太子參通過MAPK信號轉導通路促進人臍靜脈內皮細胞增殖

林少兵 ，蔣宗勝 ，阮君山 ，2，王少明 ，2

（1.福建醫科大學省立臨床醫學院，福建 福州350001；2.福建省立醫院中醫藥分子生物學實驗室，福建 福州350001；3.福建醫科大學藥學院，福建 福州350122）

太子參通過MAPK信號轉導通路促進人臍靜脈內皮細胞增殖

林少兵1，蔣宗勝3，阮君山1，2，王少明1，2

（1.福建醫科大學省立臨床醫學院，福建 福州350001；2.福建省立醫院中醫藥分子生物學實驗室，福建 福州350001；3.福建醫科大學藥學院，福建 福州350122）

目的 通過太子參及主要成分環肽B（HB）對人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖的影響，研究其相關作用機制。 方法 CAM雞胚絨毛尿囊膜實驗測定太子參對血管生成的影響；CCK8檢測法檢測HB對HUVEC的增殖和毒性；劃痕實驗檢測HB對HUVEC增殖和遷移的影響；ELISA檢測HB通過影響哪種細胞生長因子影響HUVEC的生長發育；Western Blot測定MAPK信號轉導通路中各蛋白的表達，分析其相關作用機制。結果 太子參具有促進血管生成的作用；0～100 μg／mL HB可促進HUVEC增殖；隨著時間推移，HUVEC快速地向劃痕中間遷移，并且隨著HB濃度的增加，HUVEC遷移的速度和強度也隨著增強；HB通過影響VEGF的表達促進HUVEC細胞的增殖；HB通過激活MAPK信號轉導通路促進HUVEC細胞的增殖。 結論 太子參具有促進血管生成的作用，作用機制與激活MAPK信號轉導通路，促進細胞的增殖有關。

太子參；環肽B；人臍靜脈內皮細胞；血管生成

血管生成是指從已有毛細血管或毛細血管后靜脈發展而形成新血管［1］，主要包括：血管基底膜降解；血管內皮細胞的激活、增殖、遷移；重建形成新血管和血管網，是一個涉及多種細胞的復雜過程。血管生成是目前研究熱點，涵蓋幾乎所有臨床學科，尤其是心血管和腫瘤領域的研究較為突出［2］。

太子參為石竹科太子參屬植物，主要成分為太子參多糖、多種氨基酸和微量元素。有研究表明：太子參具有抗氧化的特性［3］，且對心肌細胞具有一定的保護作用［4］，但當前作用機制尚未明朗。本研究以環肽B（HB）促進人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖為切入點，進一步研究太子參促進血管生成的作用機制，為太子參在血管生成領域提供更合理的用藥依據。

1 材 料

1.1 試劑 SPF種雞蛋（福建省大北農生物技術有限公司）；重組人血管內皮抑制素（商品名：恩度，山東先聲麥得津生物制藥有限公司）；重組牛堿性成纖維細胞生長因子（商品名：貝復舒，珠海億勝生物制藥有限公司）；HUVEC（上海漢博生物科技有限公司）；HB（成都普瑞法科技開發有限公司）；DMEM基礎培養基、血清、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液，美國通用醫療生命科學有限公司）；CCKB試劑、Westem Blot試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；VEGF165試劑盒（武漢云克隆有限公司）；FGF2試劑盒（武漢云克隆有限公司）；Erk1／2、Mek1 ／2、Raf-1（上海斯信生物科技有限公司）；β-actin、IgG（H＋L）（北京麥爾泰克科技有限公司）。太子參水提物由福建省立醫院制劑室自制。

