玉米ZmMGT0基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化研究

李洪有，張素芝，陳慶富

(1.貴州師范大學(xué) 蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550001；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米所，農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

鎂是葉綠素的重要組成成分和超過300種酶的激活劑，參與了植物光合作用、呼吸作用、N代謝等眾多重要的生理代謝過程[1-2]。鎂缺乏將會(huì)抑制植物光合作用，同化物由“源”器官向“庫”器官的分配，進(jìn)而影響植物的正常生長發(fā)育，并最終影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量與品質(zhì)[3-4]。研究表明，CorA/MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在生物體鎂離子平衡中起著重要作用[5-9]。

在植物中，CorA/MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因已在擬南芥、水稻、玉米、鐵皮石斛、巴西橡膠樹中克隆[10-14]，但有關(guān)該類蛋白的功能研究主要集中在擬南芥中。研究表明，幾個(gè)擬南芥MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在擬南芥低鎂脅迫抵抗中起著重要作用。Deng等[15]在煙草中的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)擬南芥AtMGT1基因增加了轉(zhuǎn)基因煙草植株根對Mg2+的吸收，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對低鎂脅迫的抵抗。Gebert等[16]對擬南芥CorA/MRS2/MGT家族基因的T-DNA插入突變體進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，mrs2-7植株不能在Mg2+濃度低于50 μmol/L 的培養(yǎng)條件下正常生長，表明AtMRS2-7/AtMGT7是擬南芥在低鎂環(huán)境下正常生長發(fā)育所必需的。Mao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，AtMRS2-4/AtMGT6在擬南芥根中的表達(dá)受低鎂脅迫誘導(dǎo)，且在低鎂環(huán)境下其RNAi植株的根和葉中的Mg2+積累量均低于野生型植株，其生長受到的抑制明顯強(qiáng)于野生型植株，表明AtMRS2-4/AtMGT6介導(dǎo)的Mg2+吸收是擬南芥在低鎂環(huán)境下正常生長發(fā)育所必需的。最近，Oda等[18]通過對低鎂脅迫下EMS誘變的擬南芥M2群體篩選進(jìn)一步證明AtMRS2-4/AtMGT6和AtMRS2-7/AtMGT7是擬南芥在低鎂環(huán)境中正常生長發(fā)育所必需的。

雖然研究已經(jīng)表明，擬南芥CorA/MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在抵抗擬南芥低鎂脅迫中起著至關(guān)重要的作用，但該類基因在其他植物，尤其在作物中是否具有相關(guān)作用還不清楚。前面的研究發(fā)現(xiàn)，玉米基因組中有12個(gè)CorA/MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其中ZmMGT10(基因ID：GRMZM2G018706)具有鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其在根中特異性表達(dá)，且表達(dá)受缺鎂脅迫誘導(dǎo)，暗示其可能在抵抗植物低鎂脅迫中起作用[13]。本研究通過構(gòu)建ZmMGT10的過表達(dá)載體，在擬南芥中過表達(dá)該基因來研究它是否具有抵抗低鎂脅迫的功能。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：野生型擬南芥(生態(tài)型為Col-0)；菌株：大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌EHA105；載體：克隆載體pMD19-T、植物表達(dá)載體PCMBIA2300-eGFP；質(zhì)粒：pMD19-T∷ZmMGT10(農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ZmMG10植物過表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)ZmMGT10基因cDNA序列和PCMBIA2300-eGFP載體多克隆位點(diǎn)特征，設(shè)計(jì)帶有KpnⅠ酶切位點(diǎn)的上游引物ZmMGT10-FO(5′-ATGGTACCATGGGGAGGTTATCGGGAAG-3′)和帶有PstⅠ酶切位點(diǎn)的下游引物ZmMGT10-RO(5′-ATCTGCAGTCAACTGCCAAGTAGCCTGTTC-3′)，以pMD19-T∷ZmMGT10質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增ZmMGT10基因完整的ORF，將完整的ORF克隆到PCMBIA2300-eGFP載體的KpnⅠ/PstⅠ酶切位點(diǎn)間，得到PCMBIA2300∷ZmMGT10重組植物表達(dá)載體。

