華南虎源大腸桿菌耐藥性與致病性研究

黃翠琴 ， 楊守深 ， 梁齊章 ， 王正磊 ， 楊小燕 ， 吳德峰 ， 尹會方

(1. 龍巖學院生命科學學院 ， 福建 龍巖 364012 ； 2.福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室 ， 福建 龍巖 364012 ；3.福建農林大學動物科學學院 ， 福建 福州 350002)

華南虎是我國特有的虎亞種，目前野外幾乎滅絕。梅花山中國虎園景區位于福建省龍巖市上杭縣步云鄉，是我國重要的華南虎拯救工程基地。由于華南虎在生態系統中具有重要的地位，因此，對華南虎致病菌及其耐藥性的研究，對該物種的保護和繁育具有重要意義。大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界，能引起人和動物共同感染的重要人獸共患病，常常與其他病原菌混合感染，發病率和死亡率較高，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。

目前對該地區虎源大腸桿菌耐藥性和致病性缺乏相應的參考資料，因此，本研究通過無菌采集龍巖梅花山虎園老虎的糞便，進行大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗、動物毒力試驗以及毒力基因檢測。通過研究獲得其致病性及耐藥情況，為龍巖梅花山地區虎源致病性大腸桿菌病的防控和臨床合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2015年采集龍巖梅花山華南虎園4只健康母虎新鮮糞便分離大腸桿菌，經分離純化得到的4株大腸桿菌，本次取樣母虎未使用任何藥物。試驗小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；麥康凱培養基、LB肉湯、MH肉湯、MH瓊脂和伊紅美藍瓊脂，均購自廣州環凱微生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 細菌分離鑒定 采用無菌棉簽采集母虎的新鮮糞便，接種于LB肉湯培養基，并置于37 ℃的恒溫搖床(200 r/min)培養箱中培養3～6 h。用接種環取少量培養液均勻劃線接種于麥康凱培養基中，37 ℃的恒溫培養16～24 h。挑選疑似菌落進一步純化，并通過革蘭染色后鏡檢和16S rRNA(F：5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′，R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[1]。

1.3 藥敏試驗 大腸桿菌的藥物敏感性測定按照CLSI(2010)推薦方法執行[2]。大腸桿菌ATCC 25922作為藥敏質控菌。

1.4 動物試驗 試驗小鼠10只，隨機分為試驗組A、B、C、D和對照組E，每組2只。試驗組腹腔接種LB菌液，每只0.5 mL；對照組腹腔接種相同劑量的空白LB液體培養基，隔離飼養。觀察發病及死亡情況。

1.5 毒力基因的檢測 采用水煮法提取細菌基因組DNA作為PCR模板，分別對8種毒力基因進行PCR檢測。8對引物毒力基因引物序列及目的片段長度參考文獻報道[3]，見表1。

表1 毒力基因引物序列及片段長度

F：上游引物； R：下游引物

2 結果與分析

2.1 細菌分離和鑒定 從龍巖梅花山虎園中采集4份母虎糞便，經分離純化得到的4株大腸桿菌。細菌在麥康凱培養基中，呈粉色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起；在伊紅美藍培養基中，菌落中心呈黑色，有金屬光澤。革蘭染色結果鏡檢觀察可見兩端頓圓、呈短桿狀、紅色的革蘭陰性菌。經16S rRNA 鑒定，可得到目的條帶，確定分離株菌為大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗結果 根據紙片法抗菌藥物敏感試驗方法，其結果見表2。分離株對復方新諾明的耐藥率最高為100%；對多西環素和阿莫西林/克拉維酸耐藥率均為75%；對恩諾沙星和左氧氟沙星的耐藥率為50%。對慶大霉素的敏感性最好；對頭孢呋辛和頭孢噻呋敏感性下降。

表2 藥敏試驗結果

R：耐藥 ； I：中介 ； S：敏感

2.3 動物實驗結果 在接種后3 h之內，試驗組D中1只小鼠死亡，剖檢無明顯病理變化。12 h之內，試驗組A和B各有1只小鼠死亡，剖檢可見心包淤血，肝臟腫大，小腸有紅棕色水樣稀糞(見中插彩版圖1)。其余小鼠反應遲鈍，食欲減退，精神沉郁。24 h之內C組未發生小鼠死亡。對照組小鼠始終正常。

