RNA干擾環指蛋白2基因抑制胰腺癌細胞系PANC- 1增殖和遷移

吳銀芳，孫曉東，鄭 宇，黃東勝

(1.浙江中醫藥大學 第二臨床醫學院, 浙江 杭州 310053；2.杭州醫學院附屬浙江省人民醫院 肝膽胰外科, 浙江 杭州 310014)

研究論文

RNA干擾環指蛋白2基因抑制胰腺癌細胞系PANC- 1增殖和遷移

吳銀芳1,2，孫曉東2*，鄭 宇2，黃東勝2

(1.浙江中醫藥大學 第二臨床醫學院, 浙江 杭州 310053；2.杭州醫學院附屬浙江省人民醫院 肝膽胰外科, 浙江 杭州 310014)

目的研究沉默環指蛋白2(RNF2)基因對人胰腺癌細胞系PANC- 1增殖、遷移、周期和凋亡的影響及可能機制。方法用siRNA- RNF2轉染PANC- 1細胞沉默RNF2表達，同時設立轉染無義序列(siRNA- NC)的空轉染組及不進行任何處理的空白對照組(mock)。熒光定量PCR檢測RNF2 mRNA表達；Western blot檢測RNF2和p53表達；MTS實驗和劃痕實驗分別檢測細胞增殖和遷移能力；流式細胞計量術檢測細胞轉染率、凋亡率和細胞周期。結果相比正常胰腺導管上皮細胞，RNF2在胰腺癌細胞系中高表達(P<0.05)。轉染siRNA- RNF2的PANC- 1細胞與陰性對照組比較，RNF2 mRNA及蛋白表達下調；細胞增殖被抑制(P<0.05)；細胞遷移能力下降(P<0.05)；細胞凋亡率增高(P<0.05)；G0/G1期細胞比例上升，S期和G2/M期細胞比例則降低(P<0.05)。此外，轉染siRNA- RNF2顯著下調PANC- 1細胞中p53蛋白的表達。結論siRNA- RNF2特異性下調胰腺癌細胞RNF2表達,顯著抑制細胞增殖和遷移，結果提示RNF2可能成為胰腺癌基因治療的一個新靶點。

環指蛋白2；胰腺癌；生長抑制；p53

胰腺癌是一類常見且高度惡性的消化道腫瘤，病死率居癌相關死因的第4位，5年生存率<5%[1- 2]。手術切除輔以放化療目前仍為其主要治療手段，但患者整體生存情況并不令人滿意。因此，研究胰腺癌發病的分子生物學機制，可為胰腺癌的治療提供新的理論依據和分子靶標。

環指蛋白2(RING finger protein,RNF2)基因定位于人染色體1q25.3位點，編碼區由9個外顯子組成，共編碼336個氨基酸。RNF2是一種E3泛素連接酶，帶有指環結構，歸屬于多梳基因家族(polycomb group, PcG)，在干細胞自我更新、DNA損傷修復、早期胚胎發育、細胞周期調控及細胞增殖等方面發揮重要作用[3]。近年來研究發現，RNF2在許多惡性腫瘤中高表達，如乳腺癌和胰腺癌等，且其表達與腫瘤的發生、進展、預后及化療耐藥關系密切[4- 5]。因此，有理由推測RNF2在腫瘤的發生進展過程中起到了一定的生物學作用。然而是否RNF2在胰腺癌的發生進展中起到重要的作用，目前研究報道甚少。

本研究將RNF2 siRNA轉染人胰腺癌細胞系PANC- 1，研究其對PANC- 1細胞增殖、細胞遷移、細胞周期及凋亡的影響，并初步探討其作用機制，為以RNF2為靶點的胰腺癌基因治療打下一定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑： DMEM、Opti-MEM及胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；LipofectamineTM2000(Thermo公司)；PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA eraser及定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；MTS試劑盒(Promega公司)；細胞周期與凋亡檢測試劑盒(南京碧云天公司)；靶向RNF2基因的siRNA(上海吉瑪制藥生物技術有限公司)；Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；PCR引物(廣州銳博生物公司)；ECL化學發光試劑盒(Pierce公司)。

