趨化因子CXCL13對TNF-α誘導的人骨關節滑膜細胞RANKL表達的影響

金晟宇，任紅革

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

趨化因子CXCL13對TNF-α誘導的人骨關節滑膜細胞RANKL表達的影響

金晟宇，任紅革

(延邊大學附屬醫院，吉林延吉133000)

目的探討趨化因子CXCL13對TNF-α誘導的人骨關節滑膜細胞調控細胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)表達的影響。方法①體外培養人骨關節滑膜細胞，并給予10 μg/mL TNF-α處理，分別在培養0、6、12、24 h時采用免疫熒光法檢測CXCL13表達。②人滑膜細胞給予10 μg/mL TNF-α處理24 h，將培養液更換為含0、5、10、25 ng/mL CXCL13的培養液繼續培養24 h，或將培養液更換為含25 ng/mL CXCL13的培養液分別作用0、1、3、6、24 h；以不加TNF-α及CXCL13處理的常規培養細胞作為對照細胞。收集各濃度、各時間點細胞，采用Western blotting法檢測RANKL蛋白相對表達量。結果①TNF-α作用0、6、12、24 h時細胞CXCL13相對表達量(熒光強度)分別為0.907±0.350、0.823±0.730、0.710±0.660、0.653±0.850，組間比較P均<0.05。②對照細胞RANKL蛋白相對表達量為0.956±0.014，25 ng/mL CXCL13處理0、1、3、6、24 h時RANKL蛋白相對表達量分別為1.543±0.047、1.366±0.026、0.883±0.026、0.367±0.034、0.246±0.015；0、5、10、25 ng/mL CXCL13作用24 h時RANKL蛋白相對表達量分別為0.287±0.007、0.189±0.008、0.069±0.004、0.022±0.002；上述各組、各時間及各濃度細胞比較P均<0.05。結論趨化因子CXCL13能夠在一定濃度和時間內抑制TNF-α誘導的人骨關節滑膜細胞RANKL蛋白表達。

骨關節炎；趨化因子CXCL13；腫瘤壞死因子α；細胞核因子-κB受體活化因子配體；人骨關節滑膜細胞

骨關節炎是一種由復雜病因導致的慢性退行性疾病，又稱退行性骨關節炎，通常累及全身負重較大的關節，導致關節畸形，降低關節的使用壽命[1]。趨化因子CXCL13在骨關節炎滑膜組織低表達可能引起細胞因子分泌失衡，加重炎癥反應[2]。調控細胞核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)又稱骨保護素配體，在破骨細胞分化、發育、激活中扮演關鍵角色[3]。有學者發現，在口腔鱗狀細胞癌細胞中誘導CXCL13表達可上調RANKL水平[4]。TNF-α是誘導炎癥發生的細胞因子，通過持續活化細胞核因子-κB(NF-κB)誘導炎癥發生[5]。2015年10月～2016年10月我們進行本研究，探討趨化因子CXCL13對TNF-α誘導的人骨關節滑膜細胞RANKL表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨關節滑膜細胞購于上海鈺博生物科技有限公司。TNF-α、CXCL13(英國R&DSystems)，Anti-CXCL13兔多克隆抗體(英國Abcam)，Anti-RANKL兔多克隆抗體(美國Sigma-Aldrich)，靈敏度化學發光檢測試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)，TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡(北京萊卡儀器有限公司)，超高靈敏度化學發光ChemiDoc成像系統(美國伯樂BIO-RAD技術有限公司)。

1.2 細胞培養 將滑膜細胞培養于含10% FBS及抗生素的DMEM培養基中，于5% CO2、37 ℃條件下培養，0.25%胰酶消化傳代，取生長狀態良好的第3代細胞進行研究。

1.3 TNF-α誘導的滑膜細胞CXCL13表達檢測 采用免疫熒光法。將細胞消化，調整密度為1.0×105個/mL接種于6孔板，分別加入含10 μg/mL TNF-α的培養基，于5% CO2、37 ℃條件下培養；分別在培養0、6、12、24 h時取出部分玻片，PSB清洗，多聚甲醛固定，Triton X-100處理15 min，加入小牛血清(BSA)封閉30 min；加入CXCL13一抗，4 ℃過夜；洗去一抗，加熒光二抗孵育5 min；用含DAPI抗熒光封片劑封片，熒光顯微鏡分析。