2.4 毒力基因檢測結果 對分離株的8種毒力基因進行PCR檢測，測結果見表3。所有菌株均攜帶有2個以上的毒力基因，其中1株菌攜帶有高達6個毒力基因。毒力基因aatA的檢出率最高為100%；irp2檢出率次之為75%；papC、iucD、vat、iss檢出率均為50%；毒力基因tsh和cva/cvi未檢出。

表3 大腸桿菌毒力基因檢測結果

3 討論

野生動物的耐藥性相對研究較少，有文獻表明，圈養虎源大腸桿菌同樣表現出較強的耐藥性，如對哈爾濱市東北虎林園虎源大腸桿菌，對氨芐西林耐藥率為100 %，四環素和復方新諾明的耐藥率均高于80%[4]；有時不僅耐藥率高，其相應耐藥基因攜帶率也高，如30株虎大腸桿菌對氯霉素的耐藥率為85%，對氟苯尼考的耐藥率為78%，其耐藥基因cmlA檢出率高達70%[5]。龍巖梅花山虎園華南虎主要是圈養管理，本研究中所檢大腸桿菌對受試的抗菌藥物呈多重耐藥性，并且對復方新諾明100% 耐藥。耐藥性的產生為臨床有效治療帶來了極大的困難，因此，確定致病性大腸桿菌的耐藥譜，尋找最佳療效的藥物成為科學防治大腸桿菌病的必要措施。

為確認分離株是否為致病菌，本研究結合動物實驗和PCR方法對其致病性進行檢測。雖然大腸桿菌的致病性主要集中在某些特定的血清型[6]，但是有研究表明，血清型相同，菌株間攜帶毒力相關基因存在差異[7]。因此有必要對毒力因子攜帶情況進行研究，其中與大腸桿菌感染有關的毒力因子主要有粘附素和毒素。本試驗除了做動物實驗外，還對其毒力基因進行檢測。分離株在12 h～48 h內致小鼠死亡，均含有8種毒力基因中的2種及2種以上。接4號大腸桿菌小鼠死亡時間最快，攜帶有6種毒力基因，致病性最高。1號和2號大腸桿菌分別攜帶有4種和3種毒力因子，其致病性高于3號菌株。結合本次的動物實驗，毒力基因攜帶情況可以反映出其致病力的高低。謝和平等研究表明，虎源大腸桿菌同時攜帶irp2、iucD和iss基因，其毒力較強在36 h內攻毒小鼠的死亡率高達100%[1]。在本試驗中以上3種毒力基因均有檢測，其中irp2檢出率最高(3/4)，iucD和iss檢出率相同(2/2)，毒力基因的攜帶率較高。

通過本次對虎源大腸桿菌的耐藥性和致病性的研究，盡管樣本數不大，但是發現了圈養虎腸道中攜帶的大腸桿菌表現出較強的耐藥性，并且顯示出明顯的致病性。因此，圈養虎攜帶病原菌的耐藥性和致病性應引起廣大科研工作者的重視。

[1] 謝和平，朱慶艷，陳武，等. 華南虎源大腸桿菌的快速鑒定及致病特性的初步研究[J]. 野生動物,2012(03):109-112.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twentieth Informational Supplement M100-S20. CLSI Wayne P A[J]. USA， 2010.

[3] 張宇曦，韓先干，左佳坤，等. 禽致病性大腸桿菌脂多糖核心型分布與毒力基因的相關性分析[J]. 微生物學通報,2015，42(08):1 619-1 625.

[4] 薛原，李鳳勇，孫靜，等. 虎源大腸桿菌耐藥性的檢測與分析[J]. 經濟動物學報,2013，16(01):31-34.

[5] 薛原，王曉菲，陳建飛. 圈養虎源大腸桿菌中氯霉素類藥物耐藥基因的調查[J]. 經濟動物學報,2016，19(01):33-35.

[6] Frydendahl K. Prevalence of serogroups and virulence genes in Escherichia coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches[J]. Vet Microbiol，2002,85(2):169-182.

[7] 王秀梅，蔣紅霞，廖曉萍，等. 豬源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因及抗菌藥耐藥性的調查[J]. 中國農業科學,2010，43(19):4 109-4 115.