纖維素酶法提取黃秋葵多糖的工藝優化

孟 楠 樊振江 高雪麗

1（漯河食品職業學院，河南漯河462000）2（許昌學院，河南許昌461000）

黃秋葵（Okra,Hibiscus esculentus L.）別名羊角豆，為錦葵科秋葵屬，是一年生藥食同源植物，其果實可供食用，富含多種營養素，如蛋白質、多糖、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質等。近年來，國內外學者對秋葵已有研究，表明經常食用秋葵可提高人體免疫力、增強體質，是一種營養價值高、開發前景好的草本植物。

黃秋葵果實中富含多種營養素，營養價值和藥用保健功能極高，具有廣泛的應用前景。有研究表明，每100 g秋葵果實中約含蛋白質22.98 g，維生素C44 mg，磷65 mg，維生素B10.2 mg，維生素E 1.03 mg，鎂 29 mg，維生素B20.2 mg，維生素PP 1.0 mg，鐵 0.8 mg，脂肪 9.4 g，鉀 95 mg，黃酮2.56 g，鈣 45 mg。

現代藥理學研究表明，秋葵具有多種生物活性成分，具有很高的藥用價值。秋葵果實中特有的黏性物質可助消化，能有效治療胃炎、保護肝臟和提高人體體質，其黏液亦可當做脂肪替代物使用，在巧克力和餅干制作中均有應用。此外，秋葵多糖還具有增稠、乳化等功效。Zheng Wei等對黃秋葵花中多糖成分進行了分離純化，結果表明水溶性多糖組分可以有效抑制癌細胞增殖，且還有一定免疫調節功能，為進一步深入研究和應用秋葵多糖提供了依據。因此，秋葵多糖在食品行業具有良好的開發潛力和應用前景。

本文以黃秋葵果實為研究對象，采用纖維素酶法提取秋葵多糖，研究反應時間、反應溫度、酶濃度、底物濃度對多糖提取率的影響，并在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗對黃秋葵果實多糖的提取工藝條件進行優化，旨在為秋葵多糖的工業化提取和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

黃秋葵，購自河南省漯河市丹尼斯超市。

1.2 儀器

UV-2550紫外分光光度計，日本島津；DZF-6090真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京長風儀器儀表公司；RE-2000E型旋轉蒸發器，天津凱易達儀器有限公司；奧立龍pH計868型，上海熱電儀器公司；SHZ（Ⅲ）循環水式真空泵和電熱套，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝流程

秋葵→挑選清洗→打漿→酶法提取→減壓濃縮→真空冷凍干燥→粗多糖

1.3.2 工藝要點

a）原料選擇：要求秋葵新鮮，無蟲蛀、無霉變。

b）打漿：以一定的料水比進行打漿，破碎秋葵，使提取更充分。

c）酶法提取：在不同提取溫度、提取時間、酶濃度、底物濃度條件下進行提取秋葵多糖。

d）減壓濃縮：將浸提液過濾，在真空度-0.06 MPa～0.08 MPa條件下進行濃縮至膏狀。

e）真空冷凍干燥：真空冷凍干燥制備粗多糖。

1.3.3 秋葵多糖得率

秋葵多糖得率=提取物中多糖含量（g）/秋葵原料多糖含量（g）。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

采用苯酚-硫酸法測定秋葵多糖含量。分別配制質量濃度為 0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL的萄萄糖標準溶液，在490 nm處測其吸光度值。以葡萄糖標準溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。回歸方程為 y=9.768 9x-0.066 7（R2=0.994 6）。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 酶解反應的單因素試驗

根據前期研究，本試驗以中性纖維素酶為處理手段，分別研究提取時間、提取溫度、酶濃度、底物濃度等因素對秋葵多糖得率的影響。

2.2.1 提取時間對秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%(g/g)、酶濃度為0.3%(g/g)、提取溫度為50℃及pH為6.0時，提取時間分別取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h進行試驗，其試驗結果見圖2。

