miR-432對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制

榮輝，王志臣，于興勝，韓康

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南250031)

miR-432對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響及機制

榮輝，王志臣，于興勝，韓康

(濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南250031)

目的探討微小RNA-432(miR-432)對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機制。方法采用qRT-PCR技術檢測人骨肉瘤細胞MG-63、人成骨細胞hFOB1.19中miR-432表達。將對數(shù)生長期MG-63細胞隨機分為三組，分別轉染miRNA對照質(zhì)粒(miR-NC組)、miR-432抑制質(zhì)粒(miR-432 inhibitor組)及miR-432過表達質(zhì)粒(miR-432組)，轉染48 h時進行接種培養(yǎng)，分別檢測細胞增殖(吸光度值)、遷移和侵襲情況。利用miRWalk和miRanda生物信息學軟件預測miR-432靶基因可能為致癌基因CX3CL1，分別構建含有miR-432結合位點的CX3CL1基因3′-UTR區(qū)野生型(CX3CL1-wt)和突變型(CX3CL1-mut)熒光素酶報告載體。將MG-63細胞分別共轉染CX3CL1-wt或CX3CL1-mut報告載體和miR-432載體(觀察組)，并設置共轉染miR-NC載體作為對照組。轉染48 h時，采用雙熒光素酶試劑盒檢測相對熒光素酶活性。結果MG-63細胞中miR-432相對表達量低于hFOB1.19細胞(P<0.01)。miR-NC組、miR-432 inhibitor組、miR-432組細胞中miR-432相對表達量分別為1.00±0.01、0.47±0.03、3.62±0.03，組間比較P均<0.01。miR-432組培養(yǎng)24、36、48 h的細胞吸光度值均明顯低于miR-NC組、miR-432 inhibitor組，miR-432 inhibitor組均明顯高于miR-NC組。miR-432 inhibitor組及miR-432組細胞相對遷移率分別為(122±7)%、(65±4)%，相對侵襲率分別為(189±25)%、(49±11)%；上述指標組間比較P均<0.05。CX3CL1-wt和miR-432共轉染MG-63細胞后，觀察組相對熒光素酶活性低于對照組(P<0.05)；CX3CL1-mut和miR-432共轉染細胞后，對照組和觀察組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.11、0.93±0.13，兩組比較P>0.05。結論miR-432過表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲，靶向調(diào)控致癌基因CX3CL1可能是其作用機制。

骨肉瘤；微小RNA-432；細胞增殖；細胞遷移；細胞侵襲；CX3CL1

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于20歲以下人群[1]，骨肉瘤約占原發(fā)性惡性骨腫瘤的30%，常在發(fā)病早期就發(fā)生侵襲和轉移，其中肺轉移約占所有轉移的90%，亦可見肝、腦、腎等部位轉移[2]。由于其發(fā)生遠處轉移早，對放化療反應不敏感，患者5年生存率為50%～60%[1]。研究表明，微小RNA(miRNA)通過參與腫瘤相關基因轉錄后水平調(diào)控，對骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲等發(fā)揮重要作用[3,4]。miR-432作為新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關的miRNA，在胃癌、肺癌、宮頸癌等組織或細胞中表達下調(diào)，且參與調(diào)控腫瘤生長、侵襲，但其與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的關系報道較少[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miR-432表達低于癌旁正常組織，提示miR-432表達下調(diào)可能參與了骨肉瘤的發(fā)生，但具體作用機制尚未明確[6]。2010年9月～2015年9月，我們觀察了miR-432對骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響，現(xiàn)分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞株MG-63及人成骨細胞系hFOB1.19均購自中國科學院上海細胞庫。FBS、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司。LipofectamineTM2000轉染試劑、TRIzol、M-MLV逆轉錄酶購自美國Invitrogen公司。SsoAdvancedTMSYBR?Green Supermix試劑盒購自美國Bio-Rad公司。細胞增殖CCK-8試劑盒、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組處理 人骨肉瘤細胞MG-63及人成骨細胞系hFOB1.19均常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期MG-63細胞以密度為5×105個/孔接種于6孔板。當細胞融合度達70%左右時隨機分為三組，采用LipofectamineTM2000轉染試劑分別轉染miRNA對照質(zhì)粒(miR-NC組)、miR-432抑制質(zhì)粒(miR-432 inhibitor組)及miR-432過表達質(zhì)粒(miR-432組)。轉染48 h時，收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 細胞miR-432表達 取對數(shù)生長期MG-63、hFOB1.19細胞以及轉染48 h的三組細胞，采用qRT-PCR法檢測miR-432相對表達量。具體步驟：TRIzol法提取組織和細胞總RNA；采用miR-432特異性逆轉錄引物，以M-MLV逆轉錄酶逆轉錄合成cDNA；以U6作為內(nèi)參，使用SsoAdvancedTMSYBR?Green Supermix試劑盒進行qRT-PCR。反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法計算miR-432相對表達量。

1.3.2 細胞增殖情況 采用CCK-8法檢測。將轉染48 h的三組細胞接種于96孔板(2×103個/孔)，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，檢測450 nm波長處的吸光度(A)值。每組設置3個復孔，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3.3 細胞遷移情況 采用細胞劃痕實驗。將轉染48 h的三組細胞接種于24孔板中(1×105個/孔)，培養(yǎng)24 h時采用200 μL無菌移液器槍頭在培養(yǎng)板底部進行“1”字形劃痕，倒置顯微鏡下觀察36 h時劃痕中細胞的遷移情況，計算細胞相對遷移率(相對于miR-NC組)。每組設置3個復孔，實驗重復3次，結果取平均值。

