HRT對餐廚垃圾與秸稈混合高溫厭氧發酵的影響

喬 瑋,尹冬敏,劉月玲,畢少杰,王 菁,董仁杰 (中國農業大學工學院,生物質工程中心,國家能源生物燃氣高效制備及綜合利用技術研發(實驗)中心,北京 100083)

對于全混式厭氧發酵反應器而言,水力停留時間(HRT)和容積負荷直接影響著厭氧發酵系統的容積甲烷產率.如果 HRT過長,就會在一定程度上使得厭氧發酵系統的運行成本增加;但是如果水力停留時間過短,單位時間內流出反應器的菌體增加,進而造成反應器微生物含量降低,有機物還沒有被降解完全就流出反應器.Lgoni[1]指出,不同類型的微生物菌群代謝最短至 30min;各種產乙酸菌的最短世代更替周期1.5～ 4.0d;然而兩類主要的產甲烷菌世代周期差異較大,嗜乙酸產甲烷菌的最短世代周期為2～3d,而嗜氫產甲烷菌的繁衍速度很快,世代周期最短僅需 6h.同時,過高的有機負荷可能會使得系統不穩定,造成揮發性有機酸的累積,影響系統的酸堿平衡,進而影響微生物的代謝能力.有機負荷過低,發酵系統中的微生物則處于低效運行狀態,使得運行成本增加,綜合經濟效益較差[2-3].因此,選取合適的 HRT和有機負荷對于甲烷發酵過程至關重要.

餐廚垃圾是一種非常典型的有機廢物,我國每年產生餐廚垃圾約6000萬t[4].將餐廚垃圾和秸稈混合發酵能夠在原料特性上調節C/N比,在發酵動力學上調節產酸和產甲烷速率的匹配,使發酵過程更穩定.因此,本文以餐廚垃圾和秸稈為共混原料,逐級稀釋進料濃度并梯度縮短HRT,分析產氣量,降解率,pH值和揮發性有機酸等指標的變化規律,獲得高溫發酵微生物洗出的極限HRT;進一步分析隨著HRT的縮短,產甲烷古菌和酸化細菌的組成與變化規律,探索混合原料高溫發酵的產甲烷路徑,為厭氧發酵工藝設計提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

表1 混合原料和接種污泥的基本性質Table 1 Characteristics of materials and inoculums for CSTR

餐廚垃圾取自中國農業大學學生餐廳的午餐剩余物,去除大塊雜質(如骨頭,果核,紙巾,塑料袋和一次性餐具等),用豆漿機(Joyoung-JYLC012)進行 5min的高速破碎,粉碎至漿狀后儲存在 4℃冰箱中備用.玉米秸稈取自北京郊區密云縣石匣村秸稈沼氣站,為曬干后初步粉碎的玉米秸稈.先用小型粉碎機(HC-1000Y2)粉碎,過40目篩,備用.

混合發酵原料為餐廚垃圾和秸稈按照總干物質(TS)比為1：1配比混合,水稀釋至 TS為 8%左右;高溫接種污泥取自北京密云石匣村秸稈沼氣站的高溫厭氧消化污泥,該沼氣站常年運行,實際溫度控制在 50～60℃.混合原料和接種污泥的理化性質如表1所示：

1.2 試驗裝置與運行條件

圖1 厭氧發酵實驗裝置Fig.1 Scheme of experimental device

表2 實驗運行方案Table 2 The summary of experimental digester operation

實驗裝置示意圖如圖1所示,主要包括基質貯藏裝置和發酵裝置兩部分,總容積均為2.5L,工作容積為 2.0L.循環水浴鍋(HH-60)控制溫度,分別維持在(4±1)℃和(55±3)℃.攪拌器與自動計時器相連,每 2h攪拌 10min,轉速約為 50～90r/min.濕式流量計(LML-1)記錄發酵罐的日產氣量.

在探究得到高溫混合發酵系統所能承受的最大有機負荷(OLR)[10gVS/(L?d)]基礎上,逐級縮短 HRT,并不斷降低進料濃度,以保證體系負荷不能超過最大承載負荷.具體實驗運行方案見表2.

