水稻耐鹽性QTL的meta分析及候選基因發(fā)掘

雷 蕾，鄭洪亮，楊洛淼，趙宏偉，王敬國，劉化龍，孫 健，鄒德堂

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 水稻研究所，黑龍江 哈爾濱 150030)

鹽脅迫是影響農(nóng)作物生長最重要的非生物脅迫[1]，隨著全球變暖的到來，鹽漬土的問題日趨嚴(yán)重，近些年來，由于化學(xué)肥料的施用和不合理的灌溉措施，更是快速加大了土壤鹽漬化的進(jìn)度[2]，水稻是全世界重要的糧食作物，但由于栽培措施不合理導(dǎo)致的土壤鹽漬化已經(jīng)嚴(yán)重制約了水稻生產(chǎn)[3]，在全球，大約30%的水稻種植區(qū)面臨鹽脅迫[4]，且水稻的不同生長時期均有鹽脅迫的發(fā)生，然而水稻耐鹽機(jī)制尚未明確，因此很難開展耐鹽水稻品種的研究[5]。

QTL分析是探索性狀遺傳機(jī)理的重要環(huán)節(jié)，在水稻耐鹽QTL研究中，前人針對水稻不同生長時期做了大量報道[2，5-10]，且基于初定位的QTL由于群體類型和大小存在區(qū)別，產(chǎn)生了不同的遺傳效應(yīng)，這些初步的研究很難將QTL與候選基因關(guān)聯(lián)在一起，因為多數(shù)QTL的遺傳距離很大，置信區(qū)間里包含了數(shù)以千計的基因[11]，因此需要通過比較不同QTL，篩選出置信區(qū)間小且遺傳效應(yīng)高的一致性QTL。元分析能夠把來自不同研究的QTL信息聯(lián)系到一起，通過整合QTL信息和建模，達(dá)到優(yōu)化QTL置信區(qū)間的目的，從而揭示不同性狀間的遺傳關(guān)系[12]。因此，近年來，棉花[13]、黑麥草[14]、玉米[15]、花生[16]和小麥[17]等作物均利用元分析對不同性狀展開了研究，在水稻方面，前人利用元分析對產(chǎn)量性狀[18]、干旱脅迫[19]相關(guān)的QTL作了報道，將控制性狀遺傳的位點進(jìn)行了優(yōu)化。然而利用元分析在水稻耐鹽性QTL方面的研究尚未見報道。

因此，本研究收集了來自24個不同作圖群體共344個在鹽脅迫下鑒定的不同性狀的QTL，利用McCouch Lab 2002、Cornell SSR 2001、Cornell IR64 × Azu DH QTL 2001、MU CT9993 × IR6226 QTL 2004、KRGRP 1998和IGCN 1998共6個圖譜的整合圖譜作為公共圖譜，通過元分析獲得一致性QTL，對區(qū)間小且具有多效性的一致性QTL，進(jìn)行區(qū)間候選基因預(yù)測及功能分析，并對水稻基因數(shù)據(jù)庫中的耐鹽基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，找到水稻耐鹽功能候選基因，為水稻耐鹽候選基因的發(fā)掘和分子標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL的收集

已報道的水稻耐鹽性QTL從中國知網(wǎng)(http：//epub.cnki.net/kns/default.htm)和NBCI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)網(wǎng)站上收集和水稻耐鹽性QTL研究的報道，統(tǒng)計QTL位置、置信區(qū)間、貢獻(xiàn)率、加性效應(yīng)、LOD值和連鎖標(biāo)記等信息。從Gramene網(wǎng)站下載6個水稻遺傳圖譜。

1.2 水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL的信息整合及元分析

對收集的QTL信息按照BioMercator V4.2所需格式存為工作表，然后編輯為xlm格式的文件，文件包括圖譜信息和QTL信息兩方面。通過Genetic data loading將QTL所帶圖譜和6個參考圖譜分別導(dǎo)入BioMercator V4.2，首先利用InforMap和ConsMap計算模塊將6個圖譜整合到一起，作為用于映射的圖譜，再將QTL圖譜和公共圖譜進(jìn)行整合，得到一致性圖譜。然后利用QTL meta-analyses模塊進(jìn)行一致性QTL的挖掘，其原理為N個獨立存在的與一個性狀相關(guān)并且位于同一染色體同一位點附近的QTL計算出一個Meta-QTL。BioMercator V4.2軟件對Meta-QTL的分析給出了5個模型的結(jié)果，每一個模型都按照最大似然函數(shù)比的方法通過高斯定理給出在染色體上最可能排列的位置和置信區(qū)間，由AIC最小值給出最優(yōu)QTL模型即Meta-QTL[20]。

