陸地棉GhSAD2基因表達載體的構建、轉化及抗寒性初步分析

蔡 曼，李衛華，柳延濤，余 渝，孔憲輝，王 娟，王旭文，劉 麗

(1.新疆農墾科學院 棉花研究所，農業部西北內陸區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，國家棉花改良中心新疆生產建設兵團分中心，新疆 石河子 832000；2.石河子大學，新疆兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆 石河子 832003；3.新疆農墾科學院 作物研究所，新疆 石河子 832000)

棉花是我國重要的纖維作物及經濟作物，在國民經濟中具有舉足輕重的戰略地位。新疆棉區是我國最大的棉花產區，但是由于新疆地區地理位置特殊，春季氣候多變，無霜期短，生長早期常有倒春寒，后期常有早霜等低溫冷害天氣。低溫不僅會降低棉花的產量，也會使棉花的品質變差，從而直接影響棉花種植的經濟效益。因此，研究棉花的抗寒機理，培育具有耐寒性的優質棉花具有重要的理論和現實意義。

Lyons的“膜脂相變” 學說[1]認為植物膜脂不飽和脂肪酸含量升高，膜脂相變溫度會相應降低，從而增加細胞膜的流動性，使植物的抗寒性有所提高。Levitt[2]、Palta等[3]以及Orvar等[4]研究指出，低溫對植物的傷害首先發生在植物細胞膜上，細胞膜的流動性和植物抗寒性密切相關，其穩定性對植物抵抗低溫脅迫具有重要的意義。而在低溫情況下，細胞膜上的磷脂雙分子層的不飽和性決定了細胞膜的穩定性。因此，細胞膜膜質的不飽和性對植物的抗寒性有著重大影響[5]。我國許多學者都做了不飽和脂肪酸含量與植物抗寒性關系的研究[6-10]。

近年來，隨著分子生物技術的發展，挖掘出了很多與脂肪酸含量相關的基因[11]，學者們通過改變目的基因的表達來提高不飽和脂肪酸的含量，從而達到提高植物抗寒性的目的[12-15]。Δ9-硬脂酰-ACP 脫氫酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)是不飽和脂肪酸合成代謝的關鍵酶[16]，直接決定植物油脂中的不飽和脂肪酸的總量，以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例[17-18]，對細胞膜在低溫環境下的穩定性起重要的作用[19]。因此，可以通過SAD基因的超量表達或反義表達等途徑來調控飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的合成定向改變植物種質，以調節植物體中脂肪酸的成分和含量，從而改善植物的抗寒性。研究表明，膜脂中不飽和脂肪酸的比例及含量與植物的抗寒性有著相當密切的關系[20-24]。Cheesbrough[25-26]研究發現，長在 20 ℃大豆的SAD基因活性比生長在 35 ℃大豆的SAD基因活性高5倍。Vega等[27]研究發現，低溫4 ℃下，馬鈴薯SAD基因轉錄水平比對照組(20 ℃)顯著升高，說明SAD基因的表達與馬鈴薯的低溫適應性有一定關系。Polashock和Ma等[28-29]分別將酵母的SAD基因和菠菜的SAD基因導入煙草，結果表明，轉基因煙草的抗寒性都有不同程度增強。Los[30]分別將正向和反向SAD基因插入植物雙元表達載體pBI121中，通過基因工程轉入模式植物煙草中，結果表明，轉正向表達SAD基因的轉基因煙草抗寒性明顯增強，反之轉反向表達SAD基因的轉基因煙草抗寒性明顯減弱。銀杏的GbSAD基因在4，15 ℃處理下該基因的水平穩步上升[31]。陸地棉GhSAD2基因在不同程度低溫處理下均有上調表達[32]。Liu等[33]在GenBank中注冊了陸地棉SAD基因的全長 cDNA 序列(X95988.1)，但關于棉花SAD基因在抗寒性相關方面的研究未見報道。

