鉤吻總堿對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

李德森 ，廖華軍 ，蘇志敏 ，陳 亮 ，王文義 ，陳 欣 ，吳水生

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.永春縣醫院，福建 永春 362600；3.福建中醫藥大學附屬福州中醫院，福建 福州 350001）

鉤吻總堿對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

李德森1，廖華軍1，蘇志敏2，陳 亮3，王文義1，陳 欣1，吳水生1

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.永春縣醫院，福建 永春 362600；3.福建中醫藥大學附屬福州中醫院，福建 福州 350001）

目的 研究鉤吻總堿對雞胚絨毛尿囊膜（CAM）新生血管生成的影響。 方法 制備CAM模型，取50個雞胚隨機分為5組：空白對照組、陽性對照組及實驗組（鉤吻總堿高、中、低劑量組），于CAM上植入混合纖維素酯微孔濾膜藥物載體，實驗組加入不同濃度的鉤吻總堿，空白對照組不加藥品，陽性對照組加入PBS溶液，觀察各組CAM新生血管生長的情況。 結果 鉤吻總堿高、中劑量組及陽性對照組均有抑制CAM新生血管生成作用，而鉤吻總堿低劑量組無抑制作用，與空白對照組作用相當。 結論 鉤吻總堿具有抑制CAM新生血管生成的作用，并呈量效關系。

雞胚絨毛尿囊膜；新生血管生成；鉤吻總堿

鉤吻 Gelsemiumelegans（Gardn.etChamp.）Benth.系馬錢科Loganiaceae鉤吻屬Gelsemium植物，生物堿既是其活性成分，也是毒性成分，具有鎮痛、抗炎、散瞳、抗腫瘤、抑制心臟收縮、升壓、抑制平滑肌、促進免疫等多種藥理功能［1-2］。長期以來，民間將鉤吻用于治療風濕痹痛、濕疹、皮癬、神經痛等癥，其具有良好的抗腫瘤、鎮靜鎮痛、散瞳、影響免疫功能等多種藥理功能，尤其在延長肝癌患者生存期和腫瘤患者鎮痛方面有獨特的優勢［3］。惡性腫瘤侵襲轉移過程中，新生血管形成是必要條件，近年來，抗腫瘤血管生成已成為腫瘤防治的一個重要途徑。而鉤吻是否能影響血管生成，通過系統性的文獻回顧，并未發現鉤吻總堿對血管生成的實驗研究。雞胚絨毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）技術因具有取材方便、易于觀察、操作簡單、成本低廉、實驗周期短、可重復性高等優點，目前已被廣泛應用于血管生成及轉移等研究［4］，因此本實驗擬研究鉤吻總堿對CAM血管生成的抑制情況。

1 實驗材料

1.1 試劑與儀器 鉤吻總生物堿提取物［5］（以下簡稱鉤吻總堿），由福建中醫藥大學藥學院提供，用二甲基亞砜（DMSO）溶液配制成 500 mg·mL-1的母液，于 4℃保存待用，實驗時配制成低劑量（50 μg·mL-1）、中劑量（100 μg·mL-1）、高劑量（200 μg·mL-1）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、甲醛、丙酮、石蠟、新潔爾滅（福州精銳生物技術有限公司）；YZ-875SA型超凈工作臺（蘇州凈化集團公司）；CO-25型恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；高壓消毒鍋（HVE50，上海天呈科技有限公司）；數碼相機［D90／18-200，尼康映像儀器銷售（中國）有限公司］；混合纖維素酯微孔濾膜（孔徑0.22 μm，上海興亞凈化材料廠）。手術相關器械由福建中醫藥大學醫學研究中心提供。

1.2 種蛋 貴妃雞受精種蛋，重量45～55 g，購自江西省吉安市泰和烏雞哥生態農場。

2 實驗方法

2.1 CAM模型制備 參照文獻［6-8］。

2.1.1 雞胚準備 新鮮種雞蛋50只，以0.1%新潔爾滅消毒，待種蛋表面干燥后，置于恒溫孵育箱，設置溫度37.8℃、相對濕度60%的環境中孵化，每日自動翻轉2次，第3天檢卵燈照蛋，拋棄無血管雞胚。

2.1.2 開窗 雞胚發育3 d，選取發育良好的雞胚，用酒精棉球消毒2遍，在超凈工作臺無菌條件下于外殼上開10 mm×10 mm大小的開口，暴露絨毛尿囊膜，具體操作如下：① 取雞胚，于檢卵燈下標記氣室及胎位，并在胎位附近無大血管處畫一記號；用碘酒、乙醇消毒氣室頂部和記號處，然后在氣室頂部鉆一小孔，同時用小鋼鋸在記號處將卵殼磨一個和縱軸平行的裂痕，勿傷及殼膜；將卵平放，輕輕將裂痕處卵殼去掉，勿傷及殼膜；于殼膜上刺破一小縫但不傷及下面的絨毛尿囊膜，滴加無菌生理鹽水一滴于殼膜上；用橡皮乳頭從氣室端小孔處緩緩將氣室內空氣吸去，造成氣室負壓，此時可見生理鹽水下沉，絨毛尿囊膜下陷，殼膜與尿囊膜之間形成人工假氣室。② 用無菌透明膠帶將假氣室封好，繼續孵化3 d后將高溫消毒后的混合纖維素酯微孔濾膜（孔徑 0.22 μm、直徑 6 mm）為載體，小心放置于矩形窗口的邊緣1／3處，遠離已形成的致密血管網。