1.2 培養條件 HUVEC于36.9℃、5%CO2的培養箱中培養，培養基為DMEM基礎培養基加15%血清和1%雙抗。

2 方 法

2.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實驗測定太子參對血管增殖的影響 配制濃度為2、5、10 mg／mL的太子參水提物。選擇表面清潔，蛋殼均質的SPF種雞蛋，孵育于5%CO2、36.9℃恒溫箱。孵蛋至第 8天，酒精消毒蛋殼表面，去除蛋殼，剪除卵殼膜（大概1.5 cm×1.5 cm），制備假氣室［5］。將滅菌后的濾紙以1 cm×1 cm的規格剪取，作為載體置于CAM中。制作成功的 CAM 模型分成空白組、低（2 mg／mL）、中（5 mg／mL）、高（10 mg／mL）劑量組，每組 8 個 CAM 模型，做好標記。用微量加樣器將0.06 mL藥物滴到各組載體中，加完藥后用透明膠封閉加藥窗，放入5%CO2、36.9℃恒溫箱中繼續孵育，連續加藥3 d。3 d后，由加藥窗滴入甲醛∶丙酮＝1∶1的固定液預固定 15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科鑷完整剪下CAM中心待觀察區域，置于蒸餾水中，吸管吹打CAM，使其舒展開來，立即拍照保存。使用相關軟件分析圖像，根據管徑將血管分類：管徑≥0.1 mm為大血管；0.1 mm＞管徑≥0.05 mm為中血管；管徑＜0.05 mm為小血管。

在確定最適合細胞生長藥物濃度后，用同樣的方法將制作成功的CAM模型分成空白組、最適合細胞生長藥物濃度組、貝復舒組、恩度組，每組8個CAM模型，觀察各組藥物對血管增殖的影響。

2.2 CCK8檢測法檢測細胞增殖和毒性 制備HUVEC細胞懸液并計數，稀釋細胞懸液，以每孔2 000個HUVEC接種到96孔板中，5%CO2、36.9℃恒溫箱培養 24 h 后，以 8 濃度梯度（0、20、30、50、60、80、100、150、200 μg／mL） 6 個復孔的形式加入 HB。 細胞培養48 h后，每個孔加20 μL CCK8試劑，CCK8作用1.5、3、4 h時，在波長450 nm下測各孔吸光度，實驗結果取平均值［6］。

2.3 劃痕實驗檢測HB對HUVEC增殖和遷移的影響 用marker筆在6孔板背后劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道。在6孔板中選4個孔，每孔加入70 μL（約含 5×105個 HUVEC）細胞懸液，放入 5%CO2、36.9℃恒溫箱。待細胞鋪滿板孔，用槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗去劃下的細胞，加入 0、30、60、90 μg／mL HB 組的培養基，放入5%CO2、36.9℃恒溫箱。 在 0、6、12、24 h 時拍照，記下劃痕的間距。做3次實驗，算平均值。

2.4 ELISA檢測 VEGF、FGF2的表達情況 將HUVEC 分為 4 組，每組含 0、30、60、90 μg／mL HB，設5個孔，培養24 h。24 h后，用0.25%胰酶消化，離心收集細胞，將收集到的細胞用冷 PBS洗3次，制備PBS細胞懸液。取適量 PBS重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，反復凍融3次，使細胞溶脹破碎。于 2～8℃ 500 g離心10 min，收集上清備用。根據ELISA試劑盒說明書的操作檢測VEGF、FGF2的表達情況。

2.5 Western Blot檢測MAPK信號轉導通路中蛋白表達情況 取一個培養瓶的細胞，用預冷過的PBS 洗 3 遍，加裂解液 300 μL（RIPA 裂解液∶PMSF＝100∶1），30 min 后，用槍頭刮下細胞（此操作在冰上進行），12 000 rpm，冷凍離心 10 min，取上清液200 μL，加入 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液 40 μL，98℃高溫變性10 min，BCA法檢測蛋白含量。SDSPAGE電泳，轉膜，加一抗，4℃過夜，TBST洗5次，加二抗，孵育2 h，TBST洗5次，加發光劑ECL化學發光。將膠片掃描存檔，凝膠圖像分析目標帶的光密度值。

2.6 統計學方法 以上實驗均重復3次，采用SPSS22.0版本軟件進行統計分析。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用 t檢驗。

3 結 果

3.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實驗 雞胚在5%CO2、36.9℃恒溫箱正常發育，孵育40個，成功37個，制作成功率為92.5%。空白組CAM膜與載體融合，部分中、小血管貫穿；低劑量組的中、小血管較多，沒有大血管，血管呈點狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.2 cm內；中劑量組的血管增生最多，平均每個雞胚有2.1根大血管，中、小血管的密集，血管呈樹突狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.5 cm內；高劑量組的雞胚在加藥后死亡2個，基本沒有大、中血管，有大量細小血管圍繞，細小血管以載體為中心呈包繞或放射狀分布。因此最適合細胞生長藥物濃度組為中劑量組。