本研究克隆陸地棉GhSAD2基因，構建植物表達載體pBI121-GhSAD2，并將該表達載體通過葉盤法轉化煙草，通過測定轉基因陽性煙草的電解質滲透率及其表型性狀來探究GhSAD2基因在抗寒方面的作用，以期為提高棉花抗寒性提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 新陸早33號種子和煙草種子由新疆農墾科學院棉花所提供。

1.1.2 菌株和載體 大腸桿菌感受態細胞Trans1-T1購于北京全式金生物有限公司；克隆載體pMD19-T購于日本TaKaRa公司；根癌農桿菌GV3101、表達載體pBI121由新疆石河子大學綠洲生態實驗室提供。

1.1.3 試驗所用的試劑 一些工具酶、T4連接酶、Pfu高保真酶、用于標定的標準的DNA分子量、PCR所用的TaqDNA 聚合酶等均購自北京全式金生物技術有限公司；試驗中所用到的用來回收目的片段的膠回收試劑盒、用于提取菌液中質粒的質粒試劑盒等購于天根生化科技(北京)有限公司；試驗中所用到的用于雙酶切的XbaⅠ和SmaⅠ限制性內切酶、PrimerScriptTM RT Reagent Kit購自日本TaKaRa公司；蔗糖、MS購于Sigma公司。

1.1.4 引物合成及測序 試驗所有涉及的PCR引物的合成過程以及在克隆時基因的測序過程，都是由上海生工完成的。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料種植 挑選顆粒飽滿、顏色正常且沒有受損的新陸早33號種子播種在事先準備好的蛭石和營養土比例為3∶1的花盆中，于28 ℃(16 h/8 h)的光照培養箱中取2～3片真葉的棉花幼苗葉片，提取植物總RNA，用于基因克隆分析。

煙草無菌苗種植：選取籽粒飽滿、顏色正常的健康煙草種子放入1.5 mL的離心管中，用75%乙醇浸泡30 s，30% H2O2浸泡 10 min，浸泡過程中用移液槍反復吹打，隨后用無菌水沖洗5次，每次1 min，最后將種子用牙簽或1 mL移液槍均勻的點播于MS固體培養基，在 28 ℃(16 h/8 h)下培養5 d后，選取培養基中長勢良好的幼苗接種于1/2MS培養基中，選取生長20 d后的無菌煙草苗作為轉化植株。

1.2.2 棉花總RNA的提取和cDNA 的制備 采用CTAB法提取棉花葉片總RNA[34]。

1.2.3 棉花GhSAD2基因的克隆 從GenBank下載GhSAD2基因(KX197920)的序列，獲得了1個包含GhSAD2全長ORF的基因序列，根據其開放閱讀框序列設計克隆引物，分析GhSAD2基因和pBI121的酶切位點，根據分析結果，在每條引物上加入不同的酶切位點，用于構建表達載體。具體引物序列及酶切位點參照表1。

表1 基因擴增的引物Tab.1 Primer sequence for gene amplification

注：下劃線所標注的堿基是用于表達載體構建在 PCR 擴增引物上所引入的限制性酶切位點。

Note：The underscore labeled base is used to express the vector construct on the PCR amplification primer introduced by the restriction site.

采用常規PCR方法克隆棉花GhSAD2基因序列，以棉花cDNA為模板，以高保真聚合酶Pfu高保真酶(全式金，北京)進行PCR擴增，擴增反應體系為：10×EasyPfu Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，EasyPfu DNA Polymerase 0.4 μL，正向引物和反向引物各加入1 μL；棉花DNA模板1 μL后用ddH2O補充到20 μL。PCR時所用的反應條件為：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s，退火65.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min 30 s，共30個循環；72 ℃ 10 min。將擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收約1 200 bp的目的片段，將其連接到克隆載體pMD19-T上，構成重組質粒，所用的連接體系為：pMD19-T Vactor 1 μL，Solution I 1 μL，回收的目的片段4 μL。將重組質粒通過熱激法轉入大腸桿菌中，經過藍白斑篩選，菌液PCR鑒定，將篩選得到的陽性菌液送至上海生工進行測序驗證。用軟件DNAMAN對測序結果進行比對，選取比對結果大于98%的菌液進行質粒的提取，并將其命名pMD19-T-GhSAD2。

