蒙藥那如三味丸入血成分初步研究

1.廣東藥科大學藥科學院，廣東 廣州 510006；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)骨科，廣東 廣州 511447；3.廣東省人民醫(yī)院，廣東 廣州 510080

蒙藥那如三味丸入血成分初步研究

胡弟1布林白乙拉2何桂松2高秋紅1王經(jīng)韻3何冰*

1.廣東藥科大學藥科學院，廣東 廣州 510006；2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院番禺院區(qū)骨科，廣東 廣州 511447；3.廣東省人民醫(yī)院，廣東 廣州 510080

目的通過研究蒙藥那如三味丸的入血成分，進一步了解其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法采用高效液相色譜法(HPLC)，建立蒙藥那如三味丸大鼠灌胃后血清指紋圖譜，分析其入血成分。結(jié)果在蒙藥那如三味丸的含藥血清中發(fā)現(xiàn)3種入血成分：烏頭堿、胡椒堿和沒食子酸。結(jié)論烏頭堿、胡椒堿和沒食子酸為蒙藥那如三味丸的主要入血成分，是蒙藥那如三味丸的有效成分。

蒙藥那如三味丸；高效液相色譜；血清指紋圖譜

蒙藥那如三味丸由制草烏、蓽茇、訶子配伍組成，出自蒙醫(yī)經(jīng)典著作《至高要方》。具有祛黃水、殺“粘”、消腫、止痛功效，主治風濕病，是蒙藥制劑中治療風濕的常用制劑之一[1]。近年來也應(yīng)用于頸椎病、三叉神經(jīng)痛、腰椎間盤突出癥等疾病的治療。前期的研究[2-4]發(fā)現(xiàn)蒙藥那如三味丸所為天然藥物對脊髓損傷(SCI)具有抗炎及保護神經(jīng)細胞功能的作用。筆者擬采用高效液相色譜法，分析大鼠口服蒙藥那如三味丸后血清中的移行成分，建立其體內(nèi)分析方法，分離并鑒定其入血成分，為進一步研究蒙藥那如三味丸藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 那如三味丸(批號：1701050，內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司)，對照品(烏頭堿，批號0161107991，純度98.914%；胡椒堿，批號0166150309，純度99.783%；沒食子酸，批號0168141223，純度98.837%)購予華夏標準物質(zhì)中心，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 Aglient-1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)、冷凍微型離心機(貝克曼庫爾特有限公司)、飛鴿牌TDL離心機(上海右一儀器有限公司)。

1.3 動物 SPF級SD大鼠(南方醫(yī)科大學實驗動物中心)，(250±25)g，雌雄各半。許可證號:SCXK(粵)2016-0041。

2 方法

2.1 色譜條件 Dikma C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；A(甲醇)B(1%磷酸)，梯度洗脫(0～20 min，15% A: 85% B→80% A ：20% B；20～30 min，80% A:20%B→15%A:85%B)；檢測波長 285 nm；流速 1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積：20 μL。

2.2 對照品溶液配制 精密稱取烏頭堿、胡椒堿、沒食子酸標準品適量，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分別制成每1 mL含0.1 mg烏頭堿、0.106 mg胡椒堿及0.970 mg沒食子酸的溶液。保存在4℃的避光冰箱中備用。

2.3 含藥血清及空白血清的制備 取SD大鼠10只隨機分為給藥組和空白組。給藥組每日1.0 mL/100 g 灌胃那如三味丸-0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液(濃度C=0.3 g/mL)，連續(xù)給藥7 d，采血前24 h禁食，采血前2 h再灌胃1次，末次給藥1 h后，3%戊巴比妥鈉0.15 mL/100g腹腔注射麻醉，頸動脈采血5 mL。4 ℃，于無菌離心管中靜置30 min，離心5 min(4 000 r/imn)，取上層血清于5 mL具塞離心管中，置于-20 ℃下冷凍保存。空白組每日0.5%羧甲基纖維素鈉1.0 mL/100 g灌胃，連續(xù)給藥7 d，同法制備空白血清。

2.4 血漿樣品前處理方法 在血漿樣本1.0 mL中加入兩倍量乙酸乙酯，渦旋混合1 min，離心10 min(10000 r/min)，取上清，氮氣常溫吹干，殘渣加入200 μL的甲醇溶液渦旋混合溶解，低溫離心15 min(10000 r/min，4 ℃)，取上清，置于-20 ℃下冷凍保存，待測。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)專屬性實驗 將供試動物的空白血清色譜圖與空白血清中分別各加入對照品沒食子酸、烏頭堿和胡椒堿后得到的色譜圖及給藥后大鼠血漿處理后的含藥血清色譜圖進行比較，結(jié)果表明血清中無內(nèi)源性物質(zhì)干擾測定,且兩者峰形良好。如圖1～圖5所示。

3.2 標準曲線繪制 取空白全血1.00 mL，分別加入內(nèi)標溶液和一系列濃度的烏頭堿、胡椒堿和沒食子酸標準液。濃度為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/mL，按照“2.4血漿樣品前處理方法”項下方法操作，按照“2.1儀器條件”測定，峰面積為縱坐標y，濃度為橫坐標x，求得直線回歸方程為：測得烏頭堿、胡椒堿和沒食子酸在0.5～100 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。烏頭堿標準曲線：y=102.83x+12.59，r=0.99921;胡椒堿標準曲線：y=72.94x+8.363，r=0.99981，沒食子酸標準曲線：y=36.33x+108.36，r=0.99956。

