唐山鑫誠五金機電有限公司)，定制 0.5 mm克氏針(天津希翼瑞豐醫(yī)療器械有限公司)，JJ-12J組織脫水機、JB-P5生物組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司)，Leica Autostainer XL自動染色機(Leica Biosystems，德國)，Nikon Eclipse CI正置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)。
注：A為截骨導(dǎo)板，長15.37 mm、寬6 mm、高6 mm、厚1 mm，凹槽深5 mm；B為6孔鋼板，長22.5 mm、寬3.5 mm、厚1 mm。
圖1自制大鼠股骨鋼板及截骨導(dǎo)板
1.2 動物分組及處理 將大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組12只。兩組禁食24 h、不禁水， 5%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.8 mL/100 g)；取左側(cè)臥位，右腿備皮，75%乙醇消毒術(shù)區(qū)；股骨外側(cè)皮膚縱行切口，切開皮膚及筋膜，于股外側(cè)肌及股二頭肌肌間隙進(jìn)入，鈍性分離，自股骨大轉(zhuǎn)子至股骨髁顯露股骨外側(cè)面；放置6孔不銹鋼鋼板，調(diào)整好位置，使其位于股骨外側(cè)面中心，遠(yuǎn)近端各鉆入兩枚克氏針臨時固定；將第2、5兩孔的克氏針穿過截骨導(dǎo)板孔后放置截骨導(dǎo)板于鋼板上方，助手用兩把彎鉗固定導(dǎo)板并維持股骨位置，將線鋸穿過導(dǎo)板凹槽分別行遠(yuǎn)近端截骨至股骨高度2/3，不完全截斷；拔出第1孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第6孔同前；取出截骨導(dǎo)板，再拔出第2孔的克氏針，鉆孔，螺釘固定，第5孔同前；鋼板完全固定后，重復(fù)上述步驟將股骨遠(yuǎn)近端完全截斷，取出4 mm骨塊。將兩根1-0絲線穿過鋼板第3、4孔，觀察組在骨缺損區(qū)卡入PMMA骨水泥塊，絲線捆綁固定防止骨水泥塊移位，對照組不放置骨水泥塊。生理鹽水沖洗術(shù)區(qū)，采用強生 4-0Vicryl可吸收縫線依次縫合肌肉、深筋膜，1-0 絲線縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)5天每日給予青霉素(青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，160萬U/瓶，國藥準(zhǔn)字 H13020655)8萬U肌內(nèi)注以預(yù)防感染。術(shù)后禁水、禁食12 h，完全負(fù)重活動，單籠飼養(yǎng)4天至皮膚切口基本愈合后合籠。
1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①一般情況：觀察兩組術(shù)后進(jìn)食、排便、行走、切口愈合情況，統(tǒng)計術(shù)后4周內(nèi)并發(fā)癥發(fā)生情況。②誘導(dǎo)膜組織病理學(xué)觀察：造模4周時分別采集觀察組PMMA骨水泥塊周圍及對照組截骨區(qū)的誘導(dǎo)膜組織，10%甲醛固定48 h，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，組織切片機切取 5 μm厚薄片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。③截骨斷端影像學(xué)表現(xiàn)：造模4周時對兩組術(shù)肢拍攝X線片，觀察截骨斷端對位情況以及鋼板、螺釘在位情況。
2 結(jié)果
2.1 兩組一般情況 兩組術(shù)后均能正常進(jìn)食、排便，術(shù)后第2天均可正常行走，切口均愈合良好、未見感染。觀察組術(shù)后1只大鼠術(shù)肢持續(xù)腫脹、膝關(guān)節(jié)活動受限。
2.2 兩組誘導(dǎo)膜組織病理學(xué)改變 觀察組誘導(dǎo)膜組織中含有大量細(xì)胞，形成豐富的血管網(wǎng)及平行于PMMA骨水泥塊的纖維組織；對照組誘導(dǎo)膜中所含血管明顯減少。
2.3 兩組截骨斷端影像學(xué)表現(xiàn) 術(shù)后4周時兩組截骨斷端對位、對線均良好，鋼板及螺釘均在位、無松脫。
3 討論
目前，臨床治療節(jié)段性骨缺損的方法主要有帶血管腓骨移植、外支架骨搬運、自體髂骨移植等，但帶血管腓骨移植需局部顯微外科技巧、易損傷神經(jīng)血管；外支架骨搬運治療周期長，易導(dǎo)致針眼感染、對接端骨不連；自體髂骨移植供區(qū)骨量有限，可導(dǎo)致感染、血腫形成等[1～4]。Moghaddam等[6]報道，誘導(dǎo)膜技術(shù)可用于治療大段骨缺損。但隨著Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)的發(fā)展，暴露出骨源不足、骨爬行替代慢等問題；與骨組織工程技術(shù)有效結(jié)合可能是解決Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)上述不足的途徑[6～8]。建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)膜動物模型是研究其應(yīng)用的前提。既往報道的誘導(dǎo)膜動物模型存在截骨長度難掌控、固定物不牢靠、操作困難等問題[9,10]。故有必要建立一種穩(wěn)定、操作簡單的誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ汀?/p>