1.2.4 棉花GhSAD2基因表達載體的構建 用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切pMD19-T-GhSAD2質粒和pBI121雙元表達載體，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物并回收大于10 000 bp的目的大片段和1 200 bp左右的目的小片段，從而獲得GhSAD2基因片段和pBI121載體片段。將GhSAD2基因的線性片段和酶切消化的pBI121載體片段分子，按 3∶1摩爾比混合，T4連接酶(全式金，北京)4 ℃連接過夜。用熱激法轉入大腸桿菌感受態Trans1-T1中，并將其均勻涂布于含有Kan抗性的LB平板培養基上，放置37 ℃恒溫箱中過夜，從中挑取出單克隆的菌落，用引物GhSAD2F和GhSAD2R進行菌落的PCR鑒定，凝膠電泳檢測，跑膠結果中出現了預期條帶的菌液為候選的陽性克隆菌液，用質粒提取試劑盒的操作步驟進行提質粒，將提取到的質粒用XbaⅠ、SmaⅠ限制性內切酶進行雙酶切鑒定，最終獲得pBI121-GhSAD2陽性克隆。

1.2.5 葉盤法轉化煙草 將構建正確的重組質粒pBI121-GhSAD2電擊轉化到GV3101農桿菌感受態中，并將其均勻涂布于含有卡那霉素抗性和利福平抗性的LB平板上，在28 ℃下恒溫培養約48 h。從中挑取單克隆的菌株將其接種于含50 μg/mL的卡那霉素和含50 μg/mL利福平霉素的2 mL 的LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養20 h左右，然后吸取1 mL培養的菌液接種至50 mL含相應抗性的LB液體培養基中，恒溫28 ℃振蕩培養，用分光光度計測其OD值 ，當OD值在1.2～1.6時。常溫，4 000 r/min 離心10 min，用MS轉化液重懸沉淀混勻至OD值=0.4～0.6，然后進行煙草的轉化。

1.2.6 轉基因煙草的鑒定和GUS活性組織染色 按照CTAB-SDS法提取野生型煙草和轉基因煙草基因組DNA[35]，并用GhSAD2F和GhSDA2R引物分別對野生型煙草和轉基因煙草進行PCR擴增，通過對PCR產物電泳檢測，確認GhSAD2基因是否已經成功導入并整合到轉基因煙草的基因組中。表達載體pBI121-GhSAD2攜帶GUS報告基因，用GUS染色試劑盒進行染色，以PCR檢測為陽性的轉基因煙草幼嫩的葉片作為試驗的材料，其中野生型煙草作為對照組。將需要檢測煙草葉片放于2 mL的離心管中，并用事先配置好的X-Gluc染液將其完全浸沒，置于28 ℃下顯色2 h后，并用75%乙醇進行脫色3次，再用無水乙醇脫色1次，直至將對照葉片完全脫色時，將轉基因煙草和野生型煙草放置在一起觀測，并對2種類型的葉片進行拍照。

1.2.7 轉基因煙草的抗寒性鑒定 選取苗齡2個月左右的轉基因煙草用于煙草抗寒性的鑒定，選取長勢一致的野生型煙草和轉基因煙草作為本試驗的試驗材料，在4 ℃處理48 h后測定其電解質滲漏率。測定方法采用Gong等[36]的方法，重復3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 棉花GhSAD2基因的克隆

從GenBank已公布的數據中，下載棉花GhSAD2的基因序列(KX197920)，用GhSAD2-XbaⅠ和GhSAD2-SmaⅠ引物(表1)，從新陸早33的cDNA中克隆出大小約為1 200 bp左右的擴增條帶(圖1)。將特異條帶切膠回收，然后連接PMD19-T 載體，轉化Trans1-T1感受態細胞后，用藍白斑篩選陽性克隆送測序公司測序。其測序結果通過DNAMAN多重序列對比分析，選取同源性最高的陽性質粒用XbaⅠ和SmaⅠ進行雙酶切，得到約為1 200 bp的酶切小片段(圖2)，獲得預期目的基因。

M. DL2000；1～4. GhSAD2的PCR片段。M. DL2000；1-4. PCR fragment of GhSAD2.

M.DL2000；1～2. 雙酶切產物。M. DL2000；1-2. Fragment of double enzyme.