3.3 精密度與準確度實驗 取空白全血1.00 mL，配置成血藥濃度分別為0.5、5.0、50.0 μg/mL的樣品，加入按照“2.4血漿樣品前處理方法”項下方法操作，每一方法進行3次樣本分析，并與標準工作曲線同時進行,以當日的標準工作曲線計算質(zhì)量控制樣品濃度，考察方法的精密度和準確度。結(jié)果表明，共有的相對峰面積RSD為1.65%～9.07%，精密度與準確度良好。

3.4 穩(wěn)定性實驗 取空白全血1.00 mL，配置成血藥濃度分別為1.5、15.0、90.0 ug/mL的樣品，加入按照“2.4血漿樣品前處理方法”項下方法操作，常溫放置24 h進樣分析，以當日的標準工作曲線計算質(zhì)量控制樣品濃度,考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，共有的相對峰濃度RSD為0.6%～1.41%，穩(wěn)定性良好。

3.5 血清指紋圖譜分析 圖1為空白血清HPLC圖譜，在圖2、圖3、圖4中均可見與圖1相對應(yīng)的血清內(nèi)源性干擾色譜峰1、2號峰，圖2中a峰為沒食子酸對照品的血清HPLC色譜峰，圖3中b峰為烏頭堿對照品的血清HPLC色譜峰，圖4中c峰為胡椒堿對照品的血清HPLC色譜峰。圖5含藥血清色譜圖中均可見a、b、c色譜峰與圖2、圖3、圖4中a、b、c色譜峰相對應(yīng)的共有峰，出峰時間分別為分別均為5.061、16.664和22.867 min，以上結(jié)果提示大鼠口服蒙藥那如三味丸后的入血成分含有沒食子酸、烏頭堿和胡椒堿。

4 討論

研究在分析對照品和血清樣品時，均采用了完全相同的色譜條件，因此，建立的沒食子酸、烏頭堿和胡椒堿對照品血清HPLC圖譜與含藥血清的HPLC圖譜中的色譜峰能夠滿足一一對應(yīng)的關(guān)系，同時進行了方法學考察，均滿足分析檢測的要求。在處理血清樣品時，考察了有機試劑沉淀法、熱水浴法，考慮處理方法對色譜峰的干擾影響，最終確定采用乙酸乙酯沉淀法處理血清樣本，采用氮氣低溫濃縮法富集血中的成分，以獲取更多的信息。

研究通過血清指紋圖譜研究方法初步研究蒙藥那如三味丸入血成分，蒙藥那如三味丸血清HPLC指紋圖中可檢出多個色譜峰，其中血清本身的成分2個色譜峰1、2號，見圖1和圖5，蒙藥那如三味丸中已知的主要成分有沒食子酸，烏頭堿和胡椒堿[1，5-6]，這3種主要成分均可從含藥血清中檢出，見圖2中的a峰、圖3中的b峰及圖4中的c峰。這3個入血成分可能為蒙藥那如三味丸的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，對其進行深入的研究，將有助于闡明蒙藥那如三味丸藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效機制，而蒙藥那如三味丸含藥血清中的其他移行成分還需進一步研究。

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[2]布林白乙拉，袁華兵，屠原原. 蒙藥那如三味丸方對脊髓髓損傷后神經(jīng)細胞FOS表達的影響[J]．中國中醫(yī)藥資訊，2009，12，1(6)：30-31.

[3]布林白乙拉，羅利民，陳繼銘，等.交通性脊髓損傷致截癱病人用蒙藥那如三味丸治療66例觀察[J].中國醫(yī)藥導報雜志，2009，1(3)：45-46.

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[5]陶淑娟，王桂艷，畢開順．HPLC法測定蒙藥那如三味丸丸中胡椒堿的含量[J]．沈陽藥科大學學報，2004，21(1)：35- 37.

[6]陶淑娟，邵太麗，畢開順．高效液相色譜法測定蒙藥那如三味丸丸中沒食子酸的含量[J]．時珍國醫(yī)國藥，2005，16 (1)：2-3.

[7]徐維明，楊松.藥用植物草烏的化學成分研究進展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2012,40(3):54-58.

TheStudyonComponentsAbsorbedintoBloodofTraditionalMongolianMedicineNaruSanweiPill

HU Di1Bulinbaiyila2HE Guisong2GAO Qiuhong1WANG Jingyun3HE Bing1*

1. College of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China；2.Panyu Hospltal District Department of orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 511447, China；3. Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,China

ObjectiveThrough the study of the blood components of the Mongolian medicine-Naru-3,to further understand the basis of the drug effect.MethodsHPLC was used to establish the serum fingerprint of the Mongolian medicine-Naru-3, and the blood components were analyzed.Results3 kinds of blood components were found in the serum containing three flavored pills of Mongolian medicine-Naru-3: aconitine, piperine and gallic acid.ConclusionAconitine, piperine and gallic acid are the main components of the Mongolian medicine, such as the three flavored pills, which are the effective components of the Mongolian medicine-Naru-3.

Mongolian Medicine Naru Sanwei Pill; HPLC; Serum Fingerprint

廣東省科學技術(shù)廳省中醫(yī)藥科學院聯(lián)合科研專項項目(粵科社字[2013]102號) 2016 年廣東省大學生創(chuàng)新訓練項目(201610573039)。

胡弟(1995-),男，漢族，本科，研究方向為藥物分析。E-mail: 845940943@qq.com

何冰(1959-),女，漢族，本科，教授，研究方向為心血管藥理、藥物篩選及新藥研究。E-mail:wahah5566@163.com

R284.1

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1007-8517(2017)23-0026-03

2017-10-27 編輯：鄧佳麗)