1.3 水稻耐鹽性一致性QTL區(qū)間的物理定位及候選基因Gene ontology(GO)分析

利用http：//rice.plantbiology.msu.edu/網(wǎng)站中的下載工具，下載基因組注釋數(shù)據(jù)，將水稻物理圖譜的序列信息與連鎖圖譜的標(biāo)記信息進(jìn)行整合，將一致性QTL兩端的標(biāo)記區(qū)間進(jìn)行物理定位，同時下載一致性QTL區(qū)間的所有候選基因，利用WEGO(http：//wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)在線分析軟件進(jìn)行Gene ontology 分析[21]。以了解水稻耐鹽QTL區(qū)間所包含的生物學(xué)功能。

1.4 水稻耐鹽性一致性QTL區(qū)間候選基因發(fā)掘

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫GRAMENE中查找在一致性QTL區(qū)間內(nèi)已克隆的水稻和玉米耐鹽基因，在NCBI上下載這些基因的蛋白質(zhì)序列，并對其進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，從而在一致性QTL區(qū)間內(nèi)發(fā)掘水稻耐鹽相關(guān)候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻耐鹽性QTL信息收集

通過中國知網(wǎng)(http：//epub.cnki.net/kns/default.htm)和NBCI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)網(wǎng)站，共收集和水稻耐鹽性QTL研究的報道18篇，共包含24張圖譜，所用群體包括回交群體，重組自交系群體和F2群體等，計344個QTL。這些QTL涉及性狀包括鈉離子鉀離子含量、死葉率、死苗率、苗存活天數(shù)、鹽害級別、根苗性狀及產(chǎn)量構(gòu)成性狀等方面(表1)，6張水稻遺傳公共圖譜分別為McCouch Lab 2002[22]、Cornell SSR 2001[23]、Cornell IR64 × Azu DH QTL 2001[24]、MU CT9993 × IR6226 QTL 2004[25]、KRGRP 1998[26]和IGCN 1998[27]。

表1 水稻耐鹽性QTL信息整合Tab.1 Summary of the QTL of salt tolerance in rice reported previously

2.2 水稻耐鹽性QTL信息的圖譜整合

通過對6張公共圖譜進(jìn)行整合，共有7 230個標(biāo)記被整合到12條染色體上，對收集到的344個QTL進(jìn)行映射，共有236個QTL被映射到水稻的12條染色體上(圖1)，各條染色體上QTL數(shù)分別為10，32，16，20，16，39，23，15，14，17，25，9個(表2)。

水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL在圖譜上存在成簇分布現(xiàn)象，如表2示，QTL數(shù)大于5個的Mqtl共有19個。在2號染色體的C2939～R2344、RM7288～RM145和R3041～RM240區(qū)間分別有8，16，7個QTL，3號染色體的OSR13～RM6496和C816～RM570區(qū)間分別富集了6，7個QTL，第4號染色體的R2373～RM335和C513～S12448區(qū)間分別集中了8，6個QTL，5號染色體的S12447～RM122區(qū)間包含5個QTL，6號染色體上的C916B～RM225、R2123～RM4924和RM3330～RM7179區(qū)間包含的QTL數(shù)分別為9，11，16個，7號染色體上的4個富集區(qū)包含的QTL數(shù)分別為6，5，5，7個，與之相連鎖的區(qū)間為RM129～RG128、RM501～RM3859、RM11～RM5380、C451～RM560，8號染色體的RM8081～RM3572和RM4955～RM8271區(qū)間分別集中了5，7個QTL，10號染色體的RM5620～RM258區(qū)間和11號染色體的P97～RG211區(qū)間分別富集了8，16個QTL。這些QTL重疊群多數(shù)由水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL組成。

2.3 水稻耐鹽性QTL信息元分析

利用BioMercator V4.2中的QTL meta-analyses程序?qū)φ系?36個QTL進(jìn)行元分析，以每次運算后AIC最小值為原則，最終得到46個一致性QTL。

