肥城桃果實己糖激酶Ⅱ基因克隆、生物信息學分析及原核表達

張 凱，高 珊，朱樹華

(山東農業大學 化學與材料科學學院，山東 泰安 271018)

糖為植物生長和呼吸提供能量，是所有植物生存的基礎物質[1]，也是決定果實品質的重要因素。在大多數高等植物中，通過光合作用產生的碳水化合物以蔗糖為主，通過韌皮部分配運輸到不同的庫組織中。在植物組織中，蔗糖可以被直接貯藏，還可以在蔗糖合成酶或者轉化酶的作用下轉化成己糖[2]，也就是葡萄糖和果糖。在植物呼吸代謝過程中，己糖經過己糖激酶(Hexokinase，HK)磷酸化開始進行糖酵解，從而為植物活動提供能量和代謝產物[3-5]，因此植物中淀粉的合成和碳元素的循環離不開HK對己糖的磷酸化[6-7]。HK也被稱為雙功能兼職酶[8]，在植物的生長進程中，HK不僅參與糖代謝，而且是己糖傳感器[9]，在信號網絡中起到傳感和信號作用，能夠感知外界營養、光和激素信號，調控植物的生長[10]。

廣義上，植物中的HK包含己糖激酶、果糖激酶和葡萄糖激酶。果糖激酶對果糖有高度的特異性，葡萄糖激酶對葡萄糖具有專一性，而HK可以磷酸化果糖、葡萄糖等一系列己糖[11]。目前已經證實幾乎所有生物體中都存在HK，根據對番茄、馬鈴薯等植物的HK研究發現HK存在同工酶，并且多數植物中都存在1～3個同工酶[12-13]。有研究表明，線粒體的信號轉導途徑匯聚于線粒體HKⅡ上[14]，HKⅡ可以與線粒體膜通透性轉化孔(MPTP)上的電壓依賴型陰離子通道(VDAC)發生相互作用，HKⅡ從VDAC上脫落誘導VDAC蛋白關閉進而抑制MPTP的開放，從而調控線粒體的通透性[15-16]。

本試驗以肥城桃(Prunuspersica(L.)Batsch cv.Feicheng)為試驗材料，克隆得到肥城桃果實HKⅡ基因全長并進行了生物信息學分析，并在大腸桿菌中成功表達并且純化出HKⅡ蛋白，以期對植物HKⅡ蛋白的結構和功能有進一步的了解，從而為揭示HKⅡ在線粒體中的信號轉導途徑奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質粒及試驗材料

以肥城桃果實為試驗材料，于2015年采摘自山東省肥城市肥城桃基地。選擇顏色均勻、大小相似、無機械損傷和無病蟲害的七成熟桃果實，采摘后于2 h內運回實驗室，0 ℃環境中預冷24 h后將果實切成大小均勻的碎塊用液氮冷凍處理，-80 ℃冰箱保存備用。

大腸桿菌菌種E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)為山東農業大學化學與材料科學學院生物化學實驗室保存。表達載體pET-30a質粒采購于全式金公司。克隆載體pMD18-T Vector采購于寶生物公司。本研究所用引物(表1)均由華大基因公司合成。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers and sequences

注：GGTACC為KpnⅠ酶切位點；GGATCC為BamHⅠ酶切位點。

Note: GGTACC isKpnⅠrestriction site；GGATCC isBamHⅠrestriction site.

1.2 試驗方法

1.2.1 提取肥城桃果實總RNA及合成1st-Strand cDNA 總RNA參考改良CTAB法提取[17]，使用購自TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成1st-Strand cDNA。

1.2.2HKⅡ基因中間片段序列的克隆 根據從GenBank中查找的碧桃的HKⅡ基因片段，使用Primer Premier 6.0軟件設計HKⅡ-F和HKⅡ-R作為驗證引物，以合成的1st-Strand cDNA為模板加入PCR反應體系，將反應后的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將含有目的條帶的凝膠塊切塊回收，使用Gel Extraction Kit(康為世紀)回收DNA片段。將目的DNA連接pMD18-T載體，通過熱激法將構建好的克隆載體轉化至感受態細菌DH5α中。通過菌液PCR驗證篩選陽性克隆后送至測序公司(北京華大基因)。

