miR- 202通過抑制PGC1β表達促進3T3-L1前脂肪細胞分化

伍 迪，凌宏艷，曹 參，何劍琴，楊絲絲，張愷芳，奉水東

(南華大學 1.生理學教研室；2. 附屬第二醫院 內分泌科；3.社會醫學與衛生事業管理學教研室, 湖南 衡陽 421001)

研究論文

miR- 202通過抑制PGC1β表達促進3T3-L1前脂肪細胞分化

伍 迪1#，凌宏艷1#，曹 參2，何劍琴1，楊絲絲1，張愷芳1，奉水東3*

(南華大學 1.生理學教研室；2. 附屬第二醫院 內分泌科；3.社會醫學與衛生事業管理學教研室, 湖南 衡陽 421001)

目的觀察miR- 202對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響及可能的機制。方法通過慢病毒感染構建穩定表達AMO-miR- 202和亂序對照miRNA細胞系，隨后誘導分化。至分化的第9天，油紅O染色觀察細胞內脂滴的情況；RT-PCR檢測過氧化物酶體激活增殖受體γ2(PPARγ2)和aP2的基因表達；Western blot檢測PPARγ2、aP2和miR- 202靶基因PPARγ輔助活化因子1β(PGC1β)蛋白表達。結果經293T細胞慢病毒包裝AMO-miR- 202、亂序對照miRNA，熒光顯微鏡下可見約80%～90%熒光細胞；將上述2組病毒液分別感染3T3-L1前脂肪細胞后，可見約70%～80%熒光細胞。AMO-miR- 202組細胞內脂滴及PPARγ2和aP2的mRNA表達顯著低于亂序對照組和對照組(P<0.05)。與亂序對照組和對照組相比，AMO-miR- 202組PGC1β蛋白表達顯著增加(P<0.05)，PPARγ2和aP2蛋白表達顯著降低(P<0.01)，而亂序對照組和脂肪細胞組上述指標無明顯差異。結論miR- 202可能通過抑制PGC1β、提高PPARγ2和aP2的表達促進3T3-L1前脂肪細胞分化。

miR- 202；3T3-L1前脂肪細胞；脂肪細胞分化；PGC1β

肥胖發病率不斷增加且呈年輕化趨勢，并導致2型糖尿病、高血壓和動脈粥樣硬化等疾病，嚴重危害人類健康[1]。在整體水平，能量攝入大于消耗會導致肥胖；在細胞水平，肥胖是因脂肪細胞的數目增多及體積增大所致；深入研究脂肪細胞分化的調控機制有助于預防肥胖的發生。

微小RNA分子(miRNA)是一種內源性的非編碼單鏈小分子RNA，能在轉錄后水平負性調節基因的表達[2- 3]。研究表明，某些miRNAs參與細胞增殖、分化和凋亡等生理和病理過程[4]，且被證實參與脂肪細胞分化的調節，如，miR- 143通過多效生長因子促進3T3-L1脂肪細胞分化[5]；miR- 17- 92簇通過負性調節腫瘤抑制蛋白Rb2/p130促進3T3-L1細胞分化[6]；miR- 375通過抑制ERK1/2的磷酸化水平來促進3T3-L1脂肪細胞分化[7]；miR- 27a和miR- 27b抑制3T3-L1脂肪細胞分化，但miR- 202是否影響脂肪細胞分化，尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1前脂肪細胞系和293T細胞系(上海中科院細胞庫)；大腸桿菌菌株(TaKaRa公司)；DMEM培養基、胰蛋白酶和胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，分化誘導劑1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobuthylxanthine，IBMX)、油紅O染色試劑(Sigma公司)。反義miRNA寡核苷酸-miR- 202(AMO-miR- 202,anti-miRNA oligonucleotide-miR- 202)及亂序對照物、慢病毒包裝質粒(Gene copoeia公司)；PCR擴增試劑盒(北京天為時代公司)；羊抗小鼠aP2(apetala2)多克隆抗體、羊抗小鼠氧化物酶體激活增殖受體γ2(peroxisome proliferator-activeted receptor γ2,PPARγ2)多克隆抗體和兔抗小鼠PPARγ輔助活化因子1β(peroxisome proliferator-activeted receptor γ coactivator 1β,PGC1β)多克隆抗體(Santa Cruze公司)；PPARγ2和aP2引物由在線軟件primer5設計，上海生工生物工程公司合成，Pubmed驗證。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：將3T3-L1和293T細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃和5% CO2培養箱靜置培養。當細胞匯合度達80%以上時，可進行1∶2傳代或凍存細胞。