2.2 分組給藥 混合纖維素酯微孔濾膜植入后，將種蛋隨機分為空白對照組、陽性對照組（PBS組）及實驗組（鉤吻總堿高、中、低劑量組）5組，每組10個雞胚。用微量加樣器加樣，空白對照組不加任何藥品，陽性對照組滴加0.5 mg·mL-1PBS，實驗組分別滴加含鉤吻總堿 50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1藥液，各組劑量均為 10 μL。加樣后用無菌透明膠帶封閉窗口，繼續孵化3 d。每12 h觀察1次。

2.3 標本采集 加入藥物繼續孵化3 d后，揭去雞胚表面無菌透明膠帶，以甲醇和丙酮混合液（1∶1）室溫固定15 min，以載體為中心剪下CAM約3 cm×3 cm，展鋪于濾紙上，晾干。以濾紙為背景，由專人觀察裸眼可及的載體周圍的血管數并進行比較。在自然光線下，將尼康D90／18-200數碼相機固定在三角架上，禁用閃光燈，采用近距離模式拍照，放大2倍，觀察載體周圍新生血管生成情況。

2.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析。計量資料屬正態分布用（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 雞胚存活情況 加藥后48 h，鉤吻總堿高劑量組死亡2個，陽性對照組、鉤吻總堿中劑量、低劑量組各死亡1個。死亡雞胚顏色變淺，胚內呈水樣，血管影不清晰，無胚胎活動。存活雞胚血管呈鮮紅色，胚胎活動正常。

3.2 CAM血管形態學比較 空白對照組血管呈分級生長，走形清晰，主血管管徑明顯較粗；陽性對照組和鉤吻總堿高、中劑量組血管數量少，顏色偏淺；鉤吻總堿低劑量組血管亦呈分級生長，走形清晰。見圖 1。

圖1 各組CAM血管形態比較圖（×3）

3.3 各組CAM大、中血管生成數比較 見表1。

表1 各組CAM血管生成數比較（x±s） 支

4 討 論

鉤吻生物堿毒性太大［9］，治療量和中毒量非常接近，安全指數較小。1945 年，Algire［10］提出了“腫瘤血管生成的概念”，即腫瘤的生長具有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉變為有血管的快速增殖階段。研究［11］表明：當惡性腫瘤體積大于1 mm3時，主要靠生成腫瘤血管獲取養分，故腫瘤生長和轉移依賴腫瘤新生血管的形成。因此，抑制新生血管生成，已成為抑瘤抗癌、防止惡性腫瘤復發及轉移的可行方法。本實驗應用鉤吻總堿作用于CAM，實驗過程中發現加藥后有雞胚死亡現象，可能跟雞胚開窗后失去蛋殼和蛋膜保護致胚胎脫水過多有關［12］，亦不能排除鉤吻生物堿的毒副作用。在抑制CAM血管生成方面，鉤吻總堿低、中、高劑量組給藥后血管生成呈遞減趨勢，說明CAM血管的抑制與鉤吻總堿具有量效關系。本實驗驗證鉤吻總堿對CAM具有抑制血管生成作用，由于CAM血管新生為正常生成而腫瘤血管新生為異常生成，鉤吻生物堿抗腫瘤作用與腫瘤血管新生是否相關，還有待進一步研究。同時由于體內實驗與體外實驗的劑量難以直接換算，且體內外藥物代謝存在差別，鉤吻總堿對于抑制荷瘤動物模型腫瘤血管新生的有效劑量也有待進一步探索。

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［3］ 王英豪.毒性中藥鉤吻配伍玉葉金花減毒機制研究［D］.福州：福建中醫藥大學，2016.

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［6］ RIBATTID，VACCA A，RONCALI L，et al.The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis［J］.International Journal of Developmental Biology，1996，40（6）：1189-1197.

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［8］ 張樹成，吳志奎，王蕾，等.研究中藥血管生成活性和作用的雞胚絨毛尿囊膜實驗模型的應用［J］.中國中醫基礎醫學雜志，1999，5（5）：16-19.

［9］ 易金娥，袁慧.鉤吻毒素的研究進展［J］.湖南環境生物職業技術學院學報，2003，9（1）：26-30.

［10］ 郭青龍.腫瘤藥理學［M］.北京：化學工業出版社，2008：99-100.

［11］張春麗.中藥對腫瘤血管生成抑制作用的研究［J］.北京中醫藥，2011，30（2）：156-160.

［12］鐘曉浩，李延龍，周迅.雞胚死亡的原因研究進展［J］.家禽科學，2009（7）：46-48.

R285.5

A

1000-338X（2017）06-0030-02

2017-09-20

福州市科技計劃項目（2014-S-140-1）

李德森（1982—），男，講師，醫學碩士，主要從事中藥學藥性理論研究。

吳水生（1965—），男，教授，博士生導師，醫學博士。E-mail：498366498@qq.com