1.2.3HKⅡ基因全長的克隆及生物信息學分析 根據通過測序驗證的HKⅡ基因片段，設計RACE引物HKⅡ-S、HKⅡ-AS和巢式引物HKⅡ-NS、HKⅡ-NAS。使用SMARTTMRACE cDNA(TaKaRa)試劑盒，按照說明書操作進行5′-RACE和3′-RACE。將RACE得到的PCR產物作為PCR中的復制模板，加入巢式引物HKⅡ-NS、HKⅡ-NAS進行巢式PCR。PCR產物經過電泳純化后，切膠回收目的DNA，送至華大公司測序。將測序得到的5′端和3′端核苷酸序列與中間片段拼接，得到HKⅡ基因全長。將獲得的核苷酸序列在NCBI數據庫中Blast檢索分析同源序列，利用DNAMAN軟件進行HKⅡ氨基酸序列同源性分析，使用MEGA 4.1軟件構建HKⅡ蛋白序列的系統進化樹。使用ProtParam tool在線分析HKⅡ蛋白的理化性質和親水性。使用PSIPRED分析HKⅡ蛋白的二級結構，利用SWISS-MODEL對HKⅡ蛋白進行三維結構的模擬。

1.2.4 體外重組HKⅡ蛋白 根據HKⅡ的核苷酸完整開放閱讀框，使用Primer Premier 6.0設計帶有不同酶切位點的引物HKⅡ-1和HKⅡ-2。RT-PCR獲得HKⅡ的DNA全長與pMD18-T Vector連接，構建克隆載體。將克隆載體和pET-30a質粒分別用限制性內切酶雙酶切后，采用T4DNA Ligase連接目的片段，獲得pET-30a-HKⅡ重組質粒。將重組質粒pET-30a-HKⅡ導入表達菌株BL21，經菌液PCR檢測后進行體外重組蛋白。取200 μL菌液加入到10 mL含抗生素的培養基中，37 ℃搖菌至OD600=0.4～0.6，取1 mL菌液用于電泳檢測，向剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，38 ℃條件下誘導8 h，取1 mL菌液進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.5 HKⅡ重組蛋白的純化 采用帶有His標簽的Ni-瓊脂糖凝膠(Solarbio)進行蛋白質的純化，按照說明書的使用方法操作。洗脫蛋白的咪唑洗脫液效果最佳濃度為200 mmol/L。用12%的SDS-PAGE分析純化后的HKⅡ蛋白。

2 結果與分析

2.1 HKⅡ基因cDNA全長的克隆

通過GenBank中桃果實的HKⅡ基因片段，設計驗證引物HKⅡ-F和HKⅡ-R，以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR反應，所得結果如圖1-A所示，經過測序驗證后序列一致。根據中間片段序列設計RACE引物以及巢式引物，進行RACE擴增和巢式PCR后得到與預期長度一致的目的條帶，得到如圖1-B所示的結果，將5′與3′-RACE的核苷酸序列與中間片段進行拼接后獲得肥城桃HKⅡ基因cDNA全長序列，共1 835 bp。

A.HKⅡ基因中間片段：1.DL2000分子量標準；2.PCR產物。B.巢式PCR：1.DL2000分子量標準；2，3.3′巢式PCR產物；4.5′巢式PCR產物。A.Middle sequences of HKⅡ gene：1.DL2000 Marker；2.Product of PCR.B.Nested PCR：1.DL2000 Marker；2，3.Nested PCR of 3′-RACE products；4.Nested PCR of 5′-RACE products.

2.2 HKⅡ基因的生物信息學分析

對HKⅡ基因進行生物信息學分析(圖2-A)，該序列具有起始密碼子ATG(173 bp)和終止密碼子TGA(1 664 bp)，存在完整的開放閱讀框。閱讀框共有1 496個堿基，編碼497個氨基酸(圖2-B)。PortParam tool預測蛋白分子式為C2379H3846N652O717S17，原子總數為7 611個，分子量為53.6 kDa，理論等電點為6.17，總平均疏水指數為0.023，表明HKⅡ蛋白為疏水性蛋白。TMHMM跨膜結構預測HKⅡ為跨膜蛋白，有1次跨膜，絕大部分在膜外。如圖3-A所示，二級結構預測結果顯示HKⅡ蛋白由15段α螺旋和11段β折疊和無規則卷曲構成。肥城桃HKⅡ蛋白預測的三級結構如圖3-B所示，其蛋白結構呈V字型，折疊結構較多。

2.3 HKⅡ氨基酸序列同源比對和系統進化分析

試驗獲取的桃果實HKⅡ氨基酸序列在NCBI數據庫中進行Blast，與其他植物HKⅡ氨基酸序列比對，得到如圖4所示的同源性關系。比對顯示，桃果實與其他植物的HKⅡ氨基酸的同源性較高，其中與獼猴桃(Actinidiadeliciosa)、橙子(Citrussinensis)、木豆(Cajanuscajan)、枇杷(Eriobotryajaponica)、蘋果(Malusdomestica)、葡萄(Vitisvinifera)、桑樹(Morusnotabilis)、香瓜(Cucumismelo)、煙草(Nicotianatabacum)的相似度分別是91.58%，91.98%，92.18%，96.98%，96.58%，89.13%，93.59%，92.18%，90.78%，系統進化樹(圖5)中碧桃和枇杷在一支上，與同源比對結果一致。結果符合進化關系，說明植物的HKⅡ蛋白具有較高的保守性。