2.2 棉花GhSAD2基因表達載體的構建

回收約1.2 kb的酶切基因片段，與經同酶切的表達載體pBI121約為14.7 kb的大片段相連接，獲得重組質粒pBI121-GhSAD2(圖3)，重組載體中基本的載體骨架依舊為pBI121表達載體，本試驗克隆得到的棉花GhSAD2基因是在CaMV35S下游XbaⅠ和SmaⅠ的酶切位點之間進行插入的。通過雙酶切對重組子pBI121-GhSAD2進行酶切，凝膠電泳檢測結果出現約1 200 bp左右的片段，該片段的大小和目的片段大小基本是保持一致的，該跑膠結果說明重組的過表達載體pBI121-GhSAD2已經成功構建(圖4)。使用電擊儀將驗證陽性的重組的過表達載體pBI121-GhSAD2導入到事先準備好的農桿菌感受態中，經GhSAD2F和GhSAD2R引物進行PCR擴增，觀測電泳的結果發現凝膠中出現和目的片段大小位置相同的特異片段(圖5)。該跑膠結果說明上述構建的表達載體pBI121-GhSAD2已成功轉入到農桿菌GV3101中并進行表達。

圖3 pBI121-GhSAD2表達載體模式圖Fig.3 Diagram of expression voctor pBI121-GhSAD2

M.DL2000；1～2. 重組子雙酶切產物。M.DL2000；1-2. Recombinant double enzyme product.

M. DL2000；1～5. 重組質粒pBI121-GhSAD2的擴增產物。M. DL2000；1-5.Recombinant plasmid pBI121-GhSAD2 amplification product.

2.3 轉基因煙草的鑒定及GUS活性染色

通過對培養瓶中的再生煙草進行抗性卡那霉素篩選，本試驗共得到12株長勢較好的再生轉基因煙草植株，分別提取每個植株葉片的DNA并進行PCR擴增檢測，用GhSAD2-XbaⅠ和GhSAD2-SmaⅠ引物進行擴增，跑膠結果表明，其中有9株可以擴增得到約1 200 bp的特異性條帶，而野生型煙草作為對照組沒有出現特異性條帶(圖6)，此結果說明外源的棉花GhSAD2基因已經整合到了煙草的基因組中，因此，可以得到pBI121-GhSAD2在煙草上的轉化率為75%。選取PCR跑膠結果為陽性的轉基因煙草植株，摘取其幼嫩的葉片(大小基本相同)分別進行相同時間的GUS染色，染色完成后再分別脫色，脫色后轉GhSAD2基因煙草植株的葉脈中呈現出不同程度的藍色，野生型煙草葉片全呈黃白色(圖7)。表明外源GhSAD2基因連接載體pBI121后一起導入煙草中且能穩定表達。

M. DL2000；1～12.轉pBI121-GhSAD2基因煙草PCR產物；13. 重組子pBI121-GhSAD2擴增產物；14. 野生型煙草DNA擴增產物。M. DL2000；1-12. Transgenic pBI121-GhSAD2 tobacco PCR product；13. Recombinant pBI121-GhSAD2 amplification product；14. Wild-type tobacco DNA amplification products.