貝復舒組血管增生最多，大、中血管比較多，每個雞胚有2～4根大血管，呈樹突狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.8 cm內；恩度組抑制作用非常明顯，雞胚只存活2個，且存活雞胚的血管多為零星分布的細小血管。如表1所示，中劑量組與空白組比較，血管數有顯著性差異（P＜0.05），說明太子參有促進血管生成的作用。

表1 各藥物組與空白組血管數比較（x±s） 根

3.2 CCK8檢測法檢測HB對HUVEC的增殖和毒性 實驗顯示HB影響HUVEC的增殖，如圖1所示：0～100 μg／mL HB 促進 HUVEC 增殖，150、200 μg／mL HB抑制細胞的生長。

3.3 HB促進HUVEC增殖和遷移 如圖2、表2所示，隨著時間的推移，HUVEC快速地向劃痕中間遷移，并且隨著HB濃度增加，HUVEC遷移的速度和強度也隨著增強，與空白組比較，愈合程度有顯著性差異（P＜0.05）。

3.4 HB通過增加VEGF的表達促進HUVEC細胞增殖 如圖3所示：隨著HB濃度的增加，VEGF的表達隨著增加，不同濃度間VEGF的表達有顯著性差異（P＜0.05），FGF2的表達不受環肽 B濃度影響。

圖1 不同濃度HB作用后測得的HUVEC吸光度值

表2 不同濃度HB在不同時間劃痕的愈合程度（x±s）%

圖2 不同濃度HB在不同時間劃痕的愈合程度

圖3 ELISA檢測VEGF、FGF2的表達情況

3.5 HB 激活 MAPK（Ras／Raf／Mek／Erk）信號轉導通路促進 HUVEC細胞增殖 Ras／Raf／Mek／Erk信號轉導通路作為MAPK眾多信號通路中的一個，是細胞生長發育最重要的信號轉導通路之一，參與HUVEC細胞生長、轉移等過程。本實驗檢測了HUVEC 細 胞 中 Kras、Raf-1、Mek1 ／2、Erk1／2 的 表達水平，結果如圖4所示：隨著HB濃度的增加，HUVEC 細胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表達水平顯著增加，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖 4 HUVEC 細胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表達情況

4 討 論

應用藥物刺激小血管生長，促進血管生成，已成為目前心血管領域的研究熱點之一。CAM是雞胚外的一層膜，主要功能是提供氣體交換的表面，其功能依賴于致密的血管網支撐，正是由于雞胚發育過程中大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發生和形成提供了良好的模型［7］。本研究表明：太子參能促進血管內皮細胞的增殖、遷移，且作用比較緩和，此結果為太子參治療相關疾病提供新的依據。

血管生成過程復雜，與多種細胞因子有關。目前，對促進血管生成的血管生成因子研究最多的為FGF和VEGF。本研究利用ELISA的敏感性、高特異性檢測HB對HUVEC中FGF和VEGF的影響情況，證明HB是通過影響VEGF的表達促進HUVEC細胞的生長發育。

目前已知，所有真核細胞中均存在Ras／Raf／Mek／Erk這一信號轉導通路，VEGF、源生長因子（PDGF）等與其受體結合后，可通過刺激 Ras-二磷酸鳥苷（GDP）轉換為 Ras-三磷酸鳥苷（GTP），從而導致Ras激酶過度活化，進而以這種自體磷酸化方式激活 Ras／Raf／Mek ／Erk 信號通路［8］，啟動相應轉錄子的轉錄，進而導致細胞的增殖分化。本文通過測定 Ras／Raf／Mek／Erk 這一信號轉導通路中各蛋白的表達水平，結果顯示：隨著HB濃度的增加，各蛋白的表達水平也隨著增加，說明HB通過Ras／Raf／Mek／Erk這一信號轉導通路促進HUVEC細胞的增殖。但各蛋白的表達水平并不呈規則的趨勢上升，考慮其不只是影響 Ras／Raf／Mek／Erk 這一信號轉導通路，還通過其他信號轉導途徑促進HUVEC細胞的增殖，這需要更多的研究予以證實。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0016-04

2017-09-18

國家自然科學基金面上項目（81273647）；福建省自然科學基金項目（2013J01365）；福建省衛生系統中青年骨干人才重點項目（2015-ZQN-ZD-2）；國家衛計委共建科學研究基金項目（WKJ-FJ-19）

林少兵（1983—），男，主管藥師，主要從事藥學工作。

王少明（1958—），男，主任藥師，碩士研究生導師。E-mail：cnfjwsm@163.com