1.2.2 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 采用凍融法將PCMBIA2300∷ZmMGT10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，待生長在22 ℃長日照(16 h光照/8 h黑暗)條件下的擬南芥長出花蕾時(shí)，利用蘸花法侵染擬南芥(中途多次侵染)[19]。轉(zhuǎn)化完畢后將擬南芥平放并用黑塑料袋蓋住，暗培養(yǎng)24 h后重新垂直放置小盆，在22 ℃長日照(16 h光照/8 h黑暗)條件下培養(yǎng)，收獲T0種子。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗鑒定 將T0種子用70%的酒精消毒2 min，再用2%的次氯酸鈉消毒15 min。消毒后的種子用無菌水沖洗干凈，隨后將種子用膠頭滴管均勻地點(diǎn)在含50 mg/L的卡那霉素MS固體培養(yǎng)基上，并在4 ℃黑暗春化處理3 d，隨后移入22 ℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)14 d后能在平板上正常生長的幼苗鑒定為初步鑒定的轉(zhuǎn)基因陽性苗，并將其移入土壤中，置于人工氣候室培養(yǎng)。取1個(gè)月大初步鑒定的轉(zhuǎn)基因陽性苗葉片，利用CTAB法提取DNA，利用上游引物35SF：5′-AAGGAAGGTGGCTCCTACAA-3′(CaMV35S啟動(dòng)子序列)和下游引物ZmMGT10R：5′-CGTTAGTCATGAACACCTCG-3′(ZmMGT10序列)對初步鑒定的陽性苗進(jìn)行基因組PCR檢測。單株收獲經(jīng)基因組PCR證實(shí)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的T1種子。播種T1轉(zhuǎn)基因種子，提取T1轉(zhuǎn)基因植株RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ZmMGT10基因在T1轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥Mg2+吸收分析 將14 d的野生型和轉(zhuǎn)基因株系#1的T1幼苗轉(zhuǎn)移至含2 mmol/L MgSO4·7H2O全營養(yǎng)液中培養(yǎng)10 d，隨后轉(zhuǎn)移到含0 mmol/L MgSO4·7H2O培養(yǎng)10 d。對于時(shí)間依賴的Mg2+攝取分析，經(jīng)Mg2+饑餓處理的野生型和轉(zhuǎn)基因植株移至含0.01，2.00 mmol/L MgSO4·7H2O營養(yǎng)液中培養(yǎng)10，30，60，120，180，240 min，收獲根用于Mg2+含量測定。對于濃度依賴的Mg2+攝取分析，經(jīng)Mg饑餓處理的野生型和轉(zhuǎn)基因植株在含0.00，0.01，0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，3.00 mmol/L MgSO4·7H2O營養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，收獲各濃度處理下擬南芥的根用于Mg2+含量測定。Mg2+含量測定參照Mao等[17]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMGT10植物過表達(dá)載體構(gòu)建

用KpnⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶分別對ZmMGT10 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PCMBIA2300-eGFP(切掉eGFP)進(jìn)行雙酶切，回收目的片段。將回收的ZmMGT10片段和PCMBIA2300-eGFP大片段用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR檢測后搖菌提取質(zhì)粒。質(zhì)粒用KpnⅠ和PstⅠ進(jìn)行雙酶切，得到了2條預(yù)期大小的條帶(圖1-A)。將陽性克隆送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與ZmMGT10參照序列完全一致，說明ZmMGT10基因的植物過表達(dá)載體構(gòu)建成功，將其命名為PCMBIA2300∷ZmMGT10(圖1-B)。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

利用凍融法將PCMBIA2300∷ZmMGT10重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，陽性轉(zhuǎn)化子采用花絮侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Col-0)，收獲T0轉(zhuǎn)基因種子。T0轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)50 mg/L卡那霉素抗性篩選和基因組PCR鑒定，得到15株轉(zhuǎn)基因陽性植株(圖2-A、B)，單株收獲T1轉(zhuǎn)基因種子。提取T1植株的總RNA，以擬南芥Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對ZmMGT10在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，ZmMGT10在15個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有表達(dá)，其中株系#1、#6、#12具有較高表達(dá)，選用于后繼試驗(yàn)(圖3)。

M.DL10000分子標(biāo)記；1.PCMBIA2300載體酶切回收產(chǎn)物；2.PCMBIA2300∷ZmMGT10重組質(zhì)粒；3.PCMBIA2300∷ZmMGT10重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；4.ZmMGT10酶切回收產(chǎn)物。

M.DL10000 Marker；1.Enzyme digestion product of PCMBIA2300 vector；2.PCMBIA2300∷ZmMGT10 recombinant plasmids；3.Enzyme digestion product of PCMBIA2300∷ZmMGT10 recombinant plasmids；4.Enzyme digestion product ofZmMGT10.