1.1.2 細胞來源：人胰腺癌細胞系SW1990、BxPC- 3、PANC- 1及正常胰腺導管上皮細胞HPDE6- C7均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉染:實驗分為3組:未有siRNA轉染的細胞為對照組(mock)，轉染非特異性的RNF2 siRNA為陰性對照組(siRNA- NC)，以轉染RNF2 siRNA為實驗組(siRNA- RNF2)。以5×104個/孔將PANC- 1細胞傳代于6孔板中，待細胞匯合度達70%左右時，按試劑盒說明進行轉染。轉染6 h后，換為有血清的DMEM培養液。分別于轉染24、48和72 h后采用流式細胞計量術和熒光顯微鏡檢測轉染效率。RNF2 siRNA序列：正義鏈5′-AUUAUUG UGCUUGUUGAUCCU-3′，反義鏈5′-GAUCAACAAGC ACAAUAAUCA-3′; siRNA- NC序列：正義鏈5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-TTAAGAG GCUUGCACAGUGCA-3′。

1.2.2 RT-qPCR檢測RNF2 mRNA： 轉染48 h后，用PBS(pH 7.4)洗滌細胞3遍，應用Trizol法抽提總RNA。紫外分光法檢測RNA純度和濃度。反轉錄參照TaKaRa公司試劑盒說明進行。按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒說明進行熒光定量PCR，內參基因為β-actin。擴增反應在Bio-Rad CFX- 96 Real-time PCR儀上進行。結果采用2-ΔΔCt方法分析，每組實驗均重復3次。RNF2上游引物：5′-AGCACAATAATCAGCAAGCACTC-3′，RNF2下游引物：5′-GCTCCACTACCATTTTCAATCTG-3′；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，β-actin下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.2.3 Western blot檢測RNF2蛋白： 用RIPA裂解液提取蛋白, BCA定量試劑盒進行蛋白定量，100 ℃變性10 min，將30 μg蛋白質通過12% SDS-PAGE進行分離。濕轉至硝酸纖維素膜，封閉1 h后，加入RNF2一抗(1/1 000)、p53一抗(1/1 000, Abcam公司)、β-actin一抗(1/5 000)溫育過夜。加入HRP標記羊抗兔二抗(1/5 000)，室溫溫育1 h后，用ECL超敏化學發光試劑盒顯色，Bio-Rad化學發光成像系統顯像。實驗重復3次。

1.2.4 MTS實驗檢測細胞增殖： 將處于對數期的PANC- 1細胞以1×104個/孔傳代至96孔板，細胞貼壁后分別轉染siRNA- RNF2或siRNA- NC，每組5個復孔，同時設置空白對照，6 h后換完全培養基繼續培養。在轉染前及轉染后24、48、72和96 h，加入20 μL MTS試劑，37 ℃培養4 h后震蕩1 min，490 nm波長處以自動酶標儀檢測吸光度A值。抑制率%=[(對照孔A值-試驗孔A值) /(對照孔A值-空白孔A值)]×100%，并繪制藥物劑量反應曲線。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡： 按上述轉染PANC- 1細胞，48 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，4 ℃預冷70%乙醇中固定過夜。次日PBS洗2遍，每個樣品均加入RNA酶A 10 μL和碘化丙啶(PI) 25 μL，4 ℃避光15 min，NovoCyte流式細胞計量儀(ACEA)檢測其周期。同樣操作收集細胞，PBS洗滌2遍后，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI熒光染料，按試劑盒說明書檢測其凋亡，實驗重復3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移： 分組轉染PANC- 1細胞后，以4×105個/孔傳代于6孔板中。培養至約90%匯合度時進行劃痕操作。繼續培養24 h，觀察細胞遷移能力。劃痕愈合率%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RNF2在胰腺癌細胞系中高表達

在3種胰腺癌細胞中RNF2 蛋白及mRNA水平的表達明顯高于HPDE6-C7細胞(P<0.05) (圖1)，其中PANC- 1組RNF2基因表達量相對較高，故后續實驗選用PANC- 1細胞作為siRNA轉染對象。

