電針預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

國翔

1.中國人民解放軍第九五醫院，福建 莆田 351100；2.福建中醫藥大學附屬福州市中醫院，福建 福州 350001；3.福建中醫藥大學，福建 福州 350102

電針預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響

陳順1聶焱2陳國翔3李寧3鄭雪峰3

1.中國人民解放軍第九五醫院，福建 莆田 351100；2.福建中醫藥大學附屬福州市中醫院，福建 福州 350001；3.福建中醫藥大學，福建 福州 350102

目的研究電針對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響。方法將SD雄性大鼠40只，SPF級，隨機分為兩組：造模組(30只)以及假手術組(10只)。采用線栓阻塞腦中動脈法建立腦缺血再灌注損傷模型，腦缺血再灌注損傷后，造模組大鼠隨機分為模型組、電針組，每組15只。實驗采用改良神經評分法(mNSS)來評價大鼠的神經功能，使用電針干預七天后，分別采用Western Blot和Real-time PCR法檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表達的相對含量。結果電針干預7 d后，與模型組相比，在第5、7天電針組可顯著提高大鼠神經行為功能(P<0.05，P<0.01)。電針干預7 d后，與模型組相比，電針組Bcl-2表達上調，Caspase-3、Bax表達下調。結論電針可提高Bcl-2的表達、降低Caspase-3、Bax的表達，從而抑制腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織細胞的凋亡。

腦卒中；腦缺血再灌注；電針；細胞凋亡

社會和生活方式的變化以及人口老齡化，中風的發病率不繼升高，成為人類死亡的第二大病因，也是導致嚴重殘疾的主要原因[1]。中華醫學會神經病學分會腦血管病學組調查資料表明，我國每年增加150萬至200萬的腦卒中患者，發病率約為1.5%，在我國目前有700余萬的腦卒中患者存活下來，但有450萬的腦卒中患者不同程度地喪失其勞動能力和生活自理能力，致殘率可高達75%[2]。中醫藥治療腦卒療效肯定，而且有相關研究分析了針灸治療腦卒中的機制[3-5]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，取“百會”穴，觀察電針對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血區腦組織中細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器材料 G6805-1A型電針儀(上海華誼醫用儀器廠)； SPF級SD大鼠40只(福建中醫藥大學)；水合氯醛(國藥集團)；毫針(貴州安迪醫療器械有限公司)；線栓(廣州佳靈生物技術有限公司)；Bax抗體和Bcl-2抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；β-actin抗體(Cell Signalling公司)；Casepase 3抗體(生工生物工程(上海)公司)；RevertAid TM First strand cDNA Synthsis Kit(Fermenta公司)；Power SYBR? Green PCR Master Mix(life sciences公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注損傷大鼠模型的構建 SD雄性大鼠經適應性飼養1周后，開始造模，實驗前禁食12 h，自由飲水。根據參考文獻及前期經驗[6-8]實行左側MCAO手術。即將線栓插入勁內動脈直至顱內大腦前動脈的近端，有阻力出現時即停止插線(深度約18～20 mm)，結扎ICA的插線處以阻斷血流，造成腦缺血。2 h后將線栓稍稍向外拔出，實現再灌注。假手術組除不插入線栓外其余操作同模型組，自由攝食飲水。

1.2.2 動物分組及干預

1.2.2.1 動物的分組 把造模之后神經行為學評分在1～3分范圍內的大鼠作為實驗研究對象，并將其隨機分成兩組：模型組(15只)、電針組(15只)。

1.2.2.2 動物干預 電針組大鼠給予電針治療，具體治療方法如下：依據《實驗動物圖譜》，選擇大鼠的百會穴(即雙耳前緣連線的中點)，采用直徑為0.25 mm，長為25 mm 的毫針，進針角度為45°，進針長度為2 mm。之后連接電針儀，另一極連接大鼠耳尖，使用疏密波，其頻率為2/15 Hz， 強度為1 mA，每天1次，每次干預30 min，共7 d。假手術組、模型組不給予任何治療措施。

1.2.3 大鼠神經行為學的評分方法 實驗使用改良的神經功能缺損評分法(mNSS)對大鼠進行神經行為學的評價[9]，評分內容包括平衡木實驗、行走測試、反常運動、感覺測試、反射缺失和提尾反射等。具體評分細則見表1。