圖1PCMBIA2300∷ZmMGT10重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(A)及結(jié)構(gòu)(B)
Fig.1Enzymedigestion(A)andstructure(B)ofPCMBIA2300∷ZmMGT10recombinantplasmids

M.DL2000分子標(biāo)記；P.質(zhì)粒；W.水；WT.野生型植株；

圖3 ZmMGT10在轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的表達(dá)Fig.3 Expression level of ZmMGT10 in transgenic Arabidopsis lines

2.3 轉(zhuǎn)ZmMGT10基因擬南芥在低鎂生長條件下的表型觀察及生理指標(biāo)分析

將14 d的野生型和轉(zhuǎn)基因株系#1、#6、#12的T1擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到全營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，隨后2種材料各分為2組，分別在含2 mmol/L MgSO4·7H2O (+Mg)和0.01 mmol/L MgSO4·7H2O (-Mg)的營養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d后觀察表型。結(jié)果如圖4-A所示，在Mg充足條件下野生型擬南芥植株和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株間沒有明顯的表型差異，而在低鎂條件下，野生型植株的生長略弱于轉(zhuǎn)基因植物，且野生型植株的中齡葉出現(xiàn)缺鎂黃化癥狀。此外，在Mg充足條件下的野生型和轉(zhuǎn)基因植株大小略大于低鎂條件下植株的大小，葉色也略綠于低鎂條件植株的葉色。根長分析顯示，在Mg充足條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的主根長無明顯差異；而在低鎂條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根生長明顯受到抑制，但轉(zhuǎn)基因植株受到的抑制明顯弱于野生型植株(圖4-B)。生物量(以鮮質(zhì)量計(jì))分析顯示，在Mg充足條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的生物量無明顯差異；而在低鎂條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株的生物量明顯降低，但轉(zhuǎn)基因植株的生物量要顯著高于野生型植株的生物量(圖4-C)。葉片葉綠素濃度(以鮮質(zhì)量計(jì))分析顯示，在Mg充足條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素濃度無明顯差異；而低鎂生長條件明顯減少了野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素濃度，但轉(zhuǎn)基因植株葉片的葉綠素濃度顯著高于野生型(圖4-D)。這些結(jié)果表明，低鎂影響了植物的正常生長，過表達(dá)ZmMGT10基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗。

WT.野生型植株；#1、#6、#12.轉(zhuǎn)基因株系1、6、12。不同字母代表差異顯著(P<0.05)。圖5同。WT.Wild type plants；#1，#6，#12.Transgenic 1，6 and 12 lines.Different letters indicate statistic significant difference at P<0.05.The same as Fig.5.

2.4 轉(zhuǎn)ZmMGT10基因擬南芥在低鎂生長條件下Mg2+積累分析

為了探索過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗是否與轉(zhuǎn)基因植株在低鎂條件下有更多Mg2+積累有關(guān)，檢測了Mg充足和低鎂生長條件下野生型和轉(zhuǎn)基因植株的根和梢中的Mg2+含量。結(jié)果如圖5所示，在Mg充足生長條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株的根和梢中的Mg2+含量(以干質(zhì)量計(jì))無明顯差異；而在低鎂生長條件下，2種材料的根和梢中的Mg2+含量均明顯低于Mg充足條件下2種材料根和梢中的Mg2+含量，但轉(zhuǎn)基因植株根和梢中的Mg2+含量均顯著高于野生型植株。這些結(jié)果表明，過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗與轉(zhuǎn)基因植株在低鎂條件下有更多的Mg2+積累有關(guān)，暗示ZmMGT10可能介導(dǎo)了低鎂條件下根對Mg2+的吸收。

2.5 轉(zhuǎn)ZmMGT10基因擬南芥對Mg2+的吸收分析

為了進(jìn)一步探索轉(zhuǎn)基因擬南芥在低鎂條件下比野生型擬南芥積累更多的Mg2+是否與其在低鎂條件下有更強(qiáng)的Mg2+吸收有關(guān)，野生型和轉(zhuǎn)基因株系#1的T1幼苗被用于時(shí)間依賴的和濃度依賴的Mg2+吸收試驗(yàn)。時(shí)間依賴的Mg2+吸收分析結(jié)果顯示，在2.00 mmol/L Mg2+生長條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株具有相似的Mg2+積累模式，而在0.01 mmol/L Mg2+條件下，野生型和轉(zhuǎn)基因植株Mg2+積累量(以干質(zhì)量計(jì))均明顯低于2.00 mmol/L條件下植株的Mg2+積累量，但轉(zhuǎn)基因植株的Mg2+積累量明顯高于野生型植株，表明過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了低鎂條件下擬南芥根對Mg2+的吸收(圖6-A)。濃度依賴的Mg2+吸收分析結(jié)果顯示，在高鎂濃度條件下，2種材料的Mg2+吸收率(以干質(zhì)量計(jì))無明顯差異，但在低鎂條件下，轉(zhuǎn)基因植株的Mg2+吸收率明顯高于野生型植株，表明ZmMGT10是在低鎂濃度下介導(dǎo)植物根對Mg2+的吸收(圖6-B)。這些結(jié)果表明，過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗是由于ZmMGT10介導(dǎo)了低鎂條件下轉(zhuǎn)基因植株根對Mg2+的吸收。