能否做到精確至毫米的截骨是影響誘導(dǎo)膜模型制模效果的重要因素。目前多數(shù)研究采用SD大鼠建立誘導(dǎo)膜模型，但大鼠骨骼細(xì)小，做到精確截骨非常困難。傳統(tǒng)先用克氏針打孔再截骨的方法往往容易導(dǎo)致骨骼劈裂甚至造模失敗。本課題組自行設(shè)計了截骨導(dǎo)板，并與鋼板有效結(jié)合，截骨端非常整齊，范圍精確，且操作方法容易掌握。
既往研究中對誘導(dǎo)膜骨缺損模型固定的方法主要有鋼板、髓內(nèi)釘、外支架、克氏針等[11～13]。Zhao等[13]采用單邊外支架成功制備了SD大鼠股骨極限骨缺損模型，經(jīng)12周觀察未見松動跡象，認(rèn)為這種外支架能為負(fù)重部位極限骨缺損的早期活動提供穩(wěn)定性保證。但外支架可導(dǎo)致針眼感染、周圍組織激惹等并發(fā)癥；同時，大鼠負(fù)重時外支架中不同克氏針的應(yīng)變將導(dǎo)致其周圍骨質(zhì)承受不同的應(yīng)力，一旦這種應(yīng)力達(dá)到極限可能導(dǎo)致局部骨溶解，引起外支架松動。Wingerter等[14]對比鋼板和克氏針固定SD大鼠股骨臨界骨缺損模型的效果，造模4周拆除內(nèi)固定物，組織學(xué)顯示克氏針組呈現(xiàn)出特有的纖維愈合模式，只有少量新生骨痂形成，固定的機械性不穩(wěn)定引起微動是纖維愈合產(chǎn)生的原因；鋼板組出現(xiàn)自缺損遠(yuǎn)近端向中心生長的自然內(nèi)向性新生骨痂，源于鋼板固定的臨界骨缺損模型為骨愈合提供了穩(wěn)定的愈合環(huán)境。有學(xué)者提出，髓內(nèi)釘不適合固定大鼠的股骨骨缺損，原因是操作困難、抗旋轉(zhuǎn)差、易出現(xiàn)術(shù)中骨折及鎖釘失效等并發(fā)癥[15]。骨折周圍的機械微環(huán)境對骨折愈合非常重要，其決定了骨折愈合的方式。機械環(huán)境如軸向、剪切、骨碎片間微動對骨修復(fù)均有影響。Heiner等[16]研究了鋼板和髓內(nèi)釘固定對SD大鼠股骨骨折愈合局部相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明大部分生長因子、神經(jīng)因子和造血因子等隨著骨折而出現(xiàn)mRNA表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn)，髓內(nèi)釘固定可明顯上調(diào)與軟骨、炎癥、細(xì)胞分化及乙酰膽堿相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，鋼板固定則上調(diào)與巨噬細(xì)胞活性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[16]。
本研究采用鋼板固定誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ汀Ｒ驗檎T導(dǎo)膜組織在造模后第4周時新生血管活性最強，誘導(dǎo)膜中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)含量最高，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、TGF-β表達(dá)達(dá)到高峰[17～19]，故本研究在術(shù)后4周取材進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，術(shù)后4周X線顯示兩組鋼板、螺釘未見松動。HE染色顯示，觀察組形成有效的誘導(dǎo)膜組織；對照組形成的膜結(jié)構(gòu)中僅見少量血管，觀察組則形成更為豐富的血管網(wǎng)，符合文獻(xiàn)報道的典型誘導(dǎo)膜結(jié)構(gòu)[20]。由此可見該誘導(dǎo)膜實驗?zāi)Ｐ偷慕⒎桨甘强尚械?。但在整個造模過程需要注意的事項較多；此外，大鼠股骨直徑較小，術(shù)中操作空間有限，鋼板螺釘固定時往往只有一次機會，所以要非常謹(jǐn)慎。術(shù)中需注意以下細(xì)節(jié)：①鋼板放置時近端要稍偏向內(nèi)側(cè)，因外側(cè)大轉(zhuǎn)子非常薄，可供螺釘固定的長度非常短。②螺釘長度要合適，尤其是最近端及最遠(yuǎn)端螺釘要足夠長，一般不少于7 mm。因近端可能會打中小轉(zhuǎn)子，且遠(yuǎn)端靠近股骨髁為松質(zhì)骨。③于遠(yuǎn)端1/3分離肌肉間隙時注意保護血管。據(jù)文獻(xiàn)報道，大鼠此處有一恒定血管經(jīng)過，損傷此血管可導(dǎo)致大量出血[10]。本研究觀察組有1只大鼠傷及此血管，術(shù)后出現(xiàn)大腿血腫、膝關(guān)節(jié)伸直受限。④麻醉藥物濃度不宜太高。本課題組早期預(yù)實驗采用10%水合氯醛麻醉，大鼠術(shù)后出現(xiàn)腸麻痹，改用5%水合氯醛麻醉未出現(xiàn)此并發(fā)癥，且麻醉效果滿意，亦未發(fā)生呼吸停止、死亡等。⑤術(shù)后前4天大鼠需分籠飼養(yǎng)，1只/籠，以防止互相撕咬引起傷口感染，待傷口穩(wěn)定后合籠，建議4只/籠。經(jīng)過不斷的完善實驗流程和總結(jié)經(jīng)驗，本課題組已建立了一種相對成熟的大鼠股骨誘導(dǎo)膜造模方法，該方法具有以下優(yōu)點：①因截骨導(dǎo)板的距離固定為4 mm，故截骨長度非常精確；②操作簡單，學(xué)習(xí)曲線短，手術(shù)時間短，對動物的損傷?。虎鄄牧蟽r格低廉；④實驗動物術(shù)后麻醉清醒后即可完全負(fù)重活動。
