棉花過表達(dá)超氧化物歧化酶基因?qū)χ仓昴望}性的影響

胡根海，張曉紅，付遠(yuǎn)志，董 娜，王清連

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

1 材料和方法

1.1 棉花胞質(zhì)Cu/Zn SOD基因的克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)筆者克隆的棉花胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因的ORF(GenBank注冊(cè)號(hào)：DQ445093)，利用基因的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物，在起始密碼子ATG前增加BamHⅠ位點(diǎn)，在終止密碼子UAG處增加SacⅠ位點(diǎn)，上游，5′-GTCGCGGATCCATGGTGAAGGCCGTTGCCG-3，下游：5′-GCGACGAGCTCCAGACCAATAATACCGCAAG-3′；擴(kuò)增上述基因得到約480 bp長(zhǎng)的基因片段，片段回收后進(jìn)行 pUCm-T連接后，轉(zhuǎn)化JM109，獲得的陽性克隆經(jīng)測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)驗(yàn)證無誤后進(jìn)行BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切，回收目的基因編碼框DNA，與相同限制性內(nèi)切酶消化表達(dá)載體pCAMGBIA2300回收的大片段連接，構(gòu)建融合 pCAMGBIA-SOD目的基因的表達(dá)載體。

1.2 陸地棉遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花腋芽遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(ZL20130634992.9)，利用 pCAMGBIA-SOD表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌LBA4404，潮霉素篩選獲得陽性克隆。挑取陽性克隆菌落在28 ℃下于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.4，配制浸染液對(duì)2片子葉張開真葉沒有出現(xiàn)的苗進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。新芽再生后，以非轉(zhuǎn)基因材料為對(duì)照，對(duì)葉片進(jìn)行潮霉素涂抹驗(yàn)證，獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.3 轉(zhuǎn)基因系PCR鑒定和Southern Blotting分析

采用CTAB法提取對(duì)照和轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片DNA。采用特異引物擴(kuò)增潮霉素基因的方法對(duì)轉(zhuǎn)化材料進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游引物：5′-CGCGGATCCATGAAAAAGCCTGAA-3′，下游引物：5′-CCCAAGCTTTCTATTTCTTTGCCCTC-3′，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性3 min 1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸1 min 20 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存結(jié)束。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)。提取陰性對(duì)照及轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，BamHⅠ和SacⅠ雙酶切基因組DNA序列后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后轉(zhuǎn)至尼龍膜上，用DIG 探針合成試劑盒( Roche 公司) 標(biāo)記上述擴(kuò)增到潮霉素基因序列DNA，以標(biāo)記潮霉素基因?yàn)樘结槪凑赵噭┖忻枋龅牟襟E進(jìn)行Southern 雜交，檢測(cè)尼龍膜上的基因組酶切產(chǎn)物。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)分析和生理指標(biāo)測(cè)定

收獲T0轉(zhuǎn)基因陽性植株的種子，采用毛巾卷法[12]，在150 mmol/L NaCl溶液中做發(fā)芽期耐鹽性比較試驗(yàn)[13]，在種子發(fā)芽后第7天測(cè)定棉苗芽長(zhǎng)、主根長(zhǎng)度和側(cè)根數(shù)量；取轉(zhuǎn)基因植株及其對(duì)照葉片，采用NBT光下還原法測(cè)定SOD活性[14]，以抑制光反應(yīng)50%為一個(gè)酶活力單位，酶活力單位為U/g。采用磺基水楊酸提取茚三酮顯色法測(cè)定脯氨酸(Pro)含量[14]，采用硫酸蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[14]，采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[14]。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

以His3作為棉花內(nèi)參基因，利用ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500型)擴(kuò)增分析，反應(yīng)體系含2.0 μL 10×PCR Buffer、0.5 μL 10 mmol/L dNTP Mix、1.0 μL cDNA 第一鏈模板、10 μmol/L引物各0.5 μL (內(nèi)標(biāo)引物序列His3F：5′-CGGTGGTGTAAGAAGCCTCAT-3′，His3R：5′-AATTTCACGAACAAGCCTCTGGAA-3′；qRT-PCR分析引物：GhsodF：5′-GATGGAGAAAGAGGGA