圖2 提取時間對秋葵多糖得率的影響

從圖2中可以看出，隨著提取時間的延長，得率曲線趨于平穩，增加不明顯。這可能是由于試驗初始，酶濃度比較大，活性較高，能快速分解秋葵纖維組織，使秋葵多糖釋放；隨著時間的延長，酶不斷被消耗，活性降低，反應接近停滯。考慮到經濟實用性，確定適宜的反應時間為2 h。

2.2.2 提取溫度對秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%、酶濃度為0.3%、提取時間為1.5 h及pH為6.0時，分別選擇提取溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進行試驗，試驗結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對秋葵多糖得率的影響

由圖3可知，在一定的作用時間里，當提取溫度小于50℃時，秋葵多糖得率隨著反應溫度的增加而升高；當提取溫度超過50℃時，秋葵多糖得率隨著提取溫度的增加而降低。這是因為在纖維素酶酶解過程中，溫度對酶解反應效率的影響包括兩個方面，即酶催化反應速度及酶的穩定性。在酶的最適溫度以下，隨著溫度的升高，反應物的能量和分子間有效接觸的頻率增加，因而反應速度加快；超過最適溫度，酶分子的空間結構由于能量的增加而發生改變，導致酶活性減弱或喪失，從而影響催化效果。由此，在溫度50℃～60℃范圍內，秋葵多糖具有較高的得率，可作為下一步正交優化試驗的溫度可選范圍。

2.2.3 酶濃度對秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即底物濃度為10%、提取溫度為50℃、提取時間為1.5 h及pH為6.0時，分別選擇纖維素酶酶濃度為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進行試驗，研究其對秋葵多糖得率的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，隨著酶濃度的增加，秋葵多糖得率也逐漸增大。當酶濃度超過0.4%時，秋葵多糖的得率增加不明顯，因此，確定酶的適宜濃度為0.4%。

2.2.4 底物濃度秋葵多糖得率的影響

在固定的條件下，即酶濃度為0.3%、提取溫度為50℃、提取時間為1.5 h及pH為6.0時，分別選擇底物濃度為5%、10%、15%、20%、25%進行試驗，研究其對秋葵多糖得率的影響，結果如圖5所示。

圖4 酶濃度對秋葵多糖得率的影響

圖5 底物濃度對秋葵多糖得率的影響

由圖5可以看出，隨著底物濃度的增加，秋葵多糖得率都逐漸增大，主要是因為底物濃度增加，反應速率增加。但當底物濃度超過達到一定值時，反應速率顯著減小。

2.3 酶解反應的優化試驗

由單因素試驗可以得出酶解反應適宜作用條件：底物濃度為10%、酶濃度為0.4%、提取時間為1.5 h、提取溫度為50℃及pH為6.0。為進一步得到酶解的較優條件，再進行L16（45）正交試驗，因素水平設計見表1，正交試驗結果見下頁表2。

表1 因素水平設計表

由極差分析可知，各因素對秋葵多糖得率的影響大小順序為：A＞C＞D＞B，即酶濃度＞底物濃度＞提取時間＞提取溫度，最優組合為A4B4C3D3，即酶濃度為0.5%，提取時間為2.0 h，提取溫度為60℃，底物濃度為10%。正交試驗方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

由表3方差分析結果可知，在顯著水平P=0.05時，酶濃度、底物濃度兩因素都顯著，由方差分析得出影響因素大小順序為酶濃度、底物濃度、提取時間、提取溫度，這和極差分析結果一致。

經驗證試驗，正交優化出的條件為：酶濃度0.5%，提取時間2.0 h，提取溫度60℃，底物濃度10%，此工藝條件下秋葵多糖得率為81.06%。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗發現，影響秋葵多糖得率的4個因素的主次順序為：酶濃度＞底物濃度＞提取時間＞提取溫度，最優組合為A4B4C3D3，即酶濃度為0.5%，提取時間為2.0 h，提取溫度為60℃，底物濃度為10%。經驗證試驗測得在最佳條件下秋葵多糖得率為81.06%。采用纖維素酶法提取秋葵多糖，具有高效、易操作，對環境污染小等優勢。

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