1.3 常規指標測試方法

TS,VS,SS和 VSS采用美國水和廢水監測標準方法測定[5];pH值采用玻璃電極(Orion 5-Star pH)測定;COD采用重鉻酸鉀法測定[6];氨氮濃度采用水楊酸-次氯酸鹽分光光度法測定[7];總堿度和碳酸氫鹽堿度用滴定法測定(以碳酸鈣計),采用0.1mol/L的稀鹽酸滴定發酵液上清液pH值至5.4和4.8,分別用以計算碳酸氫鹽堿度和總堿度[8];發酵液中的揮發性脂肪酸(VFA)用GC-2010Plus氣相色譜法測定,測試條件為：載氣(氮氣)分壓 0.4MPa,氫空一體機氣流速度 20～30mL/min,進樣口,柱溫,檢測器(FID)溫度分別為 230,60,250℃,進樣體積 10μL;沼氣成分(CH4和CO2)采用GC SP2100氣相色譜儀測定,色譜柱為Ф10m×2mm不銹鋼色譜柱,測試條件為：載氣(氫氣)分壓 0.4MPa,流速 60mL/min,進樣口,色譜柱,檢測器(TCD)的溫度分別為130,130,116℃;沼氣體積通過濕式流量計(LML-1)測定.

1.4 細菌與古菌分析方法

分別取反應器不同HRT穩定期的料液進行高通量測試.CTAB標準方法對樣本的基因組DNA 進行提取,然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度,無菌水稀釋至1ng/mL,即為PCR擴增模板.16S V4 區引物為515F-806R,18S V4 區引物為 528F-706R,18S V9 區引物為1380F-1510R,ITS1 區引物為 ITS5-1737F,ITS2-2043R,ITS2區引物為 ITS3-2024F,ITS4-2409R.酶和緩沖溶液采用 New England Biolabs公司 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer.采用 PCR 儀(Bio-rad T100 梯度PCR 儀)進行擴增,擴增程序包括一個預變性步驟(98 ℃,1min),30個循環(每個循環包括 98℃,10s;50 ℃, 30s;72 ℃ , 30s),72 ℃ , 5min.產物用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測.等濃度混樣,充分混勻后用 1×TAE 2%的瓊脂糖膠電泳純化 PCR產物,選擇主帶大小400～450bp之間的序列,割膠回收目標條帶.產物純化試劑盒為 Thermo Scientific 公司 GeneJET 膠回收試劑盒.使用New England Biolabs 公 司 的 NEB Next?Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過 Qubit 定量和文庫檢測,合格后,使用HiSeq上機測序.基于有效數據進行 OTUs聚類和物種分類分析.為避免偏差,所有樣品進行3個重復.

1.5 數據分析

所有試驗均為 3組平行測試,表中所列數據為平均值±標準差.采用單向方差分析(one-way analysis of variance (ANOVA))對同組數據進行分析,置信度水平為 0.95.數據分析軟件為Excel2016和Origin8.0.

2 結果與討論

2.1 HRT對反應器性能的影響

甲烷產量是評價一個厭氧消化體系運行性能好壞最關鍵和最直觀的指標,物料單位 VS產氣率越高,說明物料的降解效果越好;反應器容積產甲烷率與整個厭氧消化工程的經濟效益密切相關,反應器容積產甲烷率越高,說明在相同運行成本下,綜合經濟效益越高.圖2(a)顯示,CSTR系統在55d的高溫連續發酵過程中,HRT依次遞減為 5,3,1.5,1,0.5d,對應 OLR依次為 8.0,6.66,6.66(3.33),5.0,5.0gVS/(L?d).隨著 HRT 逐級遞減,沼氣容積產氣率和甲烷濃度都呈逐漸降低的趨勢[圖2(b)].當 HRT 為 5d,OLR 為 8.0gVS/(L?d)時,甲烷濃度穩定在 65.5%左右,此時系統能夠穩定的運行.在本階段的實驗中,系統運行了4個HRT,反應器的沼氣產量在10～20d期間是平穩的,約為4.5L/(L?d).當HRT縮短為3d時,甲烷濃度略有下降,從 69.2%下降到 63.2%,容積產氣率出現明顯下降,從 4.31L/(L?d)下降到 1.23L/(L?d);當 HRT 繼續縮短為1.5d,有機負荷降為3.33gVS/(L?d)時,容積產氣率僅為0.41L/(L?d),pH值,TS和VS的去除率都維持在正常的水平,該階段反應器仍能平穩運行.直到 HRT縮短為 0.5d,OLR為 5.0gVS/(L?d)時,反應體系容積產氣率幾乎為0,甲烷濃度急劇下降,但反應器的 pH值卻沒有明顯下降,說明反應器產氣的下降不是酸積累造成的.此階段現象表明HRT太短,厭氧微生物已經隨著出料流失,使得甲烷發酵終止.