2.2 siRNA- RNF2轉染效率的檢測

PANC- 1細胞轉染siRNA- RNF2后24 h轉染率為18.92%±1.34%，顯著低于48 h的46.24%±2.92%。轉染48 h后PANC- 1/siRNA- RNF2組有綠色熒光細胞顯現，約占細胞總數的44%(圖2)，由此證實轉染成功。

2.3 siRNA- RNF2顯著下調PANC- 1細胞RNF2表達

轉染48 h后，siRNA- RNF2組PANC- 1細胞中RNF2 mRNA的表達水平為0.12 ± 0.04，顯著低于陰性對照組的1.04 ± 0.18 (P<0.05) 。siRNA干擾組細胞中RNF2的蛋白表達較陰性對照組也顯著下降(圖3)。

*P<0.05 compared with SW1990圖1 RNF2在胰腺癌細胞系中高表達 Fig 1 Expression of RNF2 was up-regulated in pancreatic cancers (±s, n=3)

*P<0.05 compared with mock圖2 PANC- 1細胞siRNA- RNF2轉染效率的檢測 Fig 2 Detection of transfection efficiency in PANC- 1 cells transfected with siRNA- RNF2 (×100, ±s, n=3)

*P<0.05 compared with mock and siRNA- NC圖3 siRNA- RNF2對PANC- 1細胞RNF2表達的影響Fig 3 Effect of siRNA- RNF2 on RNF2 expression in PANC- 1 cells (±s, n=3)

2.4 轉染siRNA- RNF2對PANC- 1細胞增殖、遷移、凋亡和周期的影響

siRNA- RNF2組細胞增殖能力在24 h時已降低，細胞增殖抑制率為9.2%±1.50%，至48、72和96 h時抑制率分別為17.5%±2.04%、28.1%±3.13%和51.5%±5.42%，顯著高于陰性對照相的細胞增殖抑制率(P<0.05) (圖4A)。劃痕24 h后，siRNA- RNF2組愈合率為19.22%±1.80%，顯著低于陰性對照組的59.30%±4.10%(P<0.05) (圖4B)。轉染48 h后，siRNA- RNF2組細胞凋亡率為20.36%±2.18%，高于陰性對照組的1.96%±0.52%(P<0.05) (圖4C)。轉染48 h后，siRNA- RNF2組G0/G1期的細胞比例為71.56%±5.42%，高于陰性對照組的48.38%±3.62%(P<0.05) (圖4D)。

2.5 轉染siRNA- RNF2對PANC- 1細胞p53表達水平的影響

轉染siRNA- RNF2后細胞中p53的蛋白表達較陰性對照組明顯上調(圖4E)，說明下調RNF2基因表達可以促進胞內p53的表達。

3 討論

RNF2是一種E3泛素連接酶。RNF2在許多惡性腫瘤中高表達，如乳腺癌和胰腺癌等，且其表達與腫瘤的發生、進展、預后以及化療耐藥關系密切[4- 5]。本實驗發現，相比正常胰腺導管上皮細胞，RNF2在胰腺癌細胞系中顯著高表達(圖1)，與HPA數據庫(http://www.proteinatlas.org/)數據及先前研究結果一致[5]。因此，RNF2可能成為胰腺癌新的腫瘤標志物和潛在的關鍵治療靶標。

下調RNF2表達可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，延緩腫瘤進展。研究發現下調RNF2表達可顯著抑制HCT116結腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡，其機制可能與調節MDM2和p53穩定性有關[6]。RNF2可通過抑制TXNIP表達促進前列腺癌進展，敲除RNF2基因則可明顯抑制前列腺癌細胞和體內移植瘤的生長[7]。已有研究表明，應用shRNA干擾RNF2表達可誘導食管癌細胞阻滯于G0/G1期并能增強腫瘤細胞對放療的敏感性[8]。

A.cell proliferation; B.cell migration; C.cell apoptosis; D.cell cycle; E.p53 expression;*P<0.05 compared with mock and siRNA- NC

