miR-373-3p低表達慢病毒載體構建及其對子宮內膜癌細胞增殖遷移的抑制作用

李美儀，徐紅，譚飛非

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530022)

miR-373-3p低表達慢病毒載體構建及其對子宮內膜癌細胞增殖遷移的抑制作用

李美儀，徐紅，譚飛非

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530022)

目的構建人miR-373-3p低表達慢病毒載體，探討miR-373-3p低表達對子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖和遷移能力的影響。方法利用PCR擴增包含miR-373-3p前體序列的目的基因，經酶切后克隆入慢病毒載體GV280中構建GV280-pre-miR-373-3p inhibitor表達載體，通過與包裝質粒共轉染 293T 細胞，進行慢病毒的包裝和滴度測定。分別用空載慢病毒(空載病毒組)及重組慢病毒miR-373-3p(miR-373-3p組)感染HEC-1A細胞，并設立空白對照組。采用RT-PCR法檢測細胞miR-373-3p mRNA的相對表達水平，CCK-8法檢測培養24、48、72、96 h時細胞增殖活力，細胞劃痕和Transwell小室試驗檢測培養24、48 h時細胞遷移能力。結果成功構建了人miR-373-3p低表達慢病毒載體。與空白對照組和空載病毒組比較，miR-373-3p組miR-373-3p相對表達量低，培養48、72、 96 h HEC-1A細胞增殖活力均降低 (P均<0.05)，24、48 h HEC-1A細胞劃痕面積遷移率低， 24 h穿膜細胞數少(P均<0.05)。 空載病毒組及空白對照組各指標比較，P均>0.05。結論成功構建了人miR-373-3p低表達慢病毒載體，miR-373-3p低表達可抑制人子宮內膜癌細胞HEC-1A的增殖、遷移能力。

子宮內膜癌；HEC-1A細胞；微小RNA;miRNA-373-3p；慢病毒載體；細胞增殖；細胞遷移

子宮內膜癌是女性生殖道三大常見惡性腫瘤之一，其發病率和病死率較高， 嚴重威脅女性生命健康[1]。目前子宮內膜癌的治療以手術為主, 但臨床預后差，5年生存率低,尋找有效的早期診斷指標成為腫瘤治療的熱點。microRNA(miRNA)是生物體內一段長18～25 nt非編碼小分子單鏈RNA，通過與目的基因mRNA 的3′端特異性地堿基配對,引起目的 mRNA 的直接降解或抑制其翻譯，從而對基因轉錄后的表達發揮重要調控作用[2]。研究結果表明，miRNA參與多種腫瘤的轉移形成過程[3]。miR-373最早由Voorhoeve提出，在睪丸精原細胞瘤作為癌基因被發現[4]。miR-373在乳腺癌、食管癌、神經膠質瘤、T細胞淋巴瘤等腫瘤中均有異常表達，與癌細胞的增殖、侵襲和轉移密切相關[5～8]，但是有關miR-373在子宮內膜癌中的作用尚未見報道。2016年9月～2017年6月，本實驗通過構建具有抑制作用的miR-373-3p慢病毒載體，觀察miR-373-3p低表達對子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖和遷移的影響,為進一步研究miR-373-3p在人子宮內膜癌細胞HEC-1A中的機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 293T細胞株、人子宮內膜癌HEC-1A細胞株(中國科學院上海生命科學研究院)； 感受態細胞DH5α(天根生化科技有限公司)；慢病毒載體GV280和包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0 (上海吉凱基因公司)；T4DNA連接酶、限制性內切酶AgeI、EcoRI (NEB 公司)；TaqDNA聚合酶( Vazyme公司)，DNA凝膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒(QIAGEN 公司)；Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；TRIzol試劑、熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；CCK-8(日本同仁公司)；胎牛血清、DMEM高糖培養基(Gibco公司)。