被映射到水稻的12條染色體上的236個QTL包含在46個Mqtl中，其中初始QTL數(shù)大于3個的Mqtl共有39個，除了8號和12號染色體上均有3個Mqtl外，其余染色體上均有4個Mqtl，這些Mqtl的平均置信區(qū)間為2.21 cM。

在所有Mqtl中，發(fā)現(xiàn)了置信區(qū)間較小且包含多個性狀的Mqtl。其中，位于1號染色體RM1232～RM104區(qū)間的0.67 cM遺傳距離里，Mqtl1-2包含4個QTL，跟幼苗存活天數(shù)、苗高及穗長有關(guān)；Mqtl2-2和Mqtl2-3的置信區(qū)間分別為0.47，0.41 cM，分別和4，9個性狀相關(guān)，包括鈉鉀離子濃度、鹽害級別等性狀；Mqtl4-2和Mqtl4-3位于P158～RM261和C513～S12448區(qū)間里，遺傳距離分別為0.46，0.54 cM，另外，Mqtl6-3、Mqtl6-4、Mqtl7-3、Mqtl7-4和Mqtl10-4的置信區(qū)間均小于0.1 cM，與之相連鎖的區(qū)間分別為R2123～RM4924、RM3330～RM7179、RM11～RM5380、C451～RM560和RM6469～RM6132。在46個Mqtl中，有37個Mqtl的遺傳距離比初始QTL中置信區(qū)間最小的還小，說明元分析縮小了原始QTL的區(qū)間距離。

圖1 水稻耐鹽相關(guān)性狀QTL元分析Fig.1 meta-analysis of QTL related to salt tolerance traits in rice

注：CI.置信區(qū)間；PD.物理距離；LI.連鎖區(qū)間；MCI.平均置信區(qū)間；DTF.開花日期；SF.小穗育性；GY.谷物產(chǎn)量；RL.根長；DRW.根干質(zhì)量；RKC.根部K+濃度；RN.根數(shù)；SKC.莖部K+濃度；DSW.桿干質(zhì)量；SSNP.單株不育穗數(shù)；SNP.單株穗數(shù)；SUR.苗存活率；SDS.苗存活天數(shù)；SH.苗高；STS.鹽害級別；NA/K.鈉鉀比；NA.鈉離子；TGW.千粒質(zhì)量；DSR.死苗率；DLR.死葉率；PL.穗長；PN.穗數(shù)；IR.吸收速率；RRL.相對根長；RRN.相對根數(shù)；RSH.相對苗高；CHL.葉綠素含量；CILV.營養(yǎng)生長期葉片Cl-含量；CILR.生殖期葉片Cl-含量。

Note：CI.Confidence interval；PD.Physical distance；LI.Linkage interval；MCI.Mean of confidence interval.DTF.Days to flowering；SF. Spikelet fertility；GY.Grain yield；RL.Root length；DRW.Dry root weight；RKC.Root K+concentration；RN.Root number；SKC.Shoot K+concentration；DSW.Dry steam weight；SSNP.Number of sterile spikelets per plant；SNP.Number of spikelets per plant；SUR.Seedling survival；SDS.Survival days of seedlings；SH.Seedling height；STS.Score of salt toxicity；NA/K.Na+/K+ratio；NA.Na+；TGW.Thousand grains weight；DSR.Dead seedling rate；DLR.The dead leaf rate；PL.Panicle length；PN.Panicle number；IR.Imbibition rate；RRL.Relative root length；RRN.Relative root number；RSH.Relative seedling height；CHL.Leaf chlorophyll content；CILV.Cl-in leaf for vegetative；CILR.Cl-in leaf for reproductive.