表1 mNSS神經行為評分法

1.2.4 動物取材 電針干預結束后，按照300 mg/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后，迅速取出腦組織，于冰上迅速分離出缺血側皮層腦組織，分別裝入凍存管中，放入液氮中速凍2 h后，保存于-80℃。

1.2.5 Real-time PCR法檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 取大鼠腦組織100 mg，加入Trizol試劑1 mL 后勻漿，提取總 RNA。取1 μg的總RNA，然后采用反轉錄體系把mRNA逆轉錄合成cDNA。之后把各個樣品的cDNA作為模板，使用SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN)對目標基因(Caspase-3、Bcl-2、Bax，目的基因引物序列見表2)進行Real-time PCR擴增檢測分析。實驗以β-actin為內參基因，計算模型組和電針組相對于假手術組的目的基因的表達量，最終結果用相對表達量倍數表示。

表2 引物序列

1.2.6 Western blot檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達 取大鼠腦組織100 mg，加入RIRP裂解液勻漿，提取其總蛋白。使用SDS-PAGE垂直板全濕法進行電泳，蛋白經SDS-PAGE膠分離之后，將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜上，用封閉液封閉兩個小時后，分別加入Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(稀釋比例均為1∶1000)，4℃條件下孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次10 min，然后加入1∶5000稀釋HRP標記的第二抗體，在室溫下孵育2h，再用TBST洗3遍。加入ECL顯色劑，使用凝膠成像分析系統進行檢測，然后分析目標條帶出現的灰度值，把目標蛋白和β-actin的灰度值的比值作為目標蛋白的相對量，比較每組之間存在的差異。

2 實驗結果

2.1 電針對大鼠神經行為學的影響 采用mNSS神經功能缺損評分法對大鼠展開神經行為學的評價。實驗結果顯示模型組動物在造模之后，其神經行為學的評分顯著高于假手術組(P<0.05)，表明腦缺血再灌注造成神經功能障礙的作用明顯；電針干預后，第1、3天電針組和模型組無統計學差異，但第5、7天電針組神經評分顯著低于模型組(P<0.05)，提示電針可提高腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能。見表3。

表3 電針對大鼠神經行為學的影響 (分，

注：與假手術組相比，**P<0.01；與MCAO組相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 電針對大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的影響 與假手術組相比，模型組Bcl-2 mRNA表達水平降低，Caspase-3、Bax mRNA表達水平增強，且具有明顯的統計學差異(P<0.01)。而電針干預后，Bcl-2 mRNA表達顯著增加(P<0.01)，Caspase-3、Bax mRNA表達顯著減少(P<0.05，P<0.01)。如圖1所示。

2.3 電針對大鼠腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)，Caspase-3、Bax蛋白表達顯著增加(P<0.01)。而電針干預后，Bcl-2蛋白表達增加(P<0.01)，Caspase-3、Bax 蛋白表達減少(P<0.05，P<0.01)。如圖2所示。

3 討論

在中醫學腦卒中屬于“中風”、“類中”的范圍，是由于竅閉神匿，神不導氣所導致，在治療時應該遵從“病變在腦，首取督脈”的治病理論。百會屬于督脈，它具有醒腦開竅、升陽舉陷、益氣補虛、平肝息風的作用。用電針刺激百會穴能夠減緩腦缺血損傷，縮小腦梗死體積，控制細胞的凋亡，從而增進神經功能的恢復[9-11]。

腦卒中的發病機制是一個較為復雜的多環節、多因素、多途徑損傷的級聯反應，細胞壞死和細胞凋亡是細胞的最終結局。細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡，受到多個基因的調控，與多種退行性疾病有關。當細胞過度凋亡時，神經元缺失，導致神經變性和神經肌肉疾病。腦缺血早期，缺血嚴重的梗塞中心區以壞死為主要特征，而神經細胞的凋亡主要位于缺血半暗帶。缺血半暗帶位于缺血區的周圍及某些易缺血的部位。當神經細胞能量供應不足，興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應等都可能參與神經細胞的凋亡。研究結果發現，大鼠腦缺血再灌注后，皮質區Bax、Caspase-3表達明顯上調，而Bcl-2的表達則降低[12]。壞死的神經細胞很難恢復，但可以通過干預調節上游信號，減輕細胞凋亡，這是目前腦缺血治療的策略所在，也是臨床常用藥物作用的靶點。Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，缺血半暗帶區域主要是其介導的神經凋亡。臨床上，可以觀察到腦卒中患者治療后腦內的Caspase-3活性顯著降低[13]。