1.2 miR-373-3p目的片段的擴增 根據miRBase數據庫提供的has-miR-373-3p基因序列(MIMAT0000726)，使用Primer5.0 軟件設計人pre-miRNA-373-3p inhibitor的PCR引物，引物由上海吉凱基因技術有限公司合成。上游引物(含AgeI 酶切序列)：5′-AATTCAAAAAGAAGTGCTTCGATTTTGGGGTGT-3′,下游引物(含EcoRI 酶切序列)：5′-CCGGACACCCCAAAATCGAAGCACTTCTTTTTg-3′,以含有目的序列的DNA 為模板進行擴增。PCR反應條件:98 ℃ 5 min、98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s，30 個循環; 72 ℃ 延伸 8 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收目的基因片段。

1.3 miR-373-3p慢病毒表達載體的構建及鑒定 將純化回收的 PCR 產物經AgeI 和EcoRI雙酶切后再次回收獲得 pre-miRNA-373-3p inhibitor片段，與線性化載體 GV280以2∶1摩爾比例使用T4連接酶4 ℃連接過夜，連接產物轉化感受態細胞大腸埃希菌 DH5α，挑選的克隆菌落經PCR鑒定為陽性克隆轉化子后進行DNA測序鑒定。序列正確的重組慢病毒載體命名為 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor。

1.4 重組慢病毒的包裝和滴度測定 胰蛋白酶消化對數生長期的293T細胞，以細胞密度為5×106/15 mL接種于10 cm2細胞培養皿，37 ℃、5% CO2培養箱內培養，24 h待細胞密度達 70%～80% 時轉染。將慢病毒表達質粒和 pHelper1.0、pHelper2. 0包裝質粒在Lipofectamine 2000作用下共轉染293T細胞，培養6 h換液，轉染48 h后收集細胞上清液，4 ℃、4 000×g 離心 10 min，除去細胞碎片，經過濾純化后分裝凍存于-80 ℃備用。采用熒光法測定病毒滴度。取對數生長期293T細胞接種于96孔板，每孔4×104個，將慢病毒原液呈10的倍數稀釋成10個階梯后感染細胞。72 h后觀察綠色熒光的表達情況，根據細胞熒光表達情況計算病毒滴度。計算公式：病毒滴度(Tu/mL)=熒光細胞數 / 病毒原液量。

1.5 HEC-1A細胞miR-373-3p表達水平檢測 采用RT-PCR法。將HEC-1A細胞懸液按1×105/孔接種于6孔板中，次日待細胞融合度達30%時，將重組慢病毒(miR-373-3p組)及相應空載慢病毒(空載病毒組)以感染復數(MOI)30感染HEC-1A 細胞，并設立空白對照組，加入5 μL/mL ploybrene增強感染，培養12 h 更換新鮮培養基。72 h后通過熒光顯微鏡觀察熒光表達情況判斷感染效率。收集各組細胞，使用 TRIzol 法提取細胞總RNA，按 miRNA 逆轉錄試劑盒說明書將其反轉錄成 cDNA。以U6為內參，RT-PCR循環參數：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，重復 40個循環。用 2-ΔΔCt法計算各組miR-373-3p相對表達量。

1.6 HEC-1A細胞增殖活力的檢測 采用CCK-8法。取對數生長期穩定轉染的HEC-1A細胞，胰酶消化接種于96孔板,每孔種約3 000個細胞(100 μL)，設置空白對照組、空載病毒組和miR-373-3p組，每組設5個復孔。置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，分別于轉染24、48、72、96 h向各孔中加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃下孵育1 h,使用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的光密度(OD值),并繪制細胞生長曲線。

1.7 HEC-1A細胞遷移能力的檢測 采用細胞劃痕和Transwell小室試驗。細胞劃痕試驗：取HEC-1A細胞消化后按5×104/孔接種于96孔板中。過夜后, 用槍頭比著直尺垂直劃線，用PBS沖洗2遍后, 加入無血清培養基。分別于0、24、48 h顯微鏡下拍照觀察細胞遷移情況。采用image-Pro plus 6.0軟件測量圖片劃痕區域的像素并定量分析劃痕面積遷移率，劃痕面積遷移率=(24、48 h劃痕區域像素-0 h劃痕區域像素)/0 h劃痕區域像素。Transwell小室：收集轉染miR-373-3p后的細胞,以1×104/ 孔接種于Tranwell小孔中。小孔上室加入無血清培養基的細胞懸液200 μL,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基600 μL。培養24 h后用棉簽輕輕擦去小孔上室內細胞,甲醇固定30 min,0.1%結晶紫染色30 min。顯微鏡下隨機觀察5個200倍視野并計數細胞。