2.4 水稻耐鹽性一致性QTL區(qū)間的物理定位及候選基因Gene Ontology(GO)分析

對46個一致性QTL兩端標(biāo)記在水稻物理圖譜RIGSP2005上的位置進(jìn)行物理定位，結(jié)果表明，這46個一致性QTL的平均物理距離為4.41 Mb，其中物理距離小于1 Mb有13個(表2)，這13個一致性QTL中，有8個遺傳距離在0.5 cM附近(表3)，且富集多個QTL。這8個一致性QTL范圍內(nèi)共包含1 489個預(yù)測基因，Mqtl12-1區(qū)間基因數(shù)最多(724個)，Mqtl10-4區(qū)間內(nèi)基因數(shù)最少(22個)，其中Mqtl7-4在染色體上的覆蓋范圍最大(0.763 Mb)，Mqtl4-3的覆蓋范圍最小(0.033 Mb)。

利用Wego在線分析軟件對8個一致性QTL區(qū)間的1 489個預(yù)測基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果表明，有364個基因參與了細(xì)胞組成成分(圖2-A)，470個基因參與了分子功能(圖2-B)，669個基因參與了生物進(jìn)程(圖2-C)，分別涉及19種細(xì)胞成分、16種分子功能和21種生物進(jìn)程。其中在細(xì)胞組成成分中，細(xì)胞、細(xì)胞合成成分、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞膜、原生質(zhì)膜和質(zhì)體所占比例較大，在分子功能中，結(jié)合物、催化活性、水解酶活性、分子功能和蛋白結(jié)合相關(guān)的基因所占比例較大，生物進(jìn)程中，生物學(xué)過程、細(xì)胞形成和新陳代謝所占比例較大。其中有18個被注釋為與非生物脅迫相關(guān)的基因。這些基因分別與脂氧合酶(LOC_Os02g10120)、玉米黃素環(huán)氧酶(LOC_Os04g37619)、Dof基因家族轉(zhuǎn)錄因子(LOC_Os07g32510)、熱激蛋白區(qū)域(LOC_Os07g33350)、谷氨酸受體(LOC_Os07g33790)、載體家族蛋白(LOC_Os07g33910)、多肽轉(zhuǎn)運蛋白(LOC_Os10g33210)、花粉發(fā)育調(diào)控(LOC_Os10g33250)等功能相關(guān)。

2.5 水稻耐鹽性一致性QTL區(qū)間候選基因發(fā)掘

通過GRAMENE數(shù)據(jù)庫查找，共有39個耐鹽性基因包含在一致性QTL區(qū)間中，同源比對后共發(fā)現(xiàn)9個和水稻耐鹽相關(guān)的候選基因(表4)，涉及BZIP轉(zhuǎn)錄因子、水解酶、鋅指蛋白、DNA結(jié)構(gòu)域、蛋白激酶等功能。其中Mqtl1-2區(qū)間內(nèi)基因OsABI5和GRMZM2G138861在該區(qū)段內(nèi)與OS01G0813100和OS01G0869900同源，序列相似度分別為79.2%和76.1%，Mqtl2-4區(qū)間內(nèi)的OsTPP1基因在該區(qū)段內(nèi)與OS02G0753000同源，序列相似度為67.3%，3號染色體的Mqtl3-3和Mqtl3-4上的rcn1和DST基因分別與對應(yīng)區(qū)段內(nèi)同源的基因是OS03G0282100和OS03G0607700，相似度分別為71.1%和70.00%，Mqtl7-1區(qū)間的OsCIPK23與OS07G0150500同源，序列完全相同，Mqtl9-2區(qū)間的OsDREB6和OsEATB分別與OS09G0369050和OS09G0434500同源，序列匹配度為100.0%和72.5%，Mqtl9-3區(qū)間內(nèi)的OsDREB1B與OS09G0522100同源，序列匹配度為85.0%。

表3 Mqtl區(qū)間的物理圖譜定位Tab.3 The Mqtl region on rice physical map of IRGSP2005

圖2 一致性QTL區(qū)間候選基因GO分析Fig.2 Gene Ontology analysis of genes related to consensus QTL

一致性QTL基因預(yù)測基因序列同源比例/%E-vauleMqtlGeneGeneIDfromgrameneConservedproportionMqtl1-2OsABI5[38]OS01G081310079.23.40E-15GRMZM2G138861[39]OS01G086990076.13.60E-56Mqtl2-4OsTPP1[40]OS02G075300067.32.60E-41Mqtl3-3rcn1[41]OS03G028210071.11.10E-112Mqtl3-4DST[42]OS03G060770070.06.00E-09Mqtl7-1OsCIPK23[43]OS07G0150500100.00Mqtl9-2OsDREB6[44]OS09G0369050100.02.10E-19OsEATB[45]OS09G043450072.55.10E-13Mqtl9-3OsDREB1B[46]OS09G052210085.01.50E-06