A. 轉pBI121-GhSAD2基因煙草；B. 野生型陰性對照。A.pBI121-GhSAD2 transgenic tobacco；B. Wild-type negative control.

2.4 轉基因煙草的抗寒性鑒定

4 ℃低溫脅迫48 h后，轉pBI121-GhSAD2基因煙草和野生型煙草均表現為植株和葉片萎蔫、下垂，但轉pBI121-GhSAD2基因煙草較野生型煙草萎蔫程度較輕(圖8)。葉片相對電導率(REC)可以反映植物葉片細胞電解質滲出情況，即細胞膜受損程度。在相同時間的低溫處理下，轉pBI121-GhSAD2基因2個株系的煙草T1、T2相對電導率顯著低于野生型煙草，但后兩者無顯著差異(圖9)。表明轉pBI121-GhSAD2基因煙草的細胞膜受損程度要顯著低于野生型煙草。

A、C. 轉pBI121-GhSAD2基因煙草；B. 野生型煙草。A，C. Transgenic pBI121-GhSAD2 tobacco；B. Wild type tobacco.

圖中的小寫字母a和b表示相同處理下不同株系處理間差異顯著程度(P<0.05)。The lowercase letters a and b in the figure indicate the significant difference in the treatment of different strains under the same treatment (P <0.05).

3 討論

棉花不僅提供紡織原料，也是我國重要的油料和飼用作物[37]。脂肪酸組成是決定食用油品質的重要因素[38]。據報道，棉籽油中含有大量不飽和脂肪酸，其亞油酸的含量可超過 50%，具有較好的營養價值，是高質量的食用油。脂肪酸去飽和酶Δ9-硬脂酰-ACP是目前研究最多、最廣泛的脂肪酸去飽和酶，因為它不僅影響著植物脂肪酸的組成，也同時與植物抗寒性密切相關，而關于SAD與植物抗寒性關系研究已經成為分子生物學研究的熱點。

目前已從多種植物中分離獲得SAD基因的 cDNA，其中包括油菜[39]、芝麻[40]、油茶[41]、核桃[42]、棉花[32，43]等。SAD基因在高等植物的各個器官中均有表達，而表達模式和表達量存在差異。例如SAD基因在油樟的葉、種子、花中表達量較高，而在根和莖中表達量較低[42]。而在海濱錦葵中，SAD基因在其葉子中的表達量最高，在花中的表達量最低，SAD基因在海濱錦葵種子不同階段的表達量隨種子的發育而逐漸降低[44]。Liu等[43]通過 RNA干涉棉花SAD基因的表達，其棉籽的硬脂酸含量從正常的20%上升到40%，同時還伴隨棉籽油中棕櫚酸、油酸和亞油酸的減少。Wendy 等[17]將土豆的SAD基因轉入煙草中，發現葉片和種子的脂肪酸組分發生了變化，其不飽和脂肪酸含量增加。目前，對SAD基因的研究大多集中在SAD基因的表達模式及其對脂肪酸含量及組分的變化上，在抗寒方面的研究，主要集中在低溫脅迫下SAD基因相關表達量的變化情況，但對于SAD基因在抗寒中的具體作用卻鮮有報道。本研究主要通過基因工程的手段克隆棉花GhSAD2基因，構建植物表達載體pBI121-GhSAD2并將其轉入模式植物煙草中，通過低溫下煙草的表型性狀及檢測其電解質滲漏率，研究棉花GhSAD2基因在植株抗寒中的具體作用。研究結果顯示，陸地棉GhSAD2基因能夠顯著增強非低溫馴化植物煙草的抗寒性，從而提高植物細胞的低溫防御能力，但由于該研究中所用的轉pBI121-GhSAD2基因煙草均為T0的煙草植株，所以該研究中對于抗寒性的研究結果只能作為基礎，對于GhSAD2基因在抗寒中的具體作用需要進一步通過純合的高代植株及棉花直接來驗證。

通過轉基因技術改良棉花脂肪酸的組成及抗寒性是一項意義重大的工作，接下來將測定已純合的轉pBI121-GhSAD2基因煙草的各項生理指標及脂肪酸成分來進一步研究GhSAD2基因的抗寒作用。并將構建好的過表達載體pBI-GhSAD2轉入棉花中直接研究其抗寒性，以期可以將其用于改善植物的抗寒性。

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