1.2.2 慢病毒包裝：將293T細胞接種于細胞培養皿，37 ℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞匯合達 70%～80%時用于轉染。在2個新EP管里加入50 μL基礎DMEM培養基(無FBS和P/S),加入10.5 μg DNA，在其中一個EP管里加入50 μL基礎DMEM培養基及21 μL脂質體，混勻，室溫下孵育5 min。將兩個EP管溶液混勻，室溫下孵育15 min。在混合液中加入1 mL新鮮DMEM培養基(含FBS和P/S)，混勻，加入293T細胞和3 mL新鮮DMEM培養基，混勻。孵育2 h，加入4 mL新鮮DMEM。孵育10 h棄去培養基，向培養皿里加入10～14 mL新鮮DMEM。孵育48～72 h后，收集培養液于離心管中，1 500 r/min離心20 min。將含AMO-miR- 202和亂序對照質粒的病毒分裝500～1 000 μL EP管，保存在-80 ℃。

1.2.3 慢病毒液感染3T3-L1前脂肪細胞：將3T3-L1前脂肪細胞于6孔板中培養至20%～30%匯合度時，在EP管里分別加入含AMO-miR- 202、亂序對照miRNA的病毒液、新鮮DMEM(含FBS、P/S)和Polybrene(病毒液：DMEM=1∶1～4∶1，Polybrene為總體積的1∶2 000)，混勻。移去6孔板中原有DMEM，并加入EP管中混合物，混勻。孵育12 h后，加入1 mL新鮮DMEM。在第24 h，加入1～1.5 mL新鮮DMEM。在36～48 h，將6孔板中原有培養液棄去，換成新鮮DMEM。孵育至72 h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的強度進行轉染效率的判斷。

1.2.4 油紅O染色:分別將上述3組誘導分化至第9天的細胞，PBS洗滌3次(每次5 min)，加入60%異丙醇室溫下固定15 min，隨后加入油紅O染色液，染色10 min后蒸餾水沖洗3次，每次1 min。染色后顯微鏡下觀察拍照，分析3T3-L1前脂肪細胞分化率。

1.2.5 RT-PCR檢測PPARγ2和aP2的mRNA表達:實驗結束時，用Trizol處理細胞，按照說明書提取RNA、反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增。PPARγ2上游引物：5′-CCTTGCTGTGGGGATGTCTC-3′，下游引物:5′-GCCACCTCTTTGCTCTGCTC-3′(319 bp)；aP2上游引物：5′-AACACCGAGATTTCCTTCAA-3′，下游引物:5′-TCACGCCTTTCATAACACAT-3′(193 bp)；β-actin上游引物：5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTG GC-3′，下游引物:5′-CTCATAGCTCTTCTCCAGGG AGGA-3′(457 bp)。PCR反應條件為:95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s(35個循環)；72 ℃ 7 min。反應結束后，各取產物5 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳(60～80 v，60～90 min)，用全自動凝膠分析系統吸光度掃描分析，結果用3個樣本的平均相對單位表示。分析各組目的產物及β-actin吸光度值，以二者比值代表目的產物表達量。

1.2.6 miR- 202靶基因預測：通過以下3個生物學預測網站(TargetScan：http://www.TargetScan.org；miRanda：http://www. miRanda.org；miRBase：http://microna.sanger.ac.uk)尋找miR- 202靶基因。