CT-3′，GhsodR：10 μL 2×SYBR (Roche)溶液和0.1 μL高保真Taq酶(5 U/μL)，加無菌超純水至20 μL反應(yīng)組分。擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min；94 ℃30 s，50～52 ℃30 s，72 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，以熔解曲線結(jié)束。采用2-ΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析[15]，計(jì)算公式如下，目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCt；ΔCt=Ct目的基因-CtHis 3。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因的載體構(gòu)建

在棉花胞質(zhì)Cu/Zn-SOD的起始密碼子和終止子的位置設(shè)計(jì)了特異引物，按照表達(dá)載體引物設(shè)計(jì)要求在起始密碼子和終止子堿基前增加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，以確保酶切成功并保證裝入表達(dá)載體后基因不會(huì)移碼突變，由于起始密碼子和終止子處所用酶切位點(diǎn)不同，保證了載體構(gòu)建過程的基因方向性。重組載體經(jīng)提取質(zhì)粒后，以提取質(zhì)粒為模板，利用特異引物擴(kuò)增得到了480 bp的基因片段，測(cè)序驗(yàn)證序列正確，沒有發(fā)生變異(圖1)。證明已經(jīng)構(gòu)建了含有目的基因pCAMGBIA-SOD的表達(dá)載體。

1.標(biāo)準(zhǔn)分子量；2.載體擴(kuò)增檢驗(yàn)。1.The molecular weight of the standard；2.Test of carrier amplification.

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其PCR驗(yàn)證

使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花腋芽遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)處理100株，待T0長(zhǎng)出新葉使用200 mg/L的潮霉素溶液涂抹T0植株葉片，5 d后產(chǎn)生燒灼斑的為陰性未轉(zhuǎn)化成功植株，未有燒灼斑的為陽性轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)潮霉素抗性篩選共獲得25株遺傳轉(zhuǎn)化植株。隨機(jī)選8株轉(zhuǎn)基因陽性材料的葉片為材料，提取DNA，利用潮霉素特異引物擴(kuò)增8株材料均得到大約500 bp條帶，該條帶大小與預(yù)期潮霉素的基因片段相近，證明所得材料均為含有目的轉(zhuǎn)化基因的植株(圖2)，報(bào)告基因潮霉素基因已經(jīng)進(jìn)入轉(zhuǎn)化材料，間接證明胞質(zhì)Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)入棉花植株。

M.標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.陰性植株；2.重組質(zhì)粒；3.蒸餾水；4～11.轉(zhuǎn)基因陽性植株。M.The molecular weight of the standard；1.The negative plants；2.Recombinant plasmid；3.Distilled water；4-11.Positive transgenic plants.

為進(jìn)一步闡明轉(zhuǎn)入的基因是否整合到棉花基因組，對(duì)PCR驗(yàn)證呈陽性的材料進(jìn)行Southern Blotting檢測(cè)，圖3是8份轉(zhuǎn)基因棉花植株總DNA的Southern Blotting分析結(jié)果，將提取的棉花基因組DNA 經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，以潮霉素抗性基因編碼區(qū)的DNA片段為探針進(jìn)行Southern Blotting，轉(zhuǎn)基因株系都能檢測(cè)到潮霉素抗性基因的存在，說明在轉(zhuǎn)基因棉花植株中目標(biāo)已經(jīng)整合到受體基因組中。

1.陰性對(duì)照；2～9.轉(zhuǎn)基因陽性植株。1.Negative control；2-9.Transgenic lines.

