紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞再生的作用研究

韓 靜 ，張繼州 ，肖 慶 ，胡 娟 ，2

（1．福建省中醫藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞再生的作用研究

韓 靜1，張繼州1，肖 慶1，胡 娟1，2

（1．福建省中醫藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

目的 探討紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織神經再生的作用。 方法 SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和紅景天苷組，采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型，紅景天苷組于造模后給予紅景天苷（40 mg／kg）腹腔注射，每日1次，連續7 d；其余2組腹腔注射生理鹽水。于再灌注后第1、3、7 d，采用改良神經功能缺損評分（mNSS）、平衡木試驗、足失誤試驗評價動物神經功能恢復狀況；采用免疫熒光化學方法檢測側腦室下區（SVZ）和海馬齒狀回（DG）細胞增殖標記5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和新生神經細胞標記DCX的表達。 結果紅景天苷組大鼠的mNSS評分、平衡木試驗評分、足失誤比率均較模型組顯著降低（P＜0.05）；在大腦SVZ區和海馬DG區，紅景天苷組BrdU和DCX的表達較模型組均顯著升高（P＜0.05）。 結論 紅景天苷可改善腦缺血損傷大鼠的神經行為學癥狀，其機理可能與紅景天苷可促進腦組織內源性神經再生相關。

腦缺血；神經干細胞再生；DCX；BrdU；紅景天苷

近年來研究發現，中樞神經系統存在具有多向分化潛能的神經干細胞（neural stem cell，NSC），在腦缺血損傷發生時，內源性的神經干細胞可出現再生、遷移和分化，幫助神經功能恢復。然而，病理狀態下腦缺血誘發的神經再生不足以支持機體神經功能的全面康復［1］，因而，采用各種手段或者藥物促進內源性神經干細胞的再生是目前腦缺血神經損傷后康復方法的研究熱點。

紅景天苷是藏藥紅景天根和根莖中主要活性成分，藥理活性廣泛，具有耐缺氧、增強免疫、抗疲勞、抗輻射、抗自由基損傷等多種藥理作用［2］。課題組前期研究發現：紅景天苷在大鼠腦缺血再灌注急性期可減少腦梗死體積，增強腦組織的抗氧化能力，具有顯著的神經保護作用［3］。本研究觀察紅景天苷對腦缺血大鼠神經行為康復的作用，并以5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）與微管相關蛋白Doublecortin（DCX）作為新生神經細胞的標記物，從腦內神經干細胞增殖、再生狀況，探討紅景天苷對腦缺血后神經再生的作用。

1 材 料

1.1 動物 雄性SD大鼠，280～340 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號：SCXK（滬）2015-0002］，光暗周期 12／12 h下飼養，自由飲食。

1.2 藥品與試劑 紅景天苷粉劑（南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-131216）；兔抗DCX抗體（美國Abcam公司，批號：ab18723）；大鼠抗BrdU 抗體（美國 Abcam 公司，批號：ab6326）；2×SSC液、免疫熒光封閉液、一、二抗稀釋液、抗淬滅封片劑（上海碧云天生物技術有限公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡系統（德國Leica儀器有限公司）

2 方 法

2.1 大鼠腦缺血再灌注模型制作 采取線栓法制作大腦中動脈閉塞／再灌注模型［4］。動物術前禁食不禁水12 h。腹腔注射3 mL／kg 10%水合氯醛麻醉，仰臥位行頸部正中切口，分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），結扎 ECA，電凝其分支；夾閉CCA和ICA，在ECA距頸動脈分叉3 mm處剪1小口，將線栓經ECA插入ICA，進線有輕微阻力時停止；此時線栓頭端距CCA分叉處約18 mm，堵住大腦中動脈（MCA）開口，制成MCAO模型。造模后2 h，以半劑量水合氯醛再次麻醉動物，拔出線栓，術后24～26℃條件下飼養大鼠。假手術組除不在頸內動脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。

模型制作后按Longa神經功能缺失評分標準［5］進行評分，0分：活動正常，無明顯神經缺損癥狀；1分：提尾懸空時不能完全伸展左側前爪；2分：行走時身體向偏癱的左側轉圈，即追尾征；3分：行走時向偏癱的左側傾倒；4分：不能自發行走或清醒障礙。評分為1～3分者為造模成功。