圖2 HKⅡ基因cDNA序列(A)和氨基酸序列(B)Fig.2 Full length sequence of cDNA (A) and amino acid sequence (B) of HKⅡ

2.4 HKⅡ的體外表達與純化

將重組質粒pET-30a-HKⅡ導入大腸桿菌BL21(DE3)中，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導表達，獲得HKⅡ重組蛋白。電泳結果如圖6-A所示，HKⅡ重組蛋白表達成功。菌液通過超聲破碎分離出包涵體，溶解于6 mol/L鹽酸胍緩沖液中，經過Ni-瓊脂糖凝膠純化后，獲得較高純度的HKⅡ重組蛋白(圖6-B)。

3 結論與討論

本試驗通過NCBI中碧桃HKⅡ的cDNA序列為模板設計驗證引物，以肥城桃果實中反轉錄的cDNA為模板進行PCR，測序后試驗結果與碧桃的序列片段一致，根據該片段設計RACE引物和巢式PCR引物，獲得HKⅡ基因5′和3′端序列后，片段拼接得到共計1 664 bp的肥城桃果實HKⅡ基因cDNA序列，編碼氨基酸497個。對HKⅡ進行序列比對和生物信息學分析，發現桃HKⅡ具有較高的同源性，與枇杷(ADZ96378.1)的HK同源性最高。本試驗還體外表達了HKⅡ蛋白，通過Ni-瓊脂糖凝膠純化出帶有His標簽的目的蛋白。

人們在1956年發現并報道了己糖激酶，在隨后的研究中發現植物體組織中存在好幾種不同的己糖激酶，它們分布在細胞的葉綠體、線粒體、液泡、內質網、細胞核等不同的組織中，而且它們的層析和動力學性質有一定差異[18]。細胞質中的HK可活化其中的葡萄糖[19]，而線粒體膜上的HK參與糖酵解過程[20]，細胞核中HK可以影響調控葡萄糖信號基因的表達。有研究表明，蘋果的HK在細胞質基質中含量最高，為39.1%，其次是線粒體，為17.4%[21]，本研究為下一步桃果實中HKⅡ基因的亞細胞定位和探討打下了基礎。

圖3 HKⅡ蛋白二級結構(A)和三級結構預測(B)Fig.3 The second structure (A) and thepredicted tertiary structure (B) of HKⅡ protein

由上而下依次為橙子、獼猴桃、木豆、枇杷、蘋果、葡萄、桑樹、香瓜、煙草、碧桃。The amino acid sequence in the map which from the top to the bottom represent are：Citrus sinensis，Actinidia deliciosa，Cajanus cajan，Eriobotrya japonica，Malus domestica，Vitis vinifera，Morus notabilis，Cucumis melo，Nicotiana tabacum，Prunus persica.

分支上的數值表示1 000次重復計算得到的Bootstrap值。The values on the branches represent the Bootstrap values obtained by the 1 000 iteration.

A.HKⅡ重組蛋白表達：1.低分子蛋白質分子量標準；2，4.含pET-30a-HKⅡ質粒，經IPTG誘導的蛋白；3.含pET-30a-HKⅡ質粒，未誘導的蛋白；5.含pET-30a的質粒，經IPTG誘導的蛋白。B.HKⅡ重組蛋白純化：1.經IPTG誘導的蛋白；2.未經IPTG誘導的蛋白；3.低分子蛋白質分子量標準；4～6.純化后的HKⅡ蛋白。

A．Recombinant protein expression of HKⅡ：1.Standard protein molecular mass Markers；2，4.pET-30a-HKⅡ with induction by IPTG；3.pET-30a-HKⅡ without induction；5.pET-30a with induction by IPTG.B.Purification of HKⅡ recombinant protein：1.pET-30a-HKⅡ with induction by IPTG；2.pET-30a-HKⅡ without induction；3.Standard protein molecular mass Markers；4-6.Purified HKⅡ protein.

圖6HKⅡ重組蛋白12%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳
Fig.6RecombinantHKⅡproteinin12%SDS-PAGE

近年來的研究發現，己糖激酶參與高等植物的糖感受和信號轉導的過程，植物細胞能夠響應和感受己糖激酶信號，己糖激酶還參與了植物細胞程序性死亡。VDAC作為調控線粒體膜通透性和參與細胞凋亡通路的重要組成部分[22]，和HK結合后影響了MPTP的開放。另有研究表明，在植物中VDAC和HK的表達量是一致的[23-24]。這表明，在植物體中HK參與糖酵解和細胞凋亡的信號轉導途徑，更多關于肥城桃果實HKⅡ的重組蛋白活性檢測、結構分析的試驗正在進行中，將為HK參與的多種信號通路和糖感受機制提供理論依據。

[1] Li L，Sheen J.Dynamic and diverse sugar signaling[J].Current Opinion in Plant Biology，2016，33：116-125.

