RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用研究

目的：探究RNA干擾技術(shù)的原理與應(yīng)用。方法：選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，直徑分別為4.6×300mm、2.1×30mm，流速分別為≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱溫分別為<60℃、20℃～25℃，pH范圍分別為2～12、2.5～7.5，流量參數(shù)分別0.3mL/min、0.075mL/min，分子退出系數(shù)為170 200，樣品總體積500μl，鹽酸小檗堿濃度10、15、20、30、40pmol/μL；給予HPLC級(jí)乙腈、HPLC梯度級(jí)水以及P4417SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（0.01M），檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，經(jīng)由體積排阻色譜法分析檢測(cè)。結(jié)果：不同濃度下，濃度與峰高之間呈正比關(guān)系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172。結(jié)論：采用不同色譜柱及鹽酸小檗堿用于評(píng)估RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用效果較好。

RNA技術(shù)在制藥產(chǎn)業(yè)應(yīng)用范圍較廣泛，比如乳腺癌、腦部膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤、以及遺傳性疾病等。由于制藥涉及的原理及機(jī)制比較復(fù)雜，類型較多，比如反義寡核苷酸、小干擾RNA等，但由于RNA藥物修飾、傳遞及免疫激活等方面尚未完全研究清楚，因此需進(jìn)一步研究[1-2]。鹽酸小檗堿是一種生物堿，具有抑菌作用，能夠有效清除毒素，作為寡核苷酸修飾后產(chǎn)物，屬于臨床常用藥，可單用，也可作為添加于其他藥物，作為一種藥物成分[3-4]。本次研究選擇Dionex Ultimate3000型色譜儀，分別選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，經(jīng)由體積排阻色譜法進(jìn)行檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果，獲得一定研究成果，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

設(shè)備與試劑

本次研究選擇Dionex Ultimate3000（Thermo Scientific制造）型色譜儀，分別選擇Acclaim SEC-300（5μm，分析范圍4.6×300mm，由Thermo Scientific制造）及MAbPac SEC-1色譜柱（5μm，分析范圍2.1×300mm，由Thermo Scientific制造），濃度測(cè)量?jī)x器為Nanodrop2000（Thermo Scientific制造），離心機(jī)為Thermo Legend Micro17離心機(jī)，20μL環(huán)形Nano Viper/彩色PEEK管（內(nèi)部直徑為0.18mm），震蕩攪拌機(jī)，Mettler toledo 320 pH計(jì)；主要化學(xué)試劑如下：HPLC梯度級(jí)水（Fisher Scientific制造，英國(guó)），HPLC級(jí)乙腈（Fisher Scientific制造，英國(guó)），P4417 SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（片劑，一片溶于200mlHPLC水中，得到0.01M磷酸鹽緩沖液）；鹽酸小檗堿（產(chǎn)品編號(hào)GZDD-0060，CAS號(hào)633-65-8，質(zhì)地純度≥98.837%，來(lái)自貴州迪大科技有限責(zé)任公司，常規(guī)包裝30mg）。

