尾靜脈移植高表達Aqp1基因的骨髓間充質干細胞對股骨骨折大鼠骨愈合的影響

孟凡彪，劉寶華，劉佐君

(深圳大學醫學院，廣東深圳518060)

尾靜脈移植高表達Aqp1基因的骨髓間充質干細胞對股骨骨折大鼠骨愈合的影響

孟凡彪，劉寶華，劉佐君

(深圳大學醫學院，廣東深圳518060)

目的探討尾靜脈移植高表達水通道蛋白1(Aqp1)基因的骨髓間充質干細胞(MSCs)對股骨骨折大鼠骨愈合的影響。方法利用慢病毒系統建立穩定高表達Aqp1基因的MSCs(簡稱Aqp1-MSCs)，采用Dun 趨化小室系統實時驗證MSCs、Aqp1-MSCs遷移速率。建立SD大鼠股骨骨折模型，并隨機分為觀察組和對照組各10只，建模2天分別由尾靜脈移植Aqp1-MSCs及MSCs。移植后4周行X線檢查，觀察骨折愈合情況；取骨折股骨標本，采用micro-CT掃描后進行皮質骨3D重建，檢測重建皮質骨的新骨生成比(BV/TV)及骨密度(BMD)；應用四點斷裂實驗分析愈合后股骨的力學參數，即骨折部位承受最大力、能量與韌性。結果Aqp1-MSCs與MSCs均具有定向趨向性，Aqp1-MSCs及MSCs遷移速率分別為(5.18±0.29)、(2.44±0.21)μm/10 min(P<0.05)。觀察組和對照組BV/TV分別為0.18±0.01、0.15±0.02(P>0.05)，BMD分別為(587.20±16.53)、(511.60±27.89)mgHA/ccm(P<0.05)。兩組骨折部位承受的最大力和能量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，觀察組組織韌性高于對照組(P<0.05)。結論尾靜脈移植Aqp1-MSCs可促進股骨骨折大鼠骨愈合；通過Aqp1誘導MSCs遷移可能是其作用機制。

股骨骨折；骨髓間充質干細胞；水通道蛋白1；細胞遷移；大鼠

骨折多發生于交通事故、運動意外、跌倒等。大部分骨折治療效果較好，但愈合周期長、延遲愈合或骨不連等臨床問題尚需解決[1]。骨髓間充質干細胞(MSCs)是來源于骨髓的具有成骨、成脂與成軟骨三系分化能力的成體干細胞，其在體外易大量擴增，且免疫原性較低。目前，臨床已有成功應用MSCs治療骨折的報道[2]。水通道蛋白1(Aqp1)是最早鑒定出負責細胞水分運輸的七次跨膜蛋白[3]，廣泛分布于各個組織，主要表達在內皮細胞，可促進腫瘤血管新生[4]。本課題組前期研究發現，Aqp1通過調節β-catenin、FAK表達，促進MSCs遷移到骨折損傷部位[5]。2014年9月～2016年6月我們進行本研究，探討尾靜脈移植高表達Aqp1基因的MSCs(簡稱Aqp1-MSCs)對股骨骨折大鼠骨愈合的影響。

1 材料

SD大鼠20只，雌雄不限，6～8周齡，體質量200 g左右，購于廣東省醫學實驗動物中心(動物許可證號：44007200041000)。所涉及的動物移植實驗均通過深圳大學醫學院實驗動物倫理委員會批準。

主要試劑：質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Axygen公司(杭州)，低糖DMEM細胞培養液、0.25%胰蛋白酶與opti-MEM培養液購于美國Gibco公司，脂質體2000(LipofectamineTM2000)購于美國Invitrogen公司，克氏針(φ1.2 mm)購于美國Stryker公司。高分辨率X射線儀(MX-20)購于美國Faxitron公司，viva CT 40購于瑞士Scanco Medical公司。Aqp1抗體、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司。