圖5 不同Mg2+濃度處理下野生型和轉(zhuǎn)基因植株根(A)和梢(B)中的Mg2+含量Fig.5 Mg2+ contents in roots (A) or shoots (B) of the wild type and transgenic plants under different concentration Mg2+ treatments

圖6 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株時(shí)間依賴和Mg2+濃度依賴的Mg2+吸收Fig.6 Time-dependent and concentration-dependent Mg2+ uptake in the roots of wild-type and transgenic plants

3 討論

鎂除了作為葉綠素的重要組成成分外，還是眾多酶的激活劑，參與了植株多個(gè)重要的生理代謝過程。植物鎂缺乏將會(huì)影響其正常生長發(fā)育，并最終影響產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，提高植物對低鎂環(huán)境中鎂的充分吸收利用，將會(huì)增強(qiáng)植物對低鎂脅迫的抵抗。

研究已經(jīng)表明，植物中存在著高親和和低親和2種鎂離子吸收系統(tǒng)[13，22-27]。在水稻和玉米中利用MRS2/MGT蛋白活性抑制劑三氯化六氨合鈷(Co-Hex)發(fā)現(xiàn)，MRS2/MGT-型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)了水稻和玉米根對Mg2+高親和和低親和吸收[13，27]。在擬南芥中的研究已證明，2個(gè)CorA/MRS2/MGT家族基因AtMGT6和AtMGT7具有抵抗低鎂脅迫的能力，是擬南芥在低鎂環(huán)境下正常生長所必需的[16-18]。AtMGT6編碼蛋白定位于質(zhì)膜上，其主要是通過介導(dǎo)低鎂脅迫下根對Mg2+的吸收來增強(qiáng)擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗[17]。AtMGT7編碼蛋白定位于內(nèi)膜系統(tǒng)上，其可能是通過調(diào)控低鎂條件下鎂離子在根細(xì)胞中的分布來抵抗低鎂脅迫[16]。前面的研究發(fā)現(xiàn)，玉米ZmMGT10基因是擬南芥AtMGT6基因的同源基因，其在根中特異性表達(dá)且表達(dá)受缺鎂脅迫誘導(dǎo)，暗示其可能也具有抵抗低鎂脅迫的能力[13]。為了探討ZmMGT10是否具有增強(qiáng)植物對低鎂脅迫抵抗能力，筆者在擬南芥中對其進(jìn)行了過表達(dá)分析。在Mg充足條件下，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株生長均受到明顯抑制，但野生型植物受到的抑制強(qiáng)于轉(zhuǎn)基因植株且野生型植株出現(xiàn)了中齡葉缺鎂黃化癥狀，這與煙草中鎂缺乏表型相似[15]；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，低鎂條件下轉(zhuǎn)基因植株的根長、生物量、葉綠素濃度、根和梢中的Mg2+積累量均明顯高于野生型植株，表明在擬南芥中過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對低鎂脅迫的抵抗力。前面在鼠寒沙門氏菌Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷突變體MM281中的研究表明，ZmMGT10具有Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力[13]，暗示過表達(dá)ZmMGT10增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對低鎂脅迫的抵抗可能與轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的Mg2+吸收能力有關(guān)。時(shí)間依賴的和濃度依賴的Mg2+吸收分析發(fā)現(xiàn)，在低鎂條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的確比野生型植株具有更高的Mg2+吸收率。這些結(jié)果表明，ZmMGT10基因與擬南芥同AtMGT6基因一樣，是通過介導(dǎo)低鎂條件下根對Mg2+的吸收來增強(qiáng)植物對低鎂脅迫的抵抗。

綜上所述，過表達(dá)玉米ZmMGT10基因增強(qiáng)了低鎂條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株根對Mg2+的吸收，進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對低鎂脅迫的抵抗。

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