[2] Li M，Feng F，Cheng L.Expression patterns of genes involved in sugar metabolism and accumulation during apple fruit development[J].PLoS One，2012，7(3)：e33055.

[3] Yim H K，Lim M N，Lee S E，et al.Hexokinase-mediated sugar signaling controls expression of the calcineurin B-like interacting protein kinase 15 gene and is perturbed by oxidative phosphorylation inhibition[J].Journal of Plant Physiology，2012，169(15)：1551-1558.

[4] Claeyssen E，Rivoal J.Isozymes of plant hexokinase：occurrence，properties and functions[J].Phytochemistry，2007，68(6)：709-731.

[5] Granot D，David-Schwartz R，Kelly G.Hexose kinases and their role in sugar-sensing and plant development[J].Frontiers in Plant Science，2013，4(1)：44.

[6] Alonso A P，Vigeolas H，Raymond P，et al.A new substrate cycle in plants.Evidence for a high glucose-phosphate-to-glucose turnover frominvivosteady-state and pulse-labeling experiments with[13C]glucose and [14C] glucose[J].Plant Physiology，2005，138(4)：2220-2232.

[7] Zhao J，Sun M，Hu D，et al.Molecular cloning and expression analysis of a hexokinase gene，MdHXK1 in apple[J].Horticultural Plant Journal，2016，2(2)：67-74.

[8] Moore B D.Bifunctional and moonlighting enzymes：lighting the way to regulatory control[J].Trends in Plant Science，2004，9(5)：221-228.

[9] Kim Y M，Heinzel N，Giese J O，et al.A dual role of tobacco hexokinase 1 in primary metabolism and sugar sensing[J].Plant，Cell & Environment，2013，36(7)：1311-1327.

[10] Feng J，Zhao S，Chen X，et al.Biochemical and structural study ofArabidopsishexokinase 1[J].Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography，2015，71(Pt 2)：367-375.

[11] Kelly G，Moshelion M，David-Schwartz R，et al.Hexokinase mediates stomatal closure[J].The Plant Journal ：for Cell and Molecular Biology，2013，75(6)：977-988.

[12] Claeyssen E，Wally O，Matton D P，et al.Cloning，expression，purification，and properties of a putative plasma membrane hexokinase fromSolanumchacoense[J].Protein Expression and Purification，2006，47(1)：329-339.

[13] Feng J，Zhao S，Chen X，et al.Biochemical and structural study ofArabidopsishexokinase 1[J].Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography，2015，71(Pt 2)：367-375.

[14] Rasola A，Sciacovelli M，Pantic B，et al.Signal transduction to the permeability transition pore[J].FEBS Letters，2010，584(10)：1989-1996.

[15] Godbole A，Dubey A K，Reddy P S，et al.Mitochondrial VDAC and hexokinase together modulate plant programmed cell death[J].Protoplasma，2013，250(4)：875-884.

[16] Szabo I，Zoratti M.Mitochondrial channels：ion fluxes and more[J].Physiological Reviews，2014，94(2)：519-608.

[17] 陳長寶，朱樹華，周 杰.改良CTAB法提取成熟肥城桃果實的總RNA[J].山東農業科學，2009(5)：102-104.

[18] 秦巧平，張上隆，徐昌杰.己糖激酶與植物生長發育[J].植物生理學通訊，2003，39(1)：1-8.

[19] Cheng W，Zhang H，Zhou X，et al.Subcellular localization of rice hexokinase (OsHXK) family members in the mesophyll protoplasts of tobacco[J].Biologia Plantarum，2011，55(1)：173-177.

[20] Granot D，Kelly G，Stein O，et al.Substantial roles of hexokinase and fructokinase in the effects of sugars on plant physiology and development[J].Journal of Experimental Botany，2014，65(3)：809-819.

[21] 趙 錦，孫美紅，胡大剛，等.蘋果己糖激酶基因MdHXK1的克隆與表達分析[J].園藝學報，2015，42(8)：1437-1447.

[22] Vianello A，Casolo V，Petrussa E，et al.The mitochondrial permeability transition pore (PTP)-an example of multiple molecular exaptation?[J].Biochimica et Biophysica acta，2012，1817(11)：2072-2086.

[23] Homblé F，Krammer E M，Prévost M.Plant VDAC：facts and speculations[J].Biochimica et Biophysica acta，2012，1818(6)：1486-1501.

[24] Kusano T，Tateda C，Berberich T，et al.Voltage-dependent anion channels：their roles in plant defense and cell death[J].Plant Cell Reports，2009，28(9)：1301-1308.