鞘氨醇激酶1對人骨肉瘤U2OS細胞增殖、凋亡的影響及機制

張萬賀，寶琪，杜春陽，郭義超

(1保定市蓮池區婦幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科醫院；3河北醫科大學)

·基礎研究·

鞘氨醇激酶1對人骨肉瘤U2OS細胞增殖、凋亡的影響及機制

張萬賀1，寶琪2，杜春陽3，郭義超2

(1保定市蓮池區婦幼保健院，河北保定071000；2保定市骨科醫院；3河北醫科大學)

目的探討鞘氨醇激酶1(SphK1)對人骨肉瘤U2OS細胞增殖和凋亡的影響及機制。方法將體外培養的人骨肉瘤U2OS細胞隨機分為四組，轉染組、Vector組分別轉染SphK1 siRNA及對照siRNA，PF-543組在培養液中加入1 μmol/L SphK1特異性抑制劑PF-543，對照組常規培養。干預48 h時，采用Western blotting法檢測SphK1蛋白表達，明確siRNA轉染可在蛋白水平抑制骨肉瘤U2OS細胞SphK1高表達，且效果與其抑制劑PF-543相當。采用MTT法檢測各組細胞存活率，采用TUNEL法和流式細胞術檢測細胞凋亡率，采用Western blotting法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Bax、Bcl-2、Caspase-3及活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表達。結果與對照組、Vector組比較，轉染組、PF-543組細胞存活率均下降，細胞凋亡率均增加，PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達均減低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達均增加，組間比較P均<0.05。結論SphK1基因可促進骨肉瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡，調節凋亡及增殖相關因子表達可能是其作用機制。

骨肉瘤；鞘氨醇激酶1；細胞增殖；細胞凋亡；鞘氨醇激酶1特異性抑制劑

骨肉瘤是兒童及青少年常見的高度惡性骨組織原發腫瘤，年發病率為2/100萬～5/100萬，好發于血運豐富的長骨干骺端，具有早期肺轉移、復發率高等特點，患者預后較差[1～3]。鞘氨醇激酶1(SphK1)可將具有促細胞凋亡功能的鞘氨醇(Sph)磷酸化為具有促細胞存活功能的鞘氨醇1-磷酸(S1P)，進而調控細胞的生長發育[4]。Zhou等[5]研究發現，microRNA-124(miRNA-124)可通過下調人骨肉瘤細胞SphK1表達抑制細胞增殖及侵襲；苯妥帝爾和阿霉素聯合應用能夠抑制骨肉瘤組織SphK1高表達，同時抑制骨肉瘤U2OS細胞生長發育[6]。上述研究結果提示，SphK1可能參與骨肉瘤的發病及其病理生理過程，但其作用機制尚不明確。2016年3月～2017年3月我們進行本研究，探討SphK1對人骨肉瘤U2OS細胞增殖、凋亡的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司。SphK1 siRNA購自美國Santa Cruz公司。SphK1特異性抑制劑PF-543購自美國Selleck Chemicals公司。兔抗SphK1、Bcl-2、Caspase-3、活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)、增殖細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗體及小鼠抗Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體均購自美國Promega公司。MTT購自Sigma公司。脂質體2000購自美國Invitrogen公司。辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)購自美國Milipore公司。TUNEL試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養 將U2OS細胞在DMEM完全培養基中37 ℃常規培養，當細胞融合75%～85%時，用無血清培養基培養24 h，進行以下研究。

1.3 細胞分組處理 將細胞隨機分為四組，其中轉染組、Vector組分別采用脂質體2000轉染SphK1 siRNA及對照siRNA，PF-543組在培養液中加入1 μmol/L SphK1特異性抑制劑PF-543，對照組常規培養。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 細胞SphK1蛋白表達 采用Western blotting法檢測。將四組轉染48 h的細胞用冰冷PBS洗2遍，加入細胞裂解液200 μL，冰上放置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，取上清液置于一干凈的EP管中，Lowry法測定總蛋白濃度。取細胞裂解蛋白50 μg，行SDS-PAGE電泳，將產物電轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入SphK1抗體，4 ℃冰箱過夜；TBST液洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔抗體，37 ℃孵育1.5 h；TBST液洗膜后加ECL試劑，ODYSSEY遠紅外雙色熒光成像系統顯影(LLCOR Gene Company，USA)。LabWorks4.5軟件(UVP Company，USA)對蛋白條帶進行定量分析。

1.4.2 細胞增殖情況 采用MTT法檢測。將細胞(5×103個/mL)接種于96孔板，每孔定容為200 μL，分別加入200 μL(5 g/L)MTT，37 ℃培養箱中繼續培養4 h；棄培養液，每孔分別加入150 μL DMSO，待結晶完全溶解；采用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(處理組A值/對照組A值)×100%。

1.4.3 細胞凋亡率 ①采用TUNEL法檢測。將細胞(6×103個/mL)接種于8孔Leb-Tak腔室波片(美國Nalge Nunc公司)采用TUNEL法檢測陽性細胞。步驟嚴格按試劑盒說明書操作。陽性細胞核呈棕黃色。每孔至少計數500個細胞，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%。②采用流式細胞術檢測。收集細胞培養液中的懸浮細胞及貼壁細胞，預冷PBS沖洗兩次，采用體積分數為70%的冰冷乙醇固定24 h，置于4 ℃冰箱；取出后PBS沖洗兩次，碘化丙啶4 ℃避光染色30 min，采用流式細胞儀檢測凋亡細胞數，計算細胞凋亡率。