1.2.7 Western blot檢測脂肪細胞PGC1β(peroxisome proliferaters activated receptor-γ-coactivator-1)、aP2和PPARγ2蛋白的表達：提取各組細胞蛋白進行蛋白定量后，取蛋白樣品30 μg進行電泳, 轉膜和封閉、加入抗PPARγ2、aP2和PGC1β抗體孵育，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的二抗，孵育，充分洗滌后與ECL化學發光試劑反應，曝光后掃描，用圖像分析軟件進行吸光度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 構建穩定表達AMO-miR- 202和亂序對照miRNA細胞系

2.1.1 慢病毒包裝:AMO-miR- 202組和亂序對照組6孔板中的293T細胞，經慢病毒包裝過程，在第48～72 h，80%～90%細胞可見熒光，說明慢病毒包裝效率高(圖1)。

2.1.2 慢病毒液成功感染3T3-L1前脂肪細胞:在第72 h，70%～80%細胞可見熒光，說明病毒感染細胞效率高，成功構建穩定表達AMO-miR- 202、亂序對照miRNA的3T3-L1前脂肪細胞系(圖2)。

2.2 miR- 202對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

誘導分化第9天，3組細胞均被油紅O染成亮紅色，可見較大脂滴，呈典型的脂肪細胞表型，但AMO-miR- 202組紅色細胞脂滴明顯少于其他2組。

miR- 202對PPARγ2和aP2的mRNA表達影響: 經RT-PCR實驗發現：AMO-miR- 202組PPARγ2、aP2的表達顯著低于亂序對照組和正常脂肪細胞組(圖3)。

A.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with microscope; B.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with fluorescence microscope; C.morphology of the cell from random group with microscope; D.morphology of the cell from random group with fluorescence microscope

圖1293T細胞慢病毒包裝效率分析
Fig1Analysisof293Tcellslentiviruspackageefficiency(×100)

A.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with microscope; B.morphology of the cell from AMO-miR- 202 group with fluorescence microscope; C.morphology of the cell from random group with microscope; D.morphology of the cell from random group with fluorescence microscope

圖2病毒感染3T3-L1前脂肪細胞效率分析
Fig2Analysisoflentivirusinfectedwith3T3-L1preadipocytes(×40)

圖3 油紅O觀察miRNA對脂肪細胞內脂滴的影響Fig 3 miRNA influnce droplets in adipocyte cells by Oil Red O staning(×200)

A.mRNA expression of PPARγ2;B.mRNA expression of aP2;*P<0.05 compared with adipocyte cell group圖4 miRNA- 202對3T3-L1脂肪細胞PPARγ2和aP2 mRNA表達的影響Fig 4 miRNA- 202 influence PPARγ2 and aP2 mRNA expression of 3T3-L1 preadipocyte cell(±s,n=3)

2.3 miR- 202靶基因預測

綜合多個生物信息學預測網站和軟件預測結果，尋找miRNA- 202靶基因，取至少兩個軟件預測到的基因作為靶基因，結果表明PGC1β可能是其靶基因(圖4)。

2.4 miR- 202可促進3T3-L1前脂肪細胞分化

與亂序對照組和正常脂肪細胞組相比，AMO-miR- 202組PGC1β蛋白表達顯著增加，PPARγ2和aP2蛋白表達顯著下降(圖5)。

圖5 多種靶基因預測軟件預測miR- 202潛在靶基因PGC1βFig 5 Biological prediction site to predict the target gene PGC1β of miR- 202

A.expression of PGC1β detected by Western blot; B.expression of PPARγ2 detected by Western blot; C.expression of aP2 detected by Western blot;*P<0.05,**P<0.01 compared with adipocyte cell group

3 討論

脂肪細胞分化是決定脂肪細胞體積和數目的關鍵，目前該方面的研究主要側重于某些藥物，對內源性調控基因研究較少。3T3-L1前脂肪細胞是一種具有脂肪細胞分化潛力的細胞系。本實驗選擇3T3-L1前脂肪細胞系作為脂肪細胞誘導分化模型，并觀察內源性miRNA對脂肪細胞分化調控作用。