2 方法與結果

2.2 Aqp1-MSCs構建 采用PCR法將大鼠Aqp1基因(NM_012778.1)構建到載體plenti6-V5中，用于慢病毒包裝。將質粒pCMV-VSVG 2.8 μg、pMDLg-RRE 5.28 μg、pRSV-REV 4 μg、pLenti6-Aqp1 8 μg 與500 μL Opti-MEM混勻在一個EP管，同時將50 μL PEI與500 μL Opti-MEM混勻在另一個Ep管。將兩管內容物混勻并室溫放置15 min，加入到70%融合的293T培養皿中，培養6 h換成新鮮培養液，培養48 h收集培養液上清，即為病毒粗提液。根據病毒滴度，將相應的病毒粗提液加入鋪有MSCs的6孔板中，培養24 h換液。采用blasticidin(10 μg/mL)篩選2周得到Aqp1-MSCs細胞株，進行Western blotting檢測驗證。結果顯示，慢病毒感染MSCs的感染效率接近100%。高表達Aqp1并未影響MSCs形態，篩選出Aqp1-MSCs細胞株。

2.3 Aqp1-MSCs遷移速率檢測 采用Dun 趨化小室分析。將無血清培養液置于內室，將含血清培養液置于外室，分別覆蓋含70%融合Aqp1-MSCs及MSCs的蓋玻片。將蓋玻片置于連有攝像機的倒置顯微鏡上，利用軟件Kinetic(Kinetic Imaging Ltd，英國)記錄橋(bridge)上細胞遷移軌跡，并用內置軟件分析細胞遷移的方向與速率。結果顯示，Aqp1-MSCs與MSCs均具有定向趨向性。對遷移速率連續300 min追蹤分析發現，Aqp1-MSCs及MSCs的遷移速率分別為(5.18±0.29)、(2.44±0.21)μm/10 min，兩者比較P<0.05。

2.4 Aqp1-MSCs對股骨骨折愈合的影響

2.4.1 大鼠骨折模型建立及Aqp1-MSCs移植 根據文獻[6]報道方法建立大鼠股骨骨折模型。將20只SD大鼠隨機分為觀察組和對照組各10只。兩組均在常規麻醉狀態下暴露股骨，利用電鋦在股骨骨干處進行橫切截斷，并插入克氏針進行內固定。利用數字化X射線儀對骨折情況進行評估。結果顯示，骨折類型為橫形斷裂，無粉碎性骨折、斜形骨折與螺旋骨折。骨折手術后2天，觀察組和對照組分別由尾靜脈移植Aqpl-MSCs及MSCs，細胞數均為1×106個。

2.4.2 大鼠骨折愈合情況及骨折愈合后骨折部位的力學分析 移植后4周對骨折股骨進行X線照射檢查，結果顯示兩組骨折表面均愈合。將大鼠麻醉處死，取骨折股骨標本。將兩組股骨標本置于塑料圓柱形管中進行micro-CT掃描(電壓70 keV、電流114 μA)。掃描以生長板為起點至遠端7.98 mm處，每一層掃描厚度為19 μm(總計420層)。采用半自動方法確定輪廓，以區分骨小梁中的皮質骨。根據CT掃描圖像對皮質骨進行3D重建[7]，參數為：sigma=1.2，support=2，threshold=190。利用內附軟件評估3D重建皮質骨的新骨生成比(BV/TV)及骨密度(BMD)。BV指新骨形成量，TV是骨總量。結果顯示，觀察組較對照組骨折溝變淺、骨痂減少，即骨折愈合更好。觀察組及對照組BV/TV分別為0.18±0.01、0.15±0.02，兩組比較P>0.05，觀察組及對照組BMD分別為(587.20±16.53)、(511.60±27.89)mgHA/ccm，兩組比較P<0.05。

在亨氏材料試驗機(H25KS; Hounsfield Test Equipment)上設置250 N的總力，應用四點斷裂試驗分析愈合后股骨的力學參數。將股骨標本水平放置在支持的兩點上，對骨折位置以5 mm/min進行施壓，壓力方向與骨干方向垂直，致骨斷裂，利用內置軟件分析骨折部位承受的最大力、能量與韌性。

結果顯示，兩組骨折部位承受的最大力和能量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，觀察組組織韌性高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組骨折愈合后骨折部位承受的最大力、能量及組織韌性比較