3 討論與結(jié)論

利用現(xiàn)存的生物信息學(xué)工具可以獲得任何QTL區(qū)間內(nèi)的基因[47]，研究利用的公共遺傳圖譜具有7 230個分子標(biāo)記，它提供了豐富的圖譜標(biāo)記，對水稻耐鹽相關(guān)性狀的344個QTL進(jìn)行整理，共有236個被整合到水稻6個遺傳公共圖譜上，12條染色體上均有分布，可見水稻耐鹽性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制。Swamy等[18]對水稻產(chǎn)量性狀進(jìn)行了元分析，將產(chǎn)量性狀QTL最小界定到500 kb以內(nèi)，Khowaja等[48]對水稻耐旱性QTL進(jìn)行了元分析，在一致性QTL區(qū)間找到了180個候選基因，Mideros等[49]對玉米霉菌毒素的QTL元分析后發(fā)現(xiàn)了一個貢獻(xiàn)率較大的一致性QTL，這些研究為MAS提供了很好參考。本研究中，在檢測到的一致性QTL中，有19個區(qū)間的QTL數(shù)大于5個，存在成簇分布現(xiàn)象，且有37個Mqtl的遺傳距離比初始QTL中置信區(qū)間最小的還小，說明元分析縮小了原始QTL的區(qū)間距離。檢測到的46個一致性QTL的平均物理距離為4.41 Mb，其中物理距離小于1 Mb有13個，這13個一致性QTL中，有8個的遺傳距離在0.5 cM附近，且富集多個QTL。這8個一致性QTL范圍內(nèi)共包含1 489個預(yù)測基因，其中Mqtl10-4區(qū)間內(nèi)基因數(shù)最少(22個)，Mqtl4-3的覆蓋范圍最小(0.033 Mb)。GO分析發(fā)現(xiàn)，在1 489個預(yù)測基因中，絕大多數(shù)參與了細(xì)胞合成、結(jié)合功能、催化活性、水解酶活性、分子作用和蛋白結(jié)合相關(guān)生物過程，并找到了18個與非生物脅迫相關(guān)的基因，可能與鹽脅迫表達(dá)相關(guān)聯(lián)。可見利用高密度的遺傳圖譜進(jìn)行QTL整合及元分析能高效的將控制性狀表達(dá)的QTL精細(xì)化，并預(yù)測區(qū)段內(nèi)基因的功能，是開展水稻耐鹽MAS和基因克隆的有效途徑之一。

為了分析一致性QTL區(qū)間內(nèi)和耐鹽基因蛋白序列相同或相似的預(yù)測基因，對46個一致性QTL區(qū)間內(nèi)的39個與鹽脅迫相關(guān)的基因進(jìn)行了蛋白序列比對，共有8個水稻耐鹽基因找到了預(yù)測基因，另外，由于禾本科作物的基因組存在高度的保守性，所以某一作物的QTL或基因信息可以用于其他作物[50]，因此，本研究對玉米耐鹽基因進(jìn)行了同源比對，在Mqtl1-2區(qū)間僅發(fā)掘了1個與GRMZM2G138861同源的水稻耐鹽預(yù)測基因，可能是由于玉米基因組比水稻要大，遺傳轉(zhuǎn)化沒有水稻研究成熟，導(dǎo)致玉米耐鹽基因研究緩慢。這9個預(yù)測基因和與之對應(yīng)的耐鹽基因具有高度的蛋白序列相似性，且保守結(jié)構(gòu)域高度一致，可用于開展候選基因驗證，利用qRT-PCR技術(shù)確定候選基因表達(dá)模式，并在關(guān)聯(lián)群體中對性狀進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步克隆水稻耐鹽基因奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)了5個遺傳距離小于0.1 cM，且具有多效性的Mqtl，兩端的分子標(biāo)記可用于分子標(biāo)記輔助育種。在發(fā)現(xiàn)的8個物理距離在0.5 Mb附近的Mqtl中，找到了9個和水稻耐鹽基因具有高度蛋白序列的相似性的注釋基因，作為水稻耐鹽的候選基因。分別為OS01G0813100、OS01G0869900、OS02G0753000、OS03G0282100、OS03G0607700、OS07G0150500、OS09G0369050、OS09G0434500和OS09G0522100。

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