圖2 餐廚垃圾與秸稈混合連續發酵的系統性能Fig.2 Performance of co-fermentation of kitchen waste and straw

在厭氧發酵連續實驗過程中,有機酸的累積表明產酸速率和有機酸分解速率之間的不平衡,反映了產酸菌群和產甲烷菌群的解偶聯作用[9],揮發性有機酸代謝平衡是厭氧發酵反應器穩定運行的關鍵.如圖2(c)所示,pH 值一直穩定在 7.2左右,表明發酵系統酸堿平衡處于相對穩定狀態,當HRT為5d(OLR為8.0gVS/(L?d))和3d(OLR為6.66gVS/(L?d))時,總酸(TVFA)濃度分別由 570 和1060mg/L升高到1380和2230mg/L,其中HRT 5d時乙酸濃度變化不大,穩定在 310mg/L左右,而丙酸濃度則從190mg/L累積達到1062mg/L,所以丙酸累積是該段有機酸濃度升高的主要原因.此階段有機負荷較高,系統對酸的緩沖能力下降,間接影響了產酸菌的代謝活性,增加了高分子量 VFA的生成;而 HRT 3d時丙酸濃度較前一階段降低,濃度穩定在 300mg/L左右,但是這一階段乙酸濃度由530mg/L逐漸累積達到1870mg/L,所以此階段有機酸濃度的升高主要是由乙酸累積導致的.可見隨著進料濃度的降低,丙酸濃度下降,而乙酸濃度升高,說明進料濃度降低時,丙酸在高溫條件下可被產酸菌分解利用產生乙酸.HRT為1.5,1.0d時,乙酸濃度仍保持較高水平,平均值最高達到2200mg/L,而丙酸濃度較低,在100～250mg/L之間浮動,由此階段揮發性有機酸的分布情況可以看出多種酸的存在,表明反應系統進行的是混合型發酵.總之HRT從5.0d逐級遞減為1.0d的各階段,發酵系統都能夠平穩運行至少 4個 HRT,表明高溫條件下的混合發酵系統能耐受更高濃度的有機酸.但是當HRT縮短到0.5d時,由于HRT過短,反應體系已經不再產氣,表明此階段的微生物停留時間(同HRT)不足以維持微生物的生長代謝平衡,微生物被洗出反應器.李蕾等[10]研究表明,高負荷[6gVS/(L?d)]條件下,產酸細菌(柔膜菌門、放線菌門)大量增殖,誘導互養脂肪酸降解菌(梭菌綱)豐度劇增,而與之互營的氫型產甲烷菌的豐度和活性卻下降了.產甲烷菌與互養脂肪酸降解菌的失衡導致它們不能有效的互養合作,從而引起揮發性脂肪酸(VFA)積累和過程失穩.

2.2 HRT對丙酸/乙酸的影響

丙酸/乙酸值的大小是反應發酵系統穩定性的一個重要指標.有研究報道,當丙酸/乙酸值超過 1.4,且乙酸濃度高于 800mg/L時,厭氧發酵系統就會發生酸敗[11-14].

從圖3可以看出,HRT為5d時,丙酸/乙酸值較高,最高可達 4.6左右,但是此階段乙酸濃度較低,低于800mg/L,而HRT從3d遞減為0.5d的過程中,乙酸和 TVFA濃度最高達 3000和3500mg/L,但是丙酸/乙酸值均低于 0.8,也從另一個角度說明整個發酵系統是相對穩定的,未發生酸敗現象.因此,當HRT為0.5d時,系統產氣停止不是系統酸敗引起的,而是由于微生物被洗出引起的發酵失敗,所以 HRT 0.5d為混合原料(餐廚垃圾和玉米秸稈)高溫連續發酵微生物洗出的極限HRT.