2.2 動物分組給藥及BrdU標記 SD大鼠隨機分為假手術組和手術組，按前述方法造模。手術組動物再灌注后按Longa神經功能缺失評分標準［5］進行評分，然后立即根據評分結果隨機分為模型組和紅景天苷組。紅景天苷組于造模當天評分分組后立即腹腔注射紅景天苷40 mg／kg，隨后每天1次，連續給藥7 d；模型組和假手術組腹腔注射生理鹽水。BrdU標記于取材前1 d進行，動物腹腔注射1%BrdU水溶液50 mg／kg，每隔2 h注射1次，共4次，次日取材。

2.3 動物神經行為學評價 大鼠腦缺血再灌注后第1、3、7天采用以下3種神經行為學評價方法進行神經損傷程度評分。

2.3.1 mNSS評分 參照文獻［6］，進行改良神經損傷嚴重度評分（modified neurological severity score，mNSS），該評分范圍0～14分，綜合了動物感覺、運動、平衡及反射的表現。0分為神經功能正常；1～5分為神經功能輕度損害；6～9分為神經功能中度損害；10～14分為神經功能重度損害。

2.3.2 足失誤試驗 參照文獻［7］，進行足失誤試驗。實驗大鼠放置在1個45 cm×30 cm、高于地面2.5 cm的網格平板上，網格的尺寸是2.5 cm×2.5 cm。正常大鼠在網格上行進時爪子會放在網格線的交叉處；發生神經損傷時，大鼠失去正確放置爪子的能力，前肢會掉落在網格中。當爪子掉落或滑落在網格線之間，記錄為1次足失誤。記錄3 min內雙側前肢行走步數及其中左側前肢的足失誤次數，以足失誤次數占總的前肢行走步數的百分比代表足失誤評分。

2.3.3 平衡木試驗 參照文獻［8］，進行平衡木平衡試驗，該試驗評價大鼠肢體的協調和平衡能力。大鼠放置在一根寬1.5 cm、長30 cm、高于地面30 cm的木條上，觀察其行為表現，評分為0～6分。0分：保持平衡穩定；1分：抓緊平衡木邊緣；2分：抓緊平衡木并一只腳落下；3分：抓緊平衡木并兩只腳落下，或在平衡木上旋轉，時間≥60 s；4分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下，時間≥40 s；5分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下，時間≥20 s；6分：落下，沒有試圖保持平衡或抓住平衡木，時間≤20 s。評分越高神經損傷越嚴重。

2.4 免疫熒光化學染色及圖像分析 最后1次給藥結束后2 h，各組取5只動物，麻醉，4%多聚甲醛經心臟灌注固定，取腦，經蔗糖梯度脫水，制作30 μm厚冠狀冰凍切片。選取冠狀面位于前囟前1.7～1.0 mm（含側腦室下區）和前囟后4.16～5.20（含海馬）的切片，BrdU和DCX的免疫熒光染色采用漂片法進行，切片經0.01MPBS洗滌，在含甲酰胺的2×SSC液中于65℃孵育2 h，經2×SSC液洗滌后，在2N鹽酸中37℃水浴30 min，在0.1M硼酸（pH 8.5）洗滌2次；經PBS漂洗后，在山羊血清中室溫封閉1 h，抗 BrdU 抗體（1∶200）和抗 DCX 抗體（1∶1 000）中4℃孵育過夜；然后2種熒光標記二抗（1∶200）在37℃避光孵育各1 h；最后將切片裱于載玻片，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

采用Image J 1.50圖像分析軟件進行半定量分析測定SVZ區和海馬DG區BrdU和DCX免疫熒光強度，各組每例動物均拍攝2張含SVZ區和海馬DG區的腦片，每張切片拍攝5個連續視野，軟件測定免疫熒光強度。

2.5 統計學方法 采用SPSS 19．0統計軟件進行數據處理。計量資料屬正態分布的以（x±s）表示，組間比較采用LSD-t檢驗。

3 結 果

3.1 紅景天苷改善腦缺血再灌注大鼠神經損傷程度 給藥前的神經功能評分結果顯示：模型組Longa評分為（1.88±0.64）分，紅景天苷組評分為（1.75±0.71）分，2組評分比較無顯著性差異（P＞0.05），表明給藥前2組動物神經功能損傷程度相當。給予藥物治療后3組大鼠神經行為學評分見表1，表1顯示：紅景天苷可顯著改善腦缺血大鼠的神經行為學功能及肢體平衡力和協調性。