綜上所述，本研究成功建立了用于研究Masquelet誘導(dǎo)膜的SD大鼠股骨實驗?zāi)Ｐ?，該模型具有操作簡單、可重?fù)性高、創(chuàng)傷小、易掌握、成本低等優(yōu)點，可用于研發(fā)大段骨缺損治療藥物及生物材料。
[1] Zeng Z, Yuan L, Jiang P, et al. Treatment of 10 year humeral shaft nonunion with segment bony defect: a case report [J]. Int J Clin Exp Med, 2016,9(10):20242-20246.
[2] Jiang Y, Guo YF, Meng YK, et al. A report of a novel technique: the comprehensive fibular autograft with double metal locking plate fixation (cFALP) for refractory post-operative diaphyseal femur fracture non-union treatment[J]. Injury, 2016,47(10):2307-2311.
[3] Aktuglu K, Günay H, Alakbarov J. Monofocal bone transport technique for bone defects greater than 5 cm in tibia: our experience in a case series of 24 patients[J]. Injury, 2016,47(Suppl 6):S40-S46.
[4] 李宗軍.骨搬移技術(shù)用于脛骨骨髓炎伴長段骨缺損臨床觀察[J].山東醫(yī)藥,2016,56(20):86-88.
[5] Masquelet AC, Fitoussi F, Begue T, et al. Reconstruction of the long bones by the induced membrane and spongy autograft[J]. Ann Chir Plast Esthet, 2000,45(3):346-353.
[6] Moghaddam A, Zietzschmann S, Bruckner T, et al. Treatment of atrophic tibia non-unions according to ′diamond concept′: results of one- and two-step treatment[J]. Injury, 2015,46(Suppl 4):S39-S50.
[7] Giannoudis PV, Faour O, Goff T, et al. Masquelet technique for the treatment of bone defects: tips-tricks and future directions[J]. Injury, 2011,42(6):591-598.
[8] 周思睿,鄧江.修復(fù)臨界及超臨界骨缺損的組織工程材料研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥,2016,56(48):103-105.
[9] Chu TM, Warden SJ, Turner CH, et al. Segmental bone regeneration using a load-bearing biodegradable carrier of bone morphogenetic protein-2[J]. Biomaterials, 2007,28(3):459-467.
[10] Jager M, Sager M, Lensing-Hohn S, et al. The critical size bony defect in a small animal for bone healing studies (Ⅱ): implant evolution and surgical technique on a rat′s femur[J]. Biomed Tech (Berl), 2005,50(5):137-142.
[11] Morelli I, Drago L, George DA, et al. Masquelet technique: myth or reality? A systematic review and meta-analysis[J]. Injury, 2016,47(Suppl 6):S68-S76.
[12] 曾景奇,黃楓,姜自偉,等.一種牽張成骨大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕J].中國實驗動物學(xué)報,2016,24(1):43-46.
[13] Zhao Z, Yang D, Ma X, et al. Successful repair of a critical-sized bone defect in the rat femur with a newly developed external fixator[J]. Tohoku J Exp Med, 2009,219(2):115-120.