1.4 CXCL13對TNF-α誘導的滑膜細胞RANKL表達的影響 采用Western blotting法。將細胞消化，調整密度為1.0×105個/mL接種于6孔板，置于含10 μg/mL TNF-α培養液處理24 h，將培養液更換為含0、5、10、25 ng/mL CXCL13的培養液繼續培養24 h，或將培養液更換為含25 ng/mL CXCL13的培養液分別作用0、1、3、6、24 h；收集各濃度、各時間點細胞，PBS洗滌，Bradford法進行蛋白定量；取30 μg蛋白與5×SDS加樣緩沖液混合，95 ℃變性5 min；經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上，室溫封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃過夜；洗去一抗，加入辣根過氧化物酶偶聯二抗，反應2 h；采用Image J測定各蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內參(GAPDH)條帶灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。以不加TNF-α及CXCL13處理的常規培養細胞作為對照細胞。

2 結果

2.1 TNF-α誘導對滑膜細胞CXCL13表達的影響 CXCL13主要定位于滑膜細胞的細胞核中，在顯微鏡下呈微弱的綠色熒光。在加入TNF-α刺激后，細胞質中的綠色熒光強度減弱，且隨著TNF-α刺激時間延長熒光強度逐漸下調。TNF-α刺激0、6、12、24 h時細胞CXCL13相對表達量(熒光強度)分別為0.907±0.350、0.823±0.730、0.710±0.660、0.653±0.850，組間比較P均<0.05。

2.2 CXCL13對TNF-α誘導的滑膜細胞RANKL表達的影響 對照細胞RANKL蛋白相對表達量為0.956±0.014。25 ng/mL CXCL13處理0、1、3、6、24 h時RANKL蛋白相對表達量分別為1.543±0.047、1.366±0.026、0.883±0.026、0.367±0.034、0.246±0.015；0、5、10、25 ng/mL CXCL13作用24 h時RANKL蛋白相對表達量分別為0.287±0.007、0.189±0.008、0.069±0.004、0.022±0.002；上述各組各時間點、各濃度細胞間比較P均<0.05。見圖1、2。

注：con指對照細胞；其余條帶為TNF-α、CXCL13處理細胞。

圖125ng/mLCXCL13作用0、1、3、6、24h時細胞RANKL表達電泳圖

3 討論

骨關節炎是一種以關節軟骨退行性變和繼發性骨質增生為特征的慢性關節疾病，其發生、發展是由多種細胞因子通過不同的作用機制相互作用、相互影響而形成的復雜過程。細胞因子在關節中結構和功能的改變可引發骨關節炎的病理變化，加重臨床癥狀[6,7]。檢測骨關節炎患者血液、關節液中各種因子的表達水平、分泌機制，可以為明確骨關節炎的發病機制、判斷臨床進展提供幫助。關節滑膜是覆蓋在關節腔內的疏松結締組織，具有清除吞噬、分泌制造滑液和調節關節滑液等作用[8]。越來越多的研究表明，滑膜炎癥的出現是多種細胞因子異常分泌的結果，且滑膜炎可引起軟骨結構異常，進一步加重臨床癥狀。

注：con指對照細胞；其余條帶為TNF-α、CXCL13處理細胞。

圖20、5、10、25ng/mLCXCL13作用24h時細胞RANKL表達電泳圖

CXCL13又稱B淋巴細胞趨化因子(BLC)或B細胞吸附因子1(BCA-1)，對B淋巴細胞具有顯著的吸附作用[9]，屬于趨化因子CXC亞族中的一種。CXCL13是由異位淋巴細胞生發中心的濾泡樹突狀細胞分泌，并不是由巨噬細胞及T細胞分泌聚集，在骨關節炎患者滑膜組織中CXCL13表達下降。這種CXCL13異常分泌造成B淋巴細胞在濾泡樹突狀細胞附近異常聚集，從而導致慢性骨關節炎的發生、發展[10]。有報道稱，CXCL13可以促進骨關節炎患者成骨細胞分泌Ⅰ型膠原蛋白[11]。Ⅰ型膠原蛋白是關節軟骨的重要組成部分，在構造及維持軟骨組織框架過程中扮演重要角色，能夠保護及修復關節軟骨，預防各種原因引起的關節炎癥。本研究結果顯示，TNF-α處理的滑膜細胞中CXCL13表達明顯低于對照組，與既往研究結果一致[2]。骨關節滑膜細胞中CXCL13過低表達，可能導致關節軟骨組織結構破壞，進一步影響整個關節內部的細胞因子微環境，導致細胞因子分泌失衡，造成相關炎癥的進一步發展。本研究進一步設計將趨化因子CXCL13作為誘導劑，人為提高細胞環境中CXCL13濃度，觀察CXCL13對TNF-α誘導的細胞炎癥模型進行處理，檢測其是否可引起相關細胞因子表達變化發揮抑制骨關節炎癥的作用。