圖3 停留時間對乙酸和丙酸濃度的影響Fig.3 Effect of HRT on the acetic and propionic

2.3 HRT對TS和VS去除率的影響

TS體現的是總有機物質和無機物質的總和,VS是產甲烷的主要來源.TS和VS去除率反映的是厭氧發酵系統中混合物料的利用率情況,TS和VS去除率的大小也間接反映了厭氧消化系統中水解產酸菌和產甲烷菌的代謝能力和系統的運行穩定性.圖4為停留時間對TS和VS去除率的影響,從圖2(d)和2(c)及圖4可以看出,當HRT由5d逐漸縮短到1.5d[OLR為6.66gVS/(L?d)]時,TS和VS去除率都逐漸降低,表明HRT太短時,微生物沖刷流失,微生物數量的減少直接影響發酵底物的利用率;當 HRT仍為 1.5d,但是將進料濃度減半后發現,TS和VS去除率有所提高,比降低進料濃度前分別提高80%和20%,這是因為在微生物數量差別不大的前提下,負荷越低,原料降解越充分.同時,從圖中發現,當 HRT降到0.5d時,TS和 VS去除率急劇下降為 5.17%和5.77%,此時反應體系已經不再產氣,表明微生物已經被大量洗出,此時的 HRT(0.5d)就是微生物洗出的界限HRT.

Harrison等[15]論證了處理初沉池中污泥停留時間,在標準中溫消化 35℃條件下,不發生沖刷流失的HRT界限為4.2d,而本研究結果為55℃高溫條件下的界限HRT,在設計時還需考慮HRT的安全率,McCarty[16]推薦最小安全率為2.5,因此,計算得到35℃條件下最小設計HRT為10d,和多數研究者是一致的.本研究結果表明55℃高溫條件下最小設計HRT為1.25d.所以中溫甲烷發酵HRT多設計為 20～30d,而高溫甲烷發酵多為10～15d[17].

圖4 停留時間對TS和VS去除率的影響Fig.4 Effect of HRT on the TS and VS removal

2.4 HRT對菌落結構的影響

2.4.1 細菌群落結構特征的變化 圖5高通量測序結果顯示,餐廚垃圾和秸稈高溫沼氣發酵液中目水平(Order)的優勢菌群均屬于Firmicutes門和Thermotogae門.Firmicutes門是厭氧反應器中主要的水解酸化菌,參與多種復雜有機質的降解,在高溫沼氣發酵中占主導地位[18].報道稱,以玉米秸稈等纖維素原料沼氣發酵的優勢水解細菌屬于 Firmicutes門(Clostridia綱)[19-20],Clostridiales能夠降解糖類,脂肪和蛋白質產酸[21],并與嗜氫產甲烷菌共生(主要為 Clostridium屬),可促進甲烷產生[22].OPB54能夠發酵糖類產乙醇和氫氣[23]. Thermoanaerobacterales能夠水解木質纖維素產乙醇[24].Thermotogae門(超過 98%為S1屬)為反應器中的次主導菌群,是厭氧反應器中主要的水解淀粉,蛋白質產酸菌[25],同時是餐廚垃圾,蔬菜廢棄物等易水解原料沼氣發酵的優勢水解酸化細菌[26].

圖5 不同水力停留時間各階段細菌組成變化Fig.5 The percentage changes of different kinds of bacteria at five HRTs

Zhang等[27]研究了HRT對淀粉沼氣發酵的影響,HRT由 244h降至 12h,酸化程度無明顯變化.HRT由5d降至3,1.5,1和0.5d,進料濃度降低,混合原料中淀粉含量降低,導致淀粉水解菌Thermotogales的比例由41.0%降至6.3%.淀粉等易降解成分的含量降低,消耗速率加快,反應器中纖維素成分的含量相對增加,促使了利用纖維素的Clostridiales和發酵糖類,甘油的OPB54的比例分別由32.9%和3.4%升至66.9%和10%左右.此外,反應器中水解酸化菌還有 Bacteroidales,Synergistales, Rhodocyclales和Xanthomonadales.Bacteridals是纖維素水解菌[28].Synegistales能夠氧化長鏈脂肪酸[29],與產甲烷菌共生,促進甲烷產生.

圖6 不同水力停留時間各階段古菌的組成變化Fig.6 The percentage changes of different kinds of archaeas at five HRTs