表1 3組大鼠mNSS評分、足失誤評分、平衡木試驗評分比較（x±s） 分

3.2 紅景天苷對SVZ區和海馬DG區BrdU和DCX表達的作用 免疫熒光化學染色結果見圖1和圖3。BrdU細胞增殖標記和神經前體細胞的DCX陽性標記主要分布于側腦室下區（SVZ區）和海馬齒狀回（DG區）。假手術組SVZ區和DG區有少量BrdU和DCX陽性細胞分布，熒光強度定量分析結果見圖2和圖4。模型組SVZ區和DG區BrdU和DCX免疫熒光強度增加，給予紅景天苷治療后可顯著增加SVZ區和DG區BrdU和DCX的免疫熒光強度。

圖1 3組大鼠SVZ區BrdU和DCX免疫熒光染色圖（×200）

圖2 3組大鼠SVZ區BrdU和DCX免疫熒光染色強度比較

4 討 論

本課題組前期研究顯示：于大鼠腦缺血再灌注即刻給予紅景天苷，24 h后即可表現出顯著的神經保護作用［3］。本研究觀察紅景天苷對腦缺血再灌注大鼠神經行為康復的作用，其中，mNSS評分是對動物感覺運動功能的綜合評價，足失誤試驗評價大鼠的前肢定位功能，平衡木試驗評價大鼠肢體的協調和平衡能力。結果顯示：連續7 d給予紅景天苷對于改善腦缺血所致的神經行為功能障礙作用同樣顯著，更進一步確證了紅景天苷的神經保護作用。

圖3 3組大鼠海馬DG區BrdU和DCX免疫熒光染色圖（BrdU：×100，DCX：×50）

圖4 3組大鼠海馬DG區BrdU和DCX免疫熒光染色強度比較

成年嚙齒類動物和成人腦中的NSC群主要存在于側腦室下區（SVZ）和海馬齒狀回（DG）的顆粒下區（SGZ）。BrdU可選擇性地整合到進入S期細胞的核基因組，從而標記處于分裂狀態的細胞，因而可作為NSC增殖的標記［9］。DCX是一種促進微管聚合的微管相關蛋白，代表遷移的成神經細胞和新生神經前體細胞，可作為神經元前體細胞的特異性標志物。

本研究顯示：大鼠腦缺血再灌注損傷后，SVZ區和海馬DG區BrdU表達顯著增加，表明大鼠腦神經生發區出現了神經細胞的增殖；同時，DCX表達亦增加，表明腦缺血誘發神經前體細胞的新生。這一結果與以往研究認為腦缺血可誘發神經再生相符。在腦缺血再灌注模型上給予紅景天苷治療后觀察到，大鼠腦神經生發區BrdU和DCX的表達均較模型組有顯著升高，表明紅景天苷具有促進神經細胞增殖和神經前體細胞新生的作用。既往有研究報道，紅景天苷可促進AD模型小鼠海馬區神經新生［10］，紅景天苷在體外可誘導多能干細胞向神經元樣細胞的定向分化［11］，誘導其表達 BDNF、NGF 等神經營養因子［12］，還可促進原代培養的海馬神經干細胞向神經元方向的分化，對所分化的神經元細胞具有促進生長發育的作用［13］，這些研究提示紅景天苷在體外具有促神經再生的作用。本研究在成年大鼠腦缺血再灌注模型上觀察到紅景天苷促進內源性神經干細胞增殖的作用，為紅景天苷促神經再生作用提供了體內作用的依據。

中樞神經系統的神經再生包括神經干細胞的自我更新（增殖）及遷移分化。本項目研究所采用的BrdU標記方式為沖擊式的給藥方式，因BrdU標記至取材的時間間隔較短，因此僅可標記處于增殖狀態的細胞，尚不能顯示這些細胞隨著疾病進程的變化，無法分析增殖細胞的分化方向。本研究未觀察到BrdU與DCX雙標細胞的變化，因此并不能明確神經干細胞的分化方向。但實驗結果仍可表明，紅景天苷對于腦缺血后腦組織神經干細胞的增殖具有促進作用，有進一步研究的意義。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0020-04

2017-09-03

福建省自然科學基金項目（2014J01340）；福建省衛計委中青年骨干人才培養項目（2014-ZQN-JC-32）；福建省教育廳高校青年自然基金重點項目（JZ160442）

韓靜（1980—），女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理學研究。

胡娟（1962—），女，教授。 E-mail：huj@fjtcm.edu.cn