在前期研究中，發現3T3-L1前脂肪細胞分化過程中miR- 202表達上調，故本實驗設計miR- 202的反義核苷酸抑制其表達，觀察miR- 202對脂肪細胞分化的影響。將已轉染AMO-miRNA- 202和亂序對照序列的3T3-L1前脂肪細胞誘導分化，油紅O染色發現細胞被染成亮紅色，呈典型脂肪細胞表型，且AMO-miRNA- 202組經油紅O染成亮紅色脂滴細胞明顯少于其他2組；通過RT-PCR檢測PPARγ2和aP2的mRNA表達，發現AMO-miR- 202能顯著抑制PPARγ2和aP2的mRNA表達水平，提示miR- 202促進3T3-L1前脂肪細胞分化。

為進一步探討miR- 202促進3T3-L1前脂肪細胞分化的機制，通過軟件預測PGC1β可能是miR- 202的靶基因。PGC1β是新發現的與能量代謝關系最密切的一個轉錄輔助活化因子，主要表達于棕色脂肪組織、骨骼肌和肝臟，參與脂肪細胞分化、糖脂代謝和能量平衡[8]，研究表明PGC1β參與了3T3-L1細胞系分化過程[9]。AMO-miR- 202可顯著增加PGC1β蛋白表達，降低PPARγ2和aP2蛋白表達，提示 miR- 202可能是通過抑制PGC1β表達，提高aP2和PPARγ2蛋白表達來促進3T3-L1脂肪細胞分化。

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miR- 202 promotes the differentiation of 3T3-L1 preadipocyteviainhibiting PGC1β expression

WU Di1#, LING Hong-yan1#, CAO Cen2, HE Jian-qin1, YANG Si-si1, ZHANG Kai-fang1, FENG Shui-dong3*

(1. Dept. of Physiology; 2.Dept. of Endocrinology,the Second Hospital of University of South China;3.Dept. of Social Medicine and Health Service Management,University of South China,Hengyang 421001,China)

ObjectiveTo explore the effect and molecular mechanism of miR- 202 on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte.MethodsThrough lentivirus infected with 3T3-L1 preadipocytes, we set up the AMO-miR- 202 group and the random control group, then, these cells were induced to differentiate, nine days later, differentiation was assessed by Oil Red O staining and we examined the mRNA expression of PPARγ2 and aP2 by RT-PCR method.We examined the mRNA expression of PPARγ2,aP2 and PGC1β by Western blot method.ResultsAfter packaging lentivirus with AMO-miR- 202 and random sequence control miRNA through cell line 293T, 80%-90% cells with fluorescence were found under fluorescence microscope; After these two lentivirus respectively infected with 3T3-L1 preadipocytes, About 70%-80% cells with fluorescence were found under fluorescence microscope.Oil Red O staining test showed that these cells with Oil Red O stained bright red fat droplets of AMO-miR- 202 group and PPARγ2 and aP2 mRNA expression in the AMO-miR- 202 group significantly lower than control groups (P<0.05).Western blot assay showed that the protein expression of PGC1β in the AMO-miRNA- 202 group was significantly increased(P<0.05), but the expression of aP2 and PPARγ2 was significantly decreased (P<0.01). However, the random control group and the adipocyte group had no significant effect on the above indexes.ConclusionsmiR- 202 can promote the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte by inhibiting the protein expression of PGC1β and improving the protein expression of PPARγ2 and aP2.

miR- 202；3T3-L1 preadipocyte；adipocyte differentiation；PGC1β

2016- 12- 05

2017- 05- 05

教育部留學歸國基金[教外司留(2014)1685];湖南教育廳基金(16C1411)；衡陽市科技局基金(2016KJ64)

*通信作者(correspondingauthor)：shuidong_f@hotmail.com

#對本文有相同貢獻

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