柚皮苷對缺血/再灌注損傷大鼠心肌pIκBα水平的影響

劉 丹，馮曉靈，潘連紅，金良友，張永慧*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校, 重慶 404120； 2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心, 重慶 404120；3.重慶三峽學(xué)院， 重慶 404120)

柚皮苷對缺血/再灌注損傷大鼠心肌pIκBα水平的影響

劉 丹1,2，馮曉靈1,2，潘連紅1,2，金良友3，張永慧1,2*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校, 重慶 404120； 2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心, 重慶 404120；3.重慶三峽學(xué)院， 重慶 404120)

柚皮苷(naringin，NAR)屬二氫黃酮類化合物,其具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗突變、降低血膽固醇、減少血栓形成和保護心臟等多種生物學(xué)作用。但關(guān)于柚皮苷對IκBα、pIκBα蛋白表達(dá)水平的影響，報道較少。本實驗建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型，觀察NAR苷對心肌缺血的保護作用及對心肌組織IκBα、pIκBα表達(dá)的影響，以探討其治療缺血性心血管病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料:柚皮苷(Sigma公司)純度≥95%(HPLC)；一抗IκBα、pIκBα(Santa Cruz公司)。清潔級雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～280 g[第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心，合格證號：SCXK(渝)2007- 0005]。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：大鼠隨機分為5組(10只/組):假手術(shù)組(sham組);心肌缺血/再灌注組(MI/R組),冠狀動脈左前降支結(jié)扎30 min;再灌注120 min和NAR 10、20和40 mg/kg組,分別灌胃，每日1次共7次，末次灌胃后60 min行MI/R手術(shù)為Nar干預(yù)組。冠狀動脈斷流及再通成功與否以心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)的ST段抬高及恢復(fù)作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 Western blot檢測:檢測心肌組織IκBα、pIκBα蛋白表達(dá)。將心肌組織置于冰裂解液收集總蛋白，BCA蛋白定量后，組織蛋白行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)印至 PVDF膜；脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別與IκBα、pIκBα一抗孵育，4 ℃過夜，TBST 漂洗后，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記偶聯(lián)的二抗 37 ℃ 孵育1 h。TBST 洗滌后加增強化學(xué)發(fā)光法(ECL) 發(fā)光試劑曝光、顯影、定影。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用ImageJ軟件分析，計算條帶的吸光度值，采用目的蛋白與內(nèi)參吸光度比值來表示蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對缺血/再灌注大鼠心肌組織IκBα蛋白水平的影響:與假手術(shù)組相比，缺血/再灌 2 h 后大鼠心肌組織IκBα蛋白含量明顯降低。給予NAR苷后明顯上調(diào)IκBα 蛋白水平(圖1)。

*P<0.01 compared with sham; #P<0.05, ##P<0.01 compared with MI/R圖1 各組心肌組織IκBα蛋白水平比較Fig 1 IκBα level in myocardial tissue(±s，n=3)

2.2 柚皮苷對缺血/再灌注大鼠心肌組織pIκBα蛋白水平的影響:與假手術(shù)組相比，缺血/再灌2 h后大鼠心肌組織pIκBα蛋白含量明顯增高。給予NAR苷后明顯下調(diào) pIκBα 蛋白水平。提示NAR能抑制 IκBα的磷酸化及進一步降解，從而抑制心肌缺血/再灌注后NF-κB通路的激活(圖2)。

3 討論

NF-κB是一種核蛋白轉(zhuǎn)錄因子，非活化狀態(tài)下其以NF-κB/IκB形式存在于胞質(zhì)中。在活性氧、 感染等因素作用下NF-κB被激活， 誘導(dǎo)與免疫和凋亡有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生物學(xué)作用。

*P<0.01 compared with sham; #P<0.01compared with MI/R圖2 各組心肌組織pIκBα蛋白水平比較Fig 2 pIκBα level in myocardial tissue(±s，n=3)

近年研究表明 NF-κB在缺血再灌注損傷病理過程中起著重要的作用[1]。七氟烷預(yù)處理可下調(diào)24 h后大鼠MI/R損傷后期 NF-κB水平，產(chǎn)生保護作用，說明NF-кB 參與了七氟烷預(yù)處理的延遲性心肌保護作用[2]。采用Western blot測定IκBα、pIκBα、NF-κBP65、pNF-κBP65的蛋白表達(dá)水平，證實三七皂苷R1可抑制pIκBα、NF-κBP65、pNF-κBP65蛋白水平。說明R1可以有效地改善1/R損傷的進展，可用于治療心肌缺血/再灌注損傷，其機制與抑制NF-κB 信號通路有關(guān)[3]。有研究表明，NAR可通過清除自由基，增強抗氧化活性對缺氧/復(fù)氧損傷的H9c2細(xì)胞具有保護作用[4]。

本實驗結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注后IκBα蛋白發(fā)生磷酸化并降解，NAR能抑制IκBα的磷酸化，從而抑制 NF-κB的激活，可能是其治療心肌缺血/再灌注損傷的機制之一。本實驗結(jié)果可為臨床應(yīng)用NAR治療心肌缺血/再灌注損傷提供一定的實驗基礎(chǔ)。

[1] Hsueh TP,Sheen JM,Pang JH,etal.The anti-atherosclerotic effect of naringin is associated with reduced expressions of cell adhesion molecules and chemokines through NF-κB pathway[J]. Molecules,2016，21：1- 15.

[2] 吳雪梅，王琛，謝紅等. NF-кB 參與七氟烷預(yù)處理所致延遲性抗大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，33：39- 43.

[3] Xia KP, Ca HM, Shao CZ.Protective effect of notoginsenoside R1 in a rat model of myocardial ischemia reperfusion injuryby regulation of vitamin D3upregulated protein 1/NF-κB pathway[J]. Pharmazie,2015,70:740- 744.

[4] Chen RC,Sun GB,Wang J,etal.Naringin protects against anoxia/reoxygenation induced apoptosis in H9c2 cells via the Nrf2 signaling pathway[J].Food Funct,2015,6:1331- 1344.

2017- 03- 20

2017- 05- 24

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項目(KJ1402501)；重慶市萬州區(qū)科學(xué)技術(shù)項目(201403051)

*通信作者(correspondingauthor)：304947859@qq.com

1001-6325(2018)01-0091-02

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