2 結果

2.1 慢病毒表達載體測序鑒定 重組慢病毒質粒經 PCR 及測序鑒定，DNA測序結果表明插入的目的片段與miRBase中的序列一致，證實GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor慢病毒表達載體構建成功。

2.2 慢病毒滴度及慢病毒感染HEC-1A細胞的效率 慢病毒三質粒系統共轉染 293T 細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察 293T 細胞可見GFP綠色熒光。慢病毒 GV280-pre-miRNA-373-3p inhibitor病毒滴度約 6×108TU/mL，空載慢病毒滴度約4×108TU/mL。用重組慢病毒和相應空載病毒感染 HEC-1A細胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光表達情況，轉染效率達85%以上。慢病毒成功感染目標細胞。

2.3 各組miR-373-3p的表達 空白對照組、空載病毒組、miR-373-3p組的miR-373-3p相對表達量分別為1.0±0.04、1.12±0.22、0.28±0.08。與空白對照組和空載病毒組相比，miR-373-3p組分別下降72%和75%(P均<0.05)，而空白對照組和空載病毒組比較，P>0.05。

2.4 各組HEC-1A細胞增殖活力比較 與空白對照組和空載病毒組相比, miR-373-3p組在培養48、72、 96 h細胞增殖活力均降低 (P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間細胞增殖活力比較

2.5 各組細胞遷移能力比較 轉染24 h后，空白對照組、空載病毒組、miR-373-3p組HEC-1A細胞劃痕面積遷移率分別為0.19±0.22、0.23±0.01、0.09±0.01，48 h后分別為 0.32±0.03、0.34±0.03、0.16±0.07。24、48 h HEC-1A細胞劃痕面積遷移率低于空白對照組和空載病毒組(P均>0.05)，而空白對照組與空載病毒組比較，P>0.05。空白對照組、空載病毒組、miR-373-3p組穿膜細胞數分別為(79.3±10.50)、(84.7±12.06)、(48.3±9.07)個/HP, 24 h后 miR-373-3p組穿膜細胞數少于空白對照組、空載病毒組 (P均<0.05) , 空白對照組與空載病毒組比較，P>0.05。

3討論

miRNAs 是一類內源性非編碼小分子RNA片段，在基因表達過程中發揮重要的分子調節作用，參與細胞分化、細胞增殖、細胞調亡及血管生成等生理病理過程[9～11]。越來越多的研究發現，miRNA 在腫瘤的發生發展過程中起重要調控作用，并與腫瘤的進程密切相關。

miR-373是 miRNAs-371-372-373家族的成員之一，位于染色質19q13.42上，作為癌基因或者抑癌基因，在多種腫瘤如乳腺癌、食管癌、神經膠質瘤、T細胞淋巴瘤等組織中異常表達，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移[5～8]。研究表明，miR-373在食管癌組織高表達，通過下調基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP3水平促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[6]。在舌鱗狀細胞癌的研究中也發現，miR-373-3p通過抑制DKK1激活Wnt/B蛋白級聯信號通道，誘導上皮間充質轉化從而促進了腫瘤轉移[12]。在胰腺癌中，血清中miR-373低表達與臨床預后不良顯著相關，且miR-373的表達水平與腫瘤分級、分期、遠處轉移密切相關，因此miR-373可能作為新的預測腫瘤的有效標記物和腫瘤治療的潛在靶點[13]。miR-373也可作為抑癌的miRNA，Zhang等[14]發現，miR-373作用于Rab22a減弱卵巢癌的侵襲和轉移能力，從而發揮了抑癌基因的作用。miR-373能下調功能靶點CD44 與 TGFBR2 的表達發揮抑制膠質瘤細胞U251 遷移與侵襲作用，抑制膠質瘤的發生[15]。多項研究表明，miR-373的異常表達影響腫瘤的發生發展，但是有關miR-373和子宮內膜癌的關系尚無報道。