圖4下調RNF2表達對PANC-1細胞增殖、遷移、凋亡、周期及p53表達的影響

以上結果提示靶向RNF2可為腫瘤防治提供新的思路。但也有報道顯示下調RNF2表達可以正性上調P-gp水平從而介導乳腺癌細胞化療耐藥[9]。為了研究siRNA- RNF2干擾后胰腺癌PANC- 1細胞增殖、遷移、凋亡和細胞周期的變化，本課題組進行了一系列相關實驗。結果表明，下調RNF2表達可有效抑制胰腺癌細胞增殖和遷移，阻滯細胞于G0/G1期，并能誘導細胞凋亡，與上述研究結果相一致。這一研究結果為更深入的研究RNF2在胰腺癌中的功能打下一定基礎。

針對下調RNF2表達抑制胰腺癌進展的可能機制，本課題組進行了初步探討。已有研究顯示，在腫瘤細胞中，RNF2通過其E3連接酶活性促進p53泛素化以降解p53從而發揮癌基因的作用，下調RNF2表達可使p53表達上調從而抑制腫瘤細胞的增殖[4,6]。p53是一種十分重要的腫瘤抑制蛋白，其主要作用為保持基因組的穩定性，減少基因突變的發生。研究發現p53的表達下調促進了腫瘤的發生和進展[10]。本實驗結果顯示，下調PANC- 1細胞中RNF2表達可使p53表達明顯上調，提示RNF2可能通過抑制p53表達發揮促癌作用。

綜上所述，下調RNF2表達可顯著抑制胰腺癌細胞增殖和遷移，阻滯細胞于G0/G1期，并促進細胞凋亡，機制可能與上調p53表達有關。這將有助于進一步了解胰腺癌發病機制，為胰腺癌的治療提供了新的干預靶點。

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RNA interference targeting gene of RING finger protein inhibits proliferation and migration of pancreatic cancer cell line PANC- 1

WU Yin-fang1,2, SUN Xiao-dong2*, ZHENG Yu2, HUANG Dong-sheng2

(1.the Second Clinical Medical College, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053; 2.Dept. of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Zhejiang Provincial People’s Hospital, People’s Hospital of Hangzhou Medical College, Hangzhou 310014, China)

ObjectiveTo investigate the effect of siRNA- mediated silencing ofRNF2 on cell proliferation, migration, cell cycle and apoptosis in human pancreatic cancer PANC- 1 cells and its possible mechanism.MethodsThe siRNA interference was used to down-regulate RNF2 expression. Meanwhile, there were also empty transfection group whose cells were transfected with the control siRNA and mock group without any treatment. The result of transfection was evaluated by fluorescence microscope. The expression of RNF2 mRNA was detected by RT-qPCR. Western blot was applied to detect the expression of RNF2 and p53. Cell proliferation and migration were analyzed by MTS assay and cell scratch assay, respectively. The transient transfection efficiency, apoptosis rate and cell cycle were measured by flow cytometry.ResultsCompared to the normalized human pancreatic duct epithelial cells, RNF2 expression in pancreatic cancer cells were higher (P<0.05). The expression of RNF2 mRNA and protein was decreased in PANC- 1 cells by siRNA- RNF2 at 48 h post-transfection. Transfection with siRNA- RNF2 inhibited the proliferation and migration of PANC- 1 cells (P<0.05), induced cell apoptosis (P<0.05), increased cell counts in phase G0/G1and decreased in S and G2/M phase (P<0.05). What’s more, after siRNA- RNF2 transfection, the expression of p53 protein was decreased.ConclusionssiRNA- RNF2 can specifically knockdown the expression of RNF2 gene and then inhibit the proliferation and migration of PANC- 1 cells. These results indicate RNF2 may be a potential target of gene therapy for pancreatic cancer.

RING finger protein 2; pancreatic cancer; growth inhibition; p53

2017- 09- 14

2017- 11- 18

浙江省自然科學基金(LY17H160066)

*通信作者(correspondingauthor)：sunxiaodong@hmc.edu.cn

1001-6325(2018)01-0074-06

R735.9

A