注:與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

MSCs是一種多潛能成體干細胞，其臨床應用是再生醫學研究的熱點，為治療組織損傷提供了新的可能，目前已應用于治療糖尿病、心肌梗死、炎癥、骨折等多種疾病[8～10]。在MSCs應用中的瓶頸問題是如何將MSCs移植到體內。原位注射MSCs的方式較為直接有效，但臨床創傷較大，不利于重復應用[11，12]；通過血液循環輸入是有效而無創的方法，但由循環系統輸入MSCs需要細胞具有較強的遷移能力才能到達損傷部位[13,14]。文獻報道，體外培養的MSCs形態較體內原始細胞大，不易穿過毛細血管[15]；血液移植的MSCs大部分被潴留在肺部，影響肺的正常生理功能，并降低治療效果。因此，提高MSCs的遷移能力對提高其干預效果具有重要意義。

研究證實，Aqp1可促進腫瘤細胞遷移及腫瘤內血管生成[12]。本課題組前期研究發現，Aqp1通過調節FAK與β-catenin表達促進MSCs遷移到骨折部位[5]。本研究首先構建穩定轉染Aqp1的MSCs細胞系，利用Dun 趨化小室系統實時觀察Aqp1對MSCs遷移的影響，進一步采用大鼠骨折模型在體內分析Aqp1-MSCs對骨折愈合的影響。結果顯示，Aqp1-MSCs遷移速度較MSCs顯著提高，Aqp1-MSCs移植可促進骨折愈合，提高骨折部位的BMD與韌性。上述結果說明，Aqp1對MSCs介導的骨折修復具有促進作用。由于Aqp1對MSCs遷移的促進作用，因而骨折愈合能力的增強可能是更多的MSCs到達損傷部位進行修復。本研究中Aqp1-MSCs移植并未顯著提高骨折大鼠BV/TV。新骨形成質量與骨折部位微環境、骨折個體骨折創傷面、愈合過程中炎癥反應及后期血管形成等因素均有關，單純改變遷移速度可能不足以影響新骨形成。

綜上所述，尾靜脈移植Aqp1-MSCs可促進股骨骨折大鼠骨愈合；通過Aqp1誘導MSCs遷移可能是其作用機制。

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EffectsoftransplantationofAqp1-MSCsviacaudalveinonhealingprocessofratswithfemurfracture

MENGFanbiao,LIUBaohua,LIUZuojun

(ShenzhenUniversitySchoolofMedicine,Shenzhen518060,China)

ObjectiveTo investigate the effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) with high expression of aquaporin 1 (Aqp1) via caudal vain on the healing process of rats with femoral fractures.MethodsMSCs (Aqp1-MSCs) stably expressing Aqp1 gene were established by lentivirus system, and the migration rates of MSCs and Aqp1-MSCs were verified by Dun chemotactic chamber system. Twenty SD rats with femur fractures were randomly divided into the observation group and the control group with 10 in each. Aqp1-MSCs and MSCs via caudal vein were administrated 2 days after surgery. The fractured femur were examined by X ray to observe the healing process 4 weeks after transplantation. Furthermore, the femora were collected and scanned using micro-CT for 3D remodeling to examine the new cortical bone formation ration (BV/TV)and bone density (BMD). In addition, four points break analysis was used to examine the mechanical parameters of femora such as the maximal force, energy, and stiffness.ResultsAqp1-MSCs and MSCs had specific chemotaxis, and the migration rates of Aqp1-MSCs and MSCs were (5.18±0.29) and (2.44±0.21) m/10 min, respectively. The BV/TV of the observation group and control group were 0.175%±0.01% and 0.15%±0.02%, respectively (P>0.05). The BMD of the two groups were (587.2±16.53) and (511.6±27.89) mgHA/ccm, respectively (P<0.05). No significant difference was found in the maximal force and energy between these two groups (bothP>0.05), while the stiffness of the observation group was significantly higher than that of the control group (P<0.05).ConclusionTransplantation of Aqp1-MSCs via caudal vain can promote the healing process of rats with femoral fractures by Aqp1 inducing the migration of MSCs.

femoral fracture; bone marrow mesenchymal stem cells; aquaporin-1; cell migration

深圳市科技創新計劃基金資助項目(CXZZ20140903103747508)。

孟凡彪(1986-)，男，博士后，研究方向為干細胞治療骨相關疾病。E-mail： mfanbiao@szu.edu.cn

劉佐君(1982-)，男，博士后，研究方向為干細胞與再生醫學。E-mail： liu-zuo-jun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.004

Q291;R683

A

1002-266X(2017)48-0012-03

2017-04-06)