1.4.4 PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達 采用Western blotting法檢測。具體步驟參照1.4.1。

2 結果

2.1 各組SphK1蛋白表達比較 轉染組、Vector組、PF-543組、對照組SphK1蛋白相對表達量分別為0.16±0.03、0.91±0.02、0.32±0.01、0.98±0.02。轉染組、PF-543組SphK1蛋白相對表達量較對照組及Vector組明顯降低(P均<0.05)，其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.2 各組細胞存活率比較 轉染組、Vector組、PF-543組、對照組細胞存活率分別為(45.17±0.21)%、(92.00±0.02)%、(53.05±0.26)%、(98.04±0.01)%。與對照組、Vector組比較，轉染組、PF-543組細胞存活率均下降(P均<0.01)；其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.3 各組細胞凋亡率比較 流式細胞結果顯示，轉染組、Vector組、PF-543組、對照組細胞凋亡率分別為(54.81±0.15)%、(8.20±0.03)%、(47.31±0.16)%、(2.57±0.02)%。與對照組及Vector組比較，轉染組、PF-543組細胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

TUNEL結果顯示，轉染組、Vector組、PF-543組、對照組細胞凋亡率分別為(47.32±0.16)%、(4.35±0.05)%、(41.13±0.41)%、(4.82±0.06)%。與對照組和Vector組比較，轉染組、PF-543組細胞凋亡率均升高(P均<0.01)；其余組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.4 各組PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達比較 與對照組和Vector組比較，轉染組、PF-543組PCNA、Cyclin D1、Bcl-2蛋白相對表達量均降低，Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白相對表達量均升高，組間比較P均<0.05。見表1。

表1 各組細胞PCNA、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase-3及 cleaved Caspase-3蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與Vector組比較，*P<0.01。

3 討論

80%的骨肉瘤患者在確診時已經發生轉移，手術及新輔助化療后5年生存率僅20%～30%[7,8]。骨肉瘤臨床治療效果不佳的重要原因是缺少特異性的分子治療靶點[9]。SphK1是維持細胞內鞘脂平衡的重要調節酶，具有SphK1和SphK2兩個亞型，雖然二者在結構域上高度保守，但在亞細胞定位、酶催化特性和組織表達譜等方面均顯著不同。SphK1是1-磷酸鞘氨醇(S1P)生成的限速酶，通過降低組織內神經酰胺和鞘氨醇含量，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[3]。研究發現，SphK1在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，如結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌及甲狀腺癌等[10,11]。Bonhoure等[12]報道，特異性敲除人類白血病細胞系SphK1基因能夠抑制線粒體細胞色素C的釋放，進而促進細胞凋亡。Heffernan-Stroud等[13]報道，敲除SphK1基因可以抑制p53基因敲除小鼠特征性胸腺淋巴瘤的發生、發展。SphK1表達水平與腫瘤惡性程度和患者預后等臨床病理特征相關，因此SphK1被認為是生物體內重要的致癌因子。新近有報道稱，SphK1參與骨肉瘤的發病及其病理生理過程。彭晶等[4]研究發現，mi-124通過下調人骨肉瘤細胞SphK1表達抑制細胞的增殖及侵襲。苯妥帝爾和阿霉素聯合應用同樣能夠抑制骨肉瘤組織SphK1高表達，進而抑制骨肉瘤U2OS細胞的生長發育[5]。本研究采用短鏈microRNA和特異性抑制劑兩種手段敲低人骨肉瘤U2OS細胞SphK1表達，結果顯示，SphK1表達被抑制后U2OS細胞增殖受到明顯抑制，提示SphK1基因可能是骨肉瘤的靶基因。

腫瘤防治的關鍵是抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡。細胞凋亡是細胞接受內外源死亡信號刺激后發生的自殺性死亡，在調節生物生長發育和自身穩定方面發揮重要作用。目前臨床上大多數抗腫瘤藥物的作用機制是誘導腫瘤細胞凋亡。研究發現，SphK1在許多哺乳動物腫瘤細胞中發揮抗細胞凋亡作用[14]。有研究以病毒為載體，將野生型和突變型SphK1基因導入人胃癌細胞，結果顯示，過表達SphK1可抑制5-FU誘導的胃癌細胞凋亡[14]；干擾乳腺癌MCF-7細胞SphK1基因表達可以抑制腫瘤細胞增殖和遷移能力，同時誘導細胞發生凋亡[15,16]。本研究發現，SphK1表達被抑制后骨肉瘤U2OS細胞凋亡率升高，凋亡細胞數明顯增加；同時細胞內重要的凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達明顯降低，促凋亡發生基因Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高。提示在骨肉瘤發病過程中，SphK1基因通過調節凋亡相關因子表達抑制腫瘤細胞凋亡。PCAN及Cyclin D1是細胞增殖狀態的重要評價指標，其在腫瘤組織中的表達變化對疾病的發生、發展及患者預后具有關鍵性評估價值。本研究中SphK1表達被抑制后骨肉瘤U2OS細胞PCNA及Cyclin D1表達均受到明顯抑制，提示SphK1基因可能通過調控細胞增殖因子表達促進骨肉瘤細胞增殖。

綜上所述，SphK1基因具有促進骨肉瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用；調節凋亡及增殖相關因子表達可能是其作用機制。SphK1基因可能成為骨肉瘤的治療靶點。

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河北省教育廳青年基金項目(QN2016018)。

寶琪(E-mail: 13731697766@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.008

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0028-03

2017-06-26)