1.3.4 細胞侵襲情況 采用Transwell侵襲實驗。采用預鋪Matrigel基質(zhì)膠的8 μm聚碳酸酯濾膜培養(yǎng)小室進行Transwell實驗。將轉染48 h的三組細胞以2.0×105個/孔接種于100 μL無血清培養(yǎng)基中，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組設3個復孔。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)36 h，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色5 min。100倍顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，取平均數(shù)作為每組穿過小室細胞數(shù)，計算細胞相對(相對于miR-NC組)侵襲率。

1.3.5 miR-432下游靶基因確定 利用miRWalk和miRanda生物信息學軟件對miR-432靶基因進行預測，結果顯示miR-432與致癌基因CX3CL1的3′-UTR存在7個堿基結合位點。分別構建含有miR-432結合位點的CX3CL1基因3′-UTR區(qū)野生型(CX3CL1-wt)和突變型(CX3CL1-mut)熒光素酶報告載體。將處于對數(shù)生長期的MG-63細胞以密度為5×105個/孔接種于6孔板。當細胞融合度達70%左右時采用LipofectamineTM2000分別共轉染CX3CL1-wt或CX3CL1-mut報告載體和miR-432載體(觀察組)，并設置共轉染miR-NC載體作為對照組。轉染48 h時，采用雙熒光素酶試劑盒檢測相對熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的比值表示相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 各組miR-432表達比較 MG-63細胞及hFOB1.19細胞miR-432相對表達量分別為0.53±0.02、1.00±0.04，兩者比較P<0.01。miR-NC組、miR-432 inhibitor組、miR-432組細胞miR-432相對表達量分別為1.00±0.01、0.47±0.03、3.62±0.03，組間比較P均<0.01。

2.2 各組細胞增殖情況比較 miR-432組培養(yǎng)24、36、48 h的A值均低于miR-NC組、miR-432 inhibitor組，miR-432 inhibitor組均高于miR-NC組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組細胞增殖情況比較

注：與miR-NC組同時間點比較，*P<0.05；與miR-432 inhibitor組同時間點比較，△P<0.05。

2.3 各組細胞遷移能力比較 miR-432 inhibitor組及miR-432組細胞相對遷移率分別為(122±7)%、(65±4)%，組間比較P均<0.05。

2.4 各組細胞侵襲能力比較 miR-432 inhibitor組及miR-432組細胞相對侵襲率分別為(189±25)%、(49±11)%，組間比較P均<0.05。

2.5 miR-432下游靶基因 CX3CL1-wt和miR-432共轉染MG-63細胞后，對照組和觀察組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.13、0.52±0.18，兩組比較P<0.05；CX3CL1-mut和miR-432共轉染細胞后，對照組和觀察組相對熒光素酶活性分別為1.00±0.11、0.93±0.13，兩組比較P>0.05。

3 討論

隨著新的輔助化療技術的應用，骨肉瘤患者生存率明顯提高，但遠處轉移仍是骨肉瘤治療失敗的主要原因[6]。明確與骨肉瘤轉移密切相關的分子，對于探討骨肉瘤轉移的啟動機制、預防骨肉瘤轉移的發(fā)生、選擇合適的靶點進行干預和治療具有重要意義。

miRNA已被證明通過靶向調(diào)控腫瘤相關基因mRNA表達，從而抑制或促進腫瘤細胞增殖、分化、侵襲及轉移等過程[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-432在卵巢癌、宮頸癌、垂體腺瘤等多種腫瘤組織中低表達，并對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮負性調(diào)控作用[9，10]。miR-432過表達可阻滯神經(jīng)母細胞瘤細胞于G0/G1期，抑制細胞增殖，參與神經(jīng)母細胞瘤的神經(jīng)元分化過程[11]；miR-432在肝癌組織及細胞系中表達明顯下調(diào)； miR-432過表達可抑制肝癌細胞增殖及其成瘤性，其作用機制可能為miR-432靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路[4]；但在黑色素瘤細胞中miR-432異常高表達[12]。目前仍無法明確miR-432是發(fā)揮抑癌基因還是癌基因的作用，推測miR-432的表達和功能可能具有腫瘤類別依賴性。本研究結果顯示，骨肉瘤細胞中miR-432高表達；轉染miR-432或miR-432 inhibitor來提高或降低MG-63細胞中miR-432表達后發(fā)現(xiàn)，過表達miR-432可抑制MG-63細胞增殖、遷移和侵襲，下調(diào)miR-432表達則促進MG-63細胞增殖和轉移，表明miR-432在骨肉瘤細胞中可能發(fā)揮抑癌基因作用。

CX3CL1蛋白屬于CX3C趨化因子家族成員，不僅具有趨化功能，還具有細胞黏附功能。研究發(fā)現(xiàn)，CX3CL1在卵巢癌、乳腺癌細胞中高表達，且其表達水平與腫瘤細胞增殖及轉移密切相關[13]。在惡性程度較高的少突膠質(zhì)細胞瘤中，CX3CL1表達水平與患者總體生存率呈負相關[14]。CX3CL1表達水平亦與前列腺癌轉移及患者預后相關，當用中和性抗體阻滯CX3CL1表達后，前列腺癌細胞的骨轉移明顯減少[15]。在骨肉瘤細胞中CX3CL1表達較正常成骨細胞明顯升高，其通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路上調(diào)細胞間黏附分子1表達，從而介導骨肉瘤細胞轉移[16,17]。本研究我們利用靶基因預測軟件發(fā)現(xiàn)miR-432與CX3CL1基因3′-UTR區(qū)的結合位點，提示CX3CL1可能是miR-432的下游靶基因，并進一步通過雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證預測的可靠性。

綜上所述，miR-432可能通過靶向調(diào)控CX3CL1而抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲；miR-432可作為骨肉瘤治療的一個新靶點。

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韓康(E-mail： 2160952686@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.011

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0037-03

2017-04-30)