2.4.2 古菌群落結構特征的變化 圖6所示,HRT為 5d,餐廚垃圾和秸稈高溫沼氣發酵反應器中嗜氫產甲烷菌 Methanoculleus屬和Methanothermobacter 屬分別占 57.0%和 24.4%,是優勢產甲烷菌,而利用乙酸產甲烷的八疊球菌Methanosarcina占 14.1%,明顯低于嗜氫產甲烷菌的數量.Methanoculleus屬能夠利用H2/CO2,甲酸和乙醇,是玉米秸稈,青貯玉米高溫沼氣發酵中的優勢菌群[19-20],而餐廚垃圾高溫沼氣發酵中的優勢產甲烷菌為 Methanothermobacter 屬(95%～97%)[30-31].與嗜氫產甲烷菌相比,嗜乙酸產甲烷菌對環境的改變更加敏感[32].在本試驗中,隨著HRT的進一步縮短,Methanothermobacter 屬的相對豐度提高,成為優勢菌群,但Lin等[33]研究溫度提升對豬糞沼氣發酵的影響時發現,Methanothermobacter 屬相對豐度的增加不能提高反應器的產氣率.嗜乙酸產甲烷菌Methanosarcina屬的相對豐度則隨HRT的縮短顯著降低,HRT為3,1.5和1d時分別為8.2%,5.8%和1.9%,當HRT縮短到0.5d時,則進一步降低至0.6%.可以推測,隨著 HRT的縮短,系統利用乙酸的能力越來越弱.Ahring等[34]報告嗜乙酸產甲烷菌貢獻了反應器中 70%的甲烷產量.Niu等[35]研究氨氮累積對雞糞高溫沼氣發酵中微生物的影響發現,氨氮抑制前優勢菌群為Methanoculleu屬和Methanosarcina屬,抑制和恢復后,優勢菌群變為 Methanothermobacterium 屬.Zhou[18]和 Lin等

[33]分別在豬糞單獨沼氣發酵和豬糞秸稈混合沼氣發酵時發現,高溫反應器內的優勢菌為Methanothermobacterium,Methanosarcina屬菌株僅占10%.Zhang等[36]研究發現在低HRT下穩定運行時,餐廚垃圾沼氣發酵反應器內的優勢產甲烷菌為嗜氫產甲烷菌.Kobayashi等[37]發現污泥高溫發酵反應器內的古菌組成為72%的 Methanosarcina屬和 28%的Methanothermobacterium屬.可見,在高溫發酵下,嗜氫產甲烷菌發揮了重要作用,而乙酸產甲烷菌不發揮主要作用.那么,可以推測,在高溫短停留時間條件下,甲烷主要來自于二氧化碳和氫,而不是乙酸,乙酸存在通過兩階段式互營途徑產生甲烷的可能,即乙酸首先被互營菌氧化生成二氧化碳和氫,再經嗜氫產甲烷菌轉化成甲烷.

高溫產甲烷菌的增殖速率遠高于中溫產甲烷菌.即使在高溫條件下,嗜乙酸產甲烷菌的菌株倍增時間均在10h以上,增值速率慢;嗜氫產甲烷菌增值速率遠高于嗜乙酸產甲烷菌,部分菌株的倍增時間低于 1h,低 HRT條件下,嗜乙酸產甲烷菌更容易被洗出[38],導致Methanosarcina屬的相對豐度逐步降低.不同類型嗜氫產甲烷菌增值速率存在較大差異, Methanobacterium典型菌株M. congolense DSM 7095T的倍增時間為7.5h,而Methanothermobacterium典型 菌株 M.thermoautotrophicum ATCC 2918T的倍增時間僅為 1.8h,既可以利用氫又可以利用乙酸產甲烷的Methanosarcina barkeri 典型菌株DSM 804T的倍增時間則為 25h,而 Methanosaeta的倍增時間為 24～65h.因此,隨著 HRT 的逐漸縮短,Methanothermobacterium屬菌株更易在反應器中富集.

3 結論

3.1 HRT由5d逐級縮短至3,1.5和1d,對應OLR依次為 8.0,6.66,3.33,5.0gVS/(L?d),系統運行穩定.VS去除率逐級遞減至23.08%,產氣率和容積產氣率不斷減小,pH值穩定在 7.2左右,丙酸/乙酸值均低于0.8.當HRT降為0.5d時,pH值穩定在7.0左右,且未出現VFA累積,但反應器幾乎停止產氣,微生物發生沖刷流失,VS去除率僅為5.77%.

3.2 餐廚垃圾和秸稈混合沼氣發酵過程中,HRT逐級遞減至0.5d,嗜氫產甲烷菌(主要為Methanomicrobiales)的比例由 85.9%增至99.1%,而嗜乙酸產甲烷菌由 14.1%降至 0.6%,嗜氫產甲烷途徑是餐廚垃圾和秸稈高溫共發酵的主要途徑.

3.3 隨著 HRT減少,嗜乙酸產甲烷途徑受到限制.同時,Clostridiales等能夠與產甲烷菌共生的水解酸化細菌的比例增加了近 1倍,推測乙酸氧化菌與嗜氫產甲烷菌共生是乙酸降解的主要途徑.

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