2.3 NaCl脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)的影響

在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料耐鹽性發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定材料芽長(zhǎng)，結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧掀骄块L(zhǎng)2.63 cm，轉(zhuǎn)基因材料平均芽長(zhǎng)4.58 cm；轉(zhuǎn)基因主根長(zhǎng)度平均6.85 cm，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄?.56 cm；側(cè)根數(shù)量轉(zhuǎn)基因材料平均7.23個(gè)/株，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌骄?.21個(gè)/株。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料與其未轉(zhuǎn)基因?qū)φ毡容^，在相同鹽脅迫濃度下，轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強(qiáng)，證明Cu/Zn-SOD在T1苗期得到表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)比較分析

在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ辗N子耐鹽性萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，測(cè)定植株葉片的SOD活性結(jié)果顯示，在非脅迫情況下，轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性達(dá)到顯著差異(P<0.05)，非轉(zhuǎn)基因材料均值為756 U/g ，而轉(zhuǎn)基因材料均值為1 014 U/g 。這說明轉(zhuǎn)基因材料的SOD活性因新拷貝增加而表達(dá)量明顯增加；鹽脅迫下非轉(zhuǎn)基因材料SOD活性均值為914 U/g ，轉(zhuǎn)基因材料為2 215 U/g ，表明非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因材料在逆境誘導(dǎo)下，SOD都被誘導(dǎo)表達(dá)，但轉(zhuǎn)基因材料的表達(dá)量更高(圖4)。葉綠素含量的觀測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照棉苗的葉片嚴(yán)重失綠，逆境脅迫下總?cè)~綠素含量?jī)H為0.81 mg/g 。轉(zhuǎn)基因棉苗株系的葉片顏色基本正常，總?cè)~綠素含量均值為4.56 mg/g 比對(duì)照高出5.6倍(圖5)；MDA是植物體產(chǎn)生的主要的膜脂過氧化產(chǎn)物之一，能夠與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，從而引起酶和膜的嚴(yán)重?fù)p傷，其含量基本反映了植物遭受脅迫的程度。測(cè)定轉(zhuǎn)基因和對(duì)照的MDA結(jié)果顯示：在清水對(duì)照下，轉(zhuǎn)基因材料MDA含量略低于對(duì)照，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因材料具有較低MDA含量(圖6)，說明轉(zhuǎn)基因材料具有更強(qiáng)清除質(zhì)膜過氧化物的能力。Pro含量變化反映了植物受脅迫后的滲透調(diào)節(jié)能力，從圖7可以推知，轉(zhuǎn)基因和對(duì)照材料之間在清水處理中幾乎沒有差異，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因材料的Pro含量略低，這可能是因轉(zhuǎn)基因SOD活性增強(qiáng)，導(dǎo)致鹽脅迫危害減輕所致。

圖4 轉(zhuǎn)基因?qū)OD活性的影響 Fig.4 Genetically modified on the activity of superoxide dismutase

圖5 轉(zhuǎn)基因?qū)γ廾缛~片葉綠素含量的影響Fig.5 Genetically modified on the chlorophyll content

圖6 轉(zhuǎn)基因?qū)γ廾缛~片MDA含量的影響Fig.6 Genetically modified on the MDA content

2.5 轉(zhuǎn)基因植株中Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)

利用qRT-PCR定量分析8株陽性轉(zhuǎn)基因棉花和陰性對(duì)照苗中Cu/Zn-SOD的表達(dá)水平，結(jié)果表明，Cu/Zn-SOD基因在轉(zhuǎn)基因苗葉片中表達(dá)水平較高，是非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照的2.5～3.1倍，轉(zhuǎn)基因苗的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)均高于陰性非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?圖8)，因?yàn)樵囼?yàn)處理?xiàng)l件一致，因此，可以認(rèn)為轉(zhuǎn)基因材料Cu/Zn-SOD表達(dá)量增加是新轉(zhuǎn)入拷貝表達(dá)的結(jié)果。表明已經(jīng)得到超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因材料。

圖7 轉(zhuǎn)基因?qū)γ廾缛~片游離Pro含量的影響Fig.7 Genetically modified on the proline content

圖8 轉(zhuǎn)基因棉花植株中的Cu/Zn-SOD表達(dá)水平Fig.8 Expression level of Cu/Zn-SOD in transgenic cotton lines