[14] Wingerter S, Calvert G, Tucci M, et al. Comparison of two different fixation techniques for a segmental defect in a rat femur model[J]. J Invest Surg, 2009,20(3):149-155.
[15] Ryhanen J, Kallioinen M, Serlo W, et al. Bone healing and mineralization, implant corrosion, and trace metals after nickel-titanium shape memory metal intramedullary fixation[J]. J Biomed Mater Res, 1999,47(4):472-480.
[16] Heiner DE, Meyer MH, Frick SL, et al. Gene expression during fracture healing in rats comparing intramedullary fixation to plate fixation by DNA microarray[J]. J Orthop Trauma, 2006,20(1):27-38.
[17] Henrich D, Seebach C, Nau C, et al. Establishment and characterization of the Masquelet induced membrane technique in a rat femur critical-sized defect model[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2016,10(10):E382-E396.
[18] Pelissier PH, Masquelet AC, Bareille R, et al. Induced membranes secrete growth factors including vascular and osteoinductive factors and could stimulate bone regeneration[J]. J Orthop Res, 2004,22(1):73-79.
[19] Aho OM, Lehenkari P, Ristiniemi J, et al. The mechanism of action of induced membranes in bone repair[J]. J Bone Joint Surg Am, 2013,95(7):597-604.
[20] Nau C, Seebach C, Trumm A, et al. Alteration of Masquelet′s induced membrane characteristics by different kinds of antibiotic enriched bone cement in a critical size defect model in the rat′s femur[J]. Injury, 2016,47(2):325-334.
EstablishmentofratfemurexperimentalmodelforstudyingMasqueletinducedmembrane
ZENGZhikui1,HUANGFeng,HUANGPeizhen,LIYue,CAIQunbin,ZHOUQishi,JIANGZiwei,LIDing,ZHENGShengpeng
(1GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China)
ObjectiveTo establish an SD rat femur experimental model for studying the Masquelet induced membrane.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the observation group and control group, with 12 rats in each. A 4 mm bone block from the femur was removed in each of the two groups, and we used the steel plate to fix. The space was filled with PMMA cement spacers in the observation group, while in the control group, we did not do. The postoperative eating, defecation, walking, incision healing and complications were recorded. At 4 weeks after operation, the induced membrane tissues in the area around PMMA cement blocks of the observation group and in the osteotomy area of the control group were collected; HE staining was used to observe the histopathological changes; X-ray films were taken on the limbs of the two groups to observe the alignment of the osteotomy ends and the looseness of the steel plates and screws.ResultsIn both of the two groups, no rats had postsurgery symptoms of dysporia and eating disorder; rats walked normally on the second day after the surgery; no wound problem and infection were found. In the observation group, one rat's surgery limb had sustained swelling and knee movement restriction. In the observation group, the induced membrane was richly cellular, and the formation of large vascular network as well as bres oriented parallel to the PMMA could easily be identified. Histology analysis showed significantly decreased blood vessels in the control group. In the two groups, the steel plates and screws were in place with no loose.ConclusionsA SD rat femur experimental model for studying the induced membrane is successfully established.
bone defect; induced membrane; Masquelet technique; rats
國家自然科學(xué)基金資助項目(81603640)；廣東省中醫(yī)藥管理局項目(20161135)。
曾志奎(1984-)，男，博士研究生在讀，研究方向為中藥防治骨與關(guān)節(jié)損傷。E-mail： zengzhekui185@163.com
黃培鎮(zhèn)(1984-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為骨與關(guān)節(jié)損傷。E-mail： 174635247qq.com
10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.001
R683
A
1002-266X(2017)48-0001-04
2017-07-25)
猜你喜歡
童話王國·奇妙邏輯推理(2024年5期)2024-06-19 16:03:38
網(wǎng)絡(luò)安全與數(shù)據(jù)管理(2022年1期)2022-08-29 03:15:20
導(dǎo)航定位學(xué)報(2022年4期)2022-08-15 08:27:00
中學(xué)生數(shù)理化·中考版(2022年8期)2022-06-14 06:55:24
新世紀(jì)智能(數(shù)學(xué)備考)(2021年9期)2021-11-24 01:14:36
成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(2021年2期)2021-07-19 08:35:14
新世紀(jì)智能(數(shù)學(xué)備考)(2020年9期)2021-01-04 00:25:14
中學(xué)生數(shù)理化·七年級數(shù)學(xué)人教版(2020年10期)2020-11-26 08:24:50
數(shù)學(xué)物理學(xué)報(2020年2期)2020-06-02 11:29:24
光學(xué)精密工程(2016年6期)2016-11-07 09:07:19