電針療法是指在刺入人體穴位的毫針上，用電針機通以微量低頻脈沖電流的一種治療方法。研究表明電針刺激相應穴位可有效降低各種外傷、缺血缺氧等損傷導致的細胞凋亡。Liu Z等[14]采用雙側頸總動脈閉塞誘發全腦缺血20 min，再灌注后檢測海馬谷氨酸受體亞基2(GluR2)的表達，發現電針預處理可改善神經功能恢復，促進細胞存活，抑制神經細胞凋亡，降低再灌注后Bax / Bcl-2比值，實現神經保護作用的效果。實驗通過Real-time PCR法檢測了缺血腦組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA的表達，發現電針療法可上調Bcl-2的表達，下調Caspase-3、Bax的表達，提高Bcl-2/Bax的比值，表明電針可以起到抗凋亡的作用。同時，Western Blot 法檢測蛋白的結果進一步驗證了其抗凋亡的作用。

[1]Robinson R.G, E. Spalletta. Stroke[J]. Handb Clin Neurol,2012, 106: 491-506.

[2]中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組.中國急性缺血性腦卒中診治指南[J].中國全科醫學，2010:4013-4017.

[3]Wang MS, Zhou HP, Shi F. Acupuncture preconditioning protects hippocampal neurons from transient ischemia/reperfusion injury [J]. Neural Regen Res, 2011, 6(15): 1175-1179.

[4]劉建勛,林咸明. 不同時程電針預處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護效應[J]. 上海針灸雜志, 2014, 33(12):1169-1172.

[5]葉濤,朱路文,唐強. 電針預處理誘導腦缺血耐受的研究進展[J]. 針灸臨床雜志, 2015, 31(2): 87-90.

[6]Longa E.Z., Weinstein P.R., Carlson S., et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989(20): 84-91.

[7]X.Chen, H. Li, M. Huang, et al. Effect of Gua Lou Gui Zhi decoction on focal cerebral ischemia-reperfusion injury through regulating the expression of excitatory amino acids and their receptors[J]. Mol Med Rep,2014, 10(1): 248-254.

[8]Yuqin Zhang, Huang Li, Mei Huang, et al. Neuroprotective effects of Gualou Guizhi Decoction in vivo and in vitro[J]. Journal of Ethnopharmacology,2014, 158: 76-84.

[9]Xiong L, Lu Z, Hou L, et al. Pretreatment with repeated electroacupuncture attenuates transient focal cerebral ischemic injury in rats [J]. Chin Med J (Engl), 2003, 116(1): 108-111.

[10]徐浩,沈劍,趙昱,等. 電針預處理大鼠百會穴對腦缺血保護作用及HIF-1α 相關機制的研究[J]. 神經解剖學雜志, 2015, 31(5): 617-622.

[11]孫思斯,高楊,劉瞾宇,等. 電針預處理對腦缺血再灌注后SOD的表達影響[J]. 中華神經外科疾病研究雜志, 2014, 13(3): 236-240.

[12]馮建玉.大鼠局灶性腦缺血再灌注后Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達與神經元凋亡的實驗研究[D].鄭州：鄭州大學,2005.

[13]鄭婉群,曹奕,王玉影,等.針灸通督法對缺血性腦卒中患者Caspase-3、Caspase-9水平影響的臨床研究[J].浙江中醫藥大學學報,2014,38(9):1106-1110.

[14]Liu Z, Chen X, Gao Y, et al. Involvement of GluR2 up-regulation in neuroprotection by electroacupuncture pretreatment via cannabinoid CB1 receptor in mice[J]. Scientific Reports, 2015(5):9490.

實驗研究

陳順(1985-)，男，漢族，住院醫師，研究方向為腦卒中的中西醫康復研究。E-mail:qlffjtcm@sina.com

R-332

A

1007-8517(2017)23-0050-04

2017-11-14 編輯：程鵬飛)