RANKL又稱骨保護素配體(OPGL)，是TNF超家族成員之一，可以促進破骨細胞成熟，加強骨骼吸收。RANKL通過與破骨細胞前體細胞模表面調控細胞核因子-κB受體活化因子(RANK)結合，促使破骨細胞分化，進一步激活骨吸收活性。RANKL過度上調會導致骨骼改建，引起骨性疾病[12，13]。在口腔鱗狀細胞癌骨浸潤轉移的研究中發現，CXCL13可以上調RANKL表達[13]；對口腔鱗狀細胞癌骨浸潤的骨母細胞及骨髓基質細胞給予CXCL13激活劑c-Myc刺激，亦可以上調RANKL表達[14]。但本研究顯示出不同結果，TNF-α誘導正常關節滑膜細胞建立的細胞炎癥模型中RANKL表達上調，RANKL異常高表達導致關節滑膜中相應細胞因子微環境失衡，通過特異性細胞信號通路調控細胞分化，控制基因表達，進一步抑制破骨細胞分化、促進骨吸收，導致骨骼重建與吸收失去動態平衡。

本研究采用TNF-α建立細胞炎癥模型后，應用趨化因子CXCL13對細胞進行處理，發現隨著CXCL13作用時間延長，RANKL表達逐漸降低；隨著CXCL13刺激濃度增加，RANKL表達量亦逐漸降低。上述結果提示，CXCL13對炎癥模型中RANKL表達有明顯的抑制作用。在對細胞給予濃度為25 ng/mL的CXCL13作用后，RANKL表達明顯降低，我們考慮過高濃度的CXCL13可能引起某條信號通路關閉，造成表達失調。本研究結果與前期研究[12～14]結果不同，可能與以下原因有關：研究對象的細胞種類、細胞株、細胞分化階段不同，其對外界刺激的反應能力也有所不同；在實驗設計方面，既往實驗大多針對CXCL13對某種細胞的單獨作用，本研究是在TNF-α誘導建立炎癥模型后利用CXCL13對模型進行刺激，探討這幾種因子之間可能存在相互影響，產生協同或拮抗作用。

綜上所述，CXCL13可在一定濃度和時間內抑制TNF-α誘導的骨關節滑膜細胞RANKL蛋白表達，該作用呈一定的濃度和時間依賴性。

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InfluenceofCXCL13onexpressionofRANKLinhumansynovialcellsinducedbyTNF-α

JINShengyu,RENHongge

(YanbianUniversityHospital,Yanji133000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of CXCL13 on the expression of receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) in human synovial cells induced by tumor necrosis factor-α (TNF-α).Methods① The human synovial cells were cultured in vitro and were treated with 10 g/mL TNF-α. At 0, 6, 12, and 24 h, we used immunofluorescence to detect the CXCL13 expression. ② The human synovial cells cultured in vitro were treated with 10 g/mL TNF-α for 24 h, after that, we replaced the culture fluid with medium containing 0, 5, 10, and 25 ng/mL CXCL13 and continued to culture for 24 h, or replaced the culture fluid with medium containing 25 ng/mL CXCL13 and continued to culture for 0, 1, 3, 6, and 24 h. The relative expression of RANKL was detected by Western blotting. The normal cultured cells without treatment of TNF-α and CXCL13 were used as the control group.Results①The expression levels of CXCL13 (fluorescence intensity) were 0.907±351, 0.823±735, 0.710±664, and 0.653±853 in cells treated with TNF-α at 0, 6, 12, and 24 h (allP<0.05). ②The expression of RANKL protein was 0.956±0.014 in the control group, and the expression levels of RANKL protein in cells treated with 25 ng/mL CXCL13 for 0, 1, 3, 6, and 24 h were 1.543±0.047, 1.366±0.026, 0.883±0.026, 0.367±0.034, and 0.246±0.015; the expression levels of RANKL protein in cells treated with different contentrations (0, 5, 10, 25 ng/mL) of CXCL13 were 0.287±0.007, 0.189±0.008, 0.069±0.004, and 0.022±0.002; significant difference was found between them (allP<0.05).ConclusionCXCL13 can inhibit the expression of RANKL protein of osteoarticular synovial cells induced by TNF-α in a certain concentration and time.

osteoarthritis; chemokine CXCL13; tumor necrosis factor-α; receptor activator of NF-κB ligand (RANKL); human synovial cells

吉林省教育廳科學技術研究“十二五”規劃課題資助項目(吉教科合字201310)。

金晟宇(1990-)，男，碩士研究生在讀，研究方向為骨關節疾病。E-mail: jinshy0923@hotmail.com

任紅革(1975-)，男，副主任醫師，研究方向為骨關節疾病。E-mail: renhg196@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.002

R684.3

A

1002-266X(2017)48-0005-04

2017-04-29)