方法

本次研究選擇Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色譜柱，其直徑分別為4.6×300mm、2.1×30mm，流速分別為≤0.35mL/min、0.05～0.075mL/min，柱溫分別為<60℃、20℃～25℃，pH范圍分別為2～12、2.5～7.5，流量參數(shù)分別0.3mL/min、0.075mL/min，平衡時(shí)間分別為50min、42min；給予HPLC級(jí)乙腈、HPLC梯度級(jí)水以及P4417SIGMA磷酸鹽緩沖鹽水（0.01M），檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，經(jīng)由體積排阻色譜法進(jìn)行檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)方法如下：1）吸取HPLC梯度級(jí)水（5μL）轉(zhuǎn)移至設(shè)備頂部，合上裝置臂，再次打開后，擦拭頂部HPLC梯度級(jí)水，重復(fù)2～5次，保證設(shè)備頂部足夠干凈；2）進(jìn)入系統(tǒng)設(shè)置后，選擇計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的寡核苷酸計(jì)算模式，輸入序列后，得到分子量及分子退出系數(shù)等實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)參數(shù)；3）鹽酸小檗堿檢測(cè)樣品濃度10、15、20、30、40pmol/μL；測(cè)試鹽酸小檗堿樣品前，以2μL HPLC梯度水作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組，開始樣品濃度測(cè)試，每次吸取樣品2μL；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，儀器頂部同樣使用HPLC梯度級(jí)水清洗；準(zhǔn)備好樣品（單個(gè)樣品總體積500μl，最大濃度400pmol/μl）、制備緩沖液，設(shè)定濃度為5pmol/μl；-20℃條件下保存于冰凍箱內(nèi)；檢測(cè)時(shí)，將樣本取出后放置于室溫下，直至樣品完全融化后，經(jīng)渦旋混合器混合、經(jīng)離心5min后，去除氣泡，再繼續(xù)其余實(shí)驗(yàn)步驟；層析寡核苷酸樣品，自動(dòng)取樣針依次吸取PBS緩沖液、鹽酸小檗堿樣品、PBS緩沖液；每個(gè)緩沖液均需在脫氣15min后再與色譜系統(tǒng)相連，在實(shí)驗(yàn)中持續(xù)關(guān)注PBS緩沖液情況，PBS緩沖液需及時(shí)更換，但不得中斷，保證色譜柱不干燥[5-7]。

結(jié)果

鹽酸小檗堿在40.371～215.109pmol/μL濃度范圍內(nèi)與峰高之間存在線性關(guān)系，R2=0.9302，方程y=5.069x-14.172，詳見(jiàn)表1-表5。

結(jié)論

20世紀(jì)初，國(guó)外學(xué)者初次提出dsRNA能夠?qū)RNA產(chǎn)生具有特異性作用的講解作用，能夠特異性抑制相應(yīng)基因在生物體內(nèi)的表達(dá)，也就是在轉(zhuǎn)錄后出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象，即RNA干擾，廣泛存在于生物體內(nèi)，屬于機(jī)體排除外源性核酸物質(zhì)及內(nèi)源性異常表達(dá)物質(zhì)所表現(xiàn)出的生物自我保護(hù)機(jī)制，這為臨床研究基因藥物提供具有臨床效果良好的研發(fā)思路。隨著對(duì)RNA干擾技術(shù)的不斷深入研究，以及應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研發(fā)藥物應(yīng)用率逐漸提升，該技術(shù)有望成為研究基因藥物的重要工具，從而為腫瘤及遺傳性疾病的治療提供強(qiáng)烈助力。小干擾RNA，即siRNA，通常需要與堿基配對(duì)后，方可對(duì)同源的mRNA進(jìn)行有效識(shí)別，并參與其介導(dǎo)過(guò)程。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，siRNA在生物體內(nèi)具有一種結(jié)構(gòu)相似的雙聯(lián)RNA，而且siRNA形成過(guò)程中，核酸酶Dicer以二聚體形式參與該過(guò)程，由于不同生物體內(nèi)的核酸酶Dicer存在一定的差異，因此形成的siRNA結(jié)構(gòu)也存在一定的差異，由此引發(fā)的干擾復(fù)合體，即RISC，其把序列作用是反義siRNA，在ATP存在條件下，雙鏈siRNA被解開，即正義鏈與反義鏈互換，而且在RISC活化狀態(tài)下靶mRNA序列被切斷。然后新siRNA與同源的新mRNA進(jìn)行有效識(shí)別配對(duì)。siRNA相關(guān)藥物樣品可在單修飾及完全修飾情況下，在不同條件下進(jìn)行影響的檢測(cè)及研究，有助于從不同方面進(jìn)一步研究該藥物的功效及藥理作用。本次研究所用的藥物屬于植物體內(nèi)合成后提取，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，為檢測(cè)提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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（作者簡(jiǎn)介：劉敏楠，謝菲爾德大學(xué)（英國(guó)），研究方向?yàn)樯锕こ?。）endprint