3 結(jié)論與討論

已有研究顯示，植物在鹽堿、干旱、水澇等非生物逆境脅迫下，體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧類物質(zhì)對(duì)植物造成傷害；植物通過提高體內(nèi)抗氧保護(hù)酶SOD活性增強(qiáng)對(duì)多種氧化脅迫的抗性[16-21]。在其他作物中遺傳轉(zhuǎn)化SOD基因改良抗逆性的研究已有報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在玉米中超表達(dá)小麥Mn-SOD基因，轉(zhuǎn)基因植株抗氧化能力較未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照顯著增強(qiáng)[22]；用煙草Mn-SOD基因遺傳轉(zhuǎn)化玉米后，玉米葉片具有明顯增強(qiáng)的抗氧化能力[23]；擬南芥 Fe-SOD基因、番茄和豌豆Cu/Zn-SOD基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草植株抵御干旱逆境能力明顯提高[24]；張海娜等[25]在煙草中過量表達(dá)小麥SOD基因，煙草的抗鹽能力有明顯增強(qiáng)；馬淑娟等[11]將棉花葉綠體Cu/Zn-SOD基因?qū)霟煵荩冒俨菘萏幚磙D(zhuǎn)化材料，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)百草枯的耐性有所增強(qiáng)。陸燕元等[26]將Cu/Zn-SOD基因?qū)敫适砗螅适砀珊等棠托栽鰪?qiáng)，這些試驗(yàn)都證實(shí)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)可以增強(qiáng)植物的抗逆性。

本研究對(duì)棉花胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因進(jìn)行了表達(dá)載體構(gòu)建，獲得了過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株；因?yàn)槊藁ㄖ仓瓯旧砗邪|(zhì)Cu/Zn-SOD基因，轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證使用了載體報(bào)告基因潮霉素；利用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證準(zhǔn)確，沒有假陽性。潮霉素對(duì)T0的涂抹驗(yàn)證有效驗(yàn)證了遺傳轉(zhuǎn)化新基因的表達(dá)。若直接對(duì)Cu/Zn-SOD進(jìn)行Southern Blotting驗(yàn)證，理論上僅僅是基因拷貝數(shù)的差異，容易產(chǎn)生誤差，使用潮霉素基因探針雜交，有效避免了基因組原有基因的影響。轉(zhuǎn)基因T1耐鹽性發(fā)芽試驗(yàn)表明，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因材料的主根平均長(zhǎng)度、芽長(zhǎng)平均長(zhǎng)和側(cè)根平均數(shù)量均大于陰性對(duì)照；進(jìn)一步測(cè)定材料葉片的SOD活性顯示非脅迫下，轉(zhuǎn)基因材料高于陰性對(duì)照，說明新轉(zhuǎn)入的基因增加SOD基因的基礎(chǔ)表達(dá)量，在鹽脅迫誘導(dǎo)下，陰性對(duì)照比其非脅迫下SOD活性也有增加，但轉(zhuǎn)基因材料的酶活性增加倍數(shù)更多。進(jìn)一步分析抗逆相關(guān)生理指標(biāo)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量高于陰性對(duì)照，這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)化新拷貝基因的表達(dá)增加材料的抗氧化能力，使葉綠素更加穩(wěn)定；MDA是植物細(xì)胞膜過氧化產(chǎn)物的反映，MDA的含量降低說明轉(zhuǎn)基因材料與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因材料的抗氧化能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜被保護(hù)，表現(xiàn)MDA含量降低；Pro是逆境下滲透調(diào)節(jié)的形式，在清水處理時(shí)，因?yàn)闆]有外部脅迫，所以轉(zhuǎn)基因材料與陰性對(duì)照沒有差別，在脅迫處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因材料的Pro含量低于陰性對(duì)照，可能是轉(zhuǎn)基因材料的抗氧化能力強(qiáng)，導(dǎo)致植株內(nèi)部脅迫減輕，從而使?jié)B透調(diào)節(jié)減輕造成的。熒光定量顯示轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)Cu/Zn-SOD獲得組成性表達(dá)，但轉(zhuǎn)基因材料表達(dá)量存在差異，其詳細(xì)機(jī)制有待探討。

在棉花中過量表達(dá)胞質(zhì)Cu/Zn-SOD基因，能增加植株SOD活性，減輕鹽分脅迫造成的細(xì)胞膜質(zhì)過氧化，增強(qiáng)植株抵御鹽分脅迫的能力。

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