我們前期研究用miRNA雜交芯片對子宮內膜組織進行檢測，并采用qRT-PCR驗證，發現子宮內膜癌組織miR-373的表達較正常子宮內膜組織明顯升高，提示miR-373可能是癌基因，與子宮內膜癌的發生發展關系密切。為了研究miR-373在子宮內膜癌的作用，本實驗通過脂質體共轉染的方法構建低表達miR-373-3p的慢病毒載體，經雙酶切鑒定和DNA測序檢測正確后進行慢病毒包裝及滴度測定。將構建成功的miR-373-3p慢病毒感染HEC-1A細胞，經 RT-qPCR檢測感染后細胞中miR-373-3p表達量明顯下降，經細胞生物功能檢測顯示, 低表達miR-373-3p明顯抑制了HEC-1A細胞的增殖和遷移能力。

綜上所述，本研究構建的miR-373-3p低表達慢病毒載體能夠成功抑制子宮內膜癌miR-373-3p的表達，低表達miR-373-3p的HEC-1A細胞增殖和遷移能力明顯受到抑制，為進一步研究miR-373-3p在子宮內膜癌細胞中的作用機制以及探索miR-373可能作為新靶點治療子宮內膜癌的臨床新方法奠定實驗基礎。

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ConstructionofmiR-373-3plentiviralvectorwithlowexpressionanditseffectonproliferationandmigrationofendometrialcancercelllineHEC-1A

LIMeiyi,XUHong,TANFeifei

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China)

ObjectiveTo construct the lentiviral vector of human miR-373-3p with low expression and to explore its effects on the proliferation and migration of endometrial carcinoma cell line HEC-1A.MethodsPCR was used to amplify the target gene containing pre-miR-373-3p sequence, and we cloned it into GV280 vector with restriction enzymes to construct the GV280-pre-miR-373-3p inhibitor expression plasmid which was co-transfected with packaging plasmid into 293T cells. After viral packaging, the titer of virus was detected. Empty lentivirus (empty virus group) and recombinant lentivirus harboring miR-373-3p (miR-373-3p group) were employed to infect human HEC-1A cells, respectively, and the control group was set up. RT-PCR was used to determine the expression of miR-373-3p in HEC-1A cells. The cell proliferation was measured by CCK-8 assay at 24, 48, 72, and 96 h after culture, and the cell migration was detected by Scratch test and Transwell assay at 24 and 48 h.ResultsHuman miR-373-3p entiviral vector with lower expression was constructed successfully. Compared with the empty virus group and control group, the expression of miR-373-3p in the HEC-1A cells decreased, and cell migration decreased at 48, 72, and 96 h in the miR- 73-3p group (allP<0.05); HEC-1A cell scratch area mobility decreased, and the number of transmembrane cells decreased at 24 and 48 h (allP<0.05). No significant difference was found in the above parameters between the empty virus group and the control group (allP<0.05).ConclusionThe lentiviral vector containing miR-373-3p with low expression is successfully constructed, and low expression of miR-373-3p inhibits the cell proliferation and migration of endometrial cancer cells HEC-1A.

endometrial carcinoma; HEC-1A cells; microRNA; miRNA-373-3p; lentiviral vector; cell proliferation; cell migration

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.006

R737.33

A

1002-266X(2017)45-0020-04

廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目(S201520)。

李美儀(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向為婦科腫瘤的基礎研究。E-mail:1096234457@qq.com

徐紅(1961-)，女，主任醫師，主要研究方向為婦科疾病和婦科腫瘤診治。E-mail:nnxuhong@163.com

2017-09-19)