水牛胃型LYZ c基因多態性及功能生物信息學分析

范新陽，張永云，邱立華，陳 濤，周芳廷，哈 福，苗永旺

(1.云南農業大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學 農科專業基礎實驗教學示范中心，云南 昆明 650201；3.云南省德宏州芒市畜牧站，云南 芒市 678400)

牛和羊等反芻動物以前腸發酵的方式從它們的食物中獲取營養物質[1]。這種以細菌進行的前腸發酵，其產生的短鏈脂肪酸被胃壁吸收，為反芻動物提供能量。為了從這些微生物群體中回收必需的營養物質，反芻動物必須破壞細菌和其他微生物細胞，釋放內容物，之后胃中的胃消化酶從內容物中提取營養物質[2]。細菌對于哺乳動物的消化酶普遍具有抗性，因此反芻動物募集一種抗細菌的溶菌酶來裂解這些前腸微生物[3]。

溶菌酶(Lysozyme，LYZ)是一種抑菌蛋白，它分布于生物體多種體液和組織中，包括禽類蛋清、動物分泌物(如人乳和眼淚)和多形核白細胞分泌物[4]。LYZ全稱為1，4-O-溶菌酶，是一種低分子量的基礎蛋白，它通過裂解細胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵直接溶解革蘭氏陽性細菌，在分泌型免疫球蛋白A和補體的參與下，也可以間接溶解革蘭氏陰性細菌[5-6]。動物LYZ分為3種：C型、G型和I型，其中溶菌酶C是唯一存在于脊椎動物、原索動物和無脊椎動物的類型，也是目前研究最深入的類型[7]。

迄今，在反芻動物中已經鑒定出14種LYZc基因，但只有9個LYZc基因可以編碼出相應的功能蛋白，它們之間具有74.8%～97.5%的同源性[8]。胃型LYZc基因是溶菌酶c基因家族的重要成員，它們在反芻動物的胃中高表達。普通牛胃型LYZc基因共有4個外顯子和3個內含子，編碼區(Coding sequence，CDS)序列全長為444 bp，編碼147個氨基酸，4個外顯子對應的編碼區大小分別為136，165，76，67 bp。胃型和非胃型LYZ c氨基酸序列雖然相似，但胃型LYZ c發生了適應性進化，等電點變低，能適應胃中的酸性環境，其作為反芻動物胃中的一種消化酶分解微生物，釋放營養物質，最后被宿主胃壁吸收。

水牛是熱帶和亞熱帶地區重要的家養動物，在農業生產中扮演重要角色，具有役用性能好、乳質佳、耐粗飼，且飼料轉化率高等特點[9]。胃型LYZ c在反芻動物飼料的轉化中發揮重要的作用，但有關水牛胃型LYZc基因的研究較少。本研究以河流型和沼澤型水牛為研究對象，對兩類水牛胃型LYZc基因編碼區序列進行了變異檢測和群體遺傳學分析，并結合已發表的牛科物種的同源序列進行了比較基因組學和生物信息學分析，以揭示水牛胃型LYZc基因的遺傳特征及其與其他牛科物種的差異。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究總樣本量為224份，其中檳榔江水牛(河流型)66份，沼澤型水牛158份(包括德昌水牛65份，德宏水牛11份，鹽津水牛29份，東流水牛9份，福安水牛17份，湖南濱湖水牛15份和江西濱湖水牛12份)。樣品均為耳組織樣，個體間不存在直接血緣關系，樣品保存于酒精中低溫帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA提取

采用酚/氯仿法提取基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其純度和濃度，TE緩沖液稀釋為50 ng/μL，保存于4 ℃備用。

1.3 PCR引物設計和PCR擴增及測序

根據水牛胃型LYZc基因全序列(GenBank登錄號為NW_005785126)使用Primer Premier 5軟件設計引物(表1)，分別擴增該基因的4個外顯子及其旁側序列。

PCR反應體系為25 μL，包含ddH2O 19.2 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，dNTP 0.2 μL(2.5 mmol/L)，Taq酶(5 U/μL)0.3 μL，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min→35個循環(94 ℃變性30 s→退火40 s→72 ℃延伸30 s)→72 ℃后延伸5 min終止反應。退火溫度與延伸時間依引物而異(表1)。PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產物經膠回收純化后，進行雙向測序，測序引物與PCR引物相同。

表1 胃型LYZ c基因分段擴增引物信息Tab.1 Primer information for segmented amplification of stomach LYZ c gene

1.4 數據分析

1.4.1 核苷酸序列及變異分析 采用上述引物分別對胃型LYZc基因4個外顯子及旁側序列進行擴增和測序，測序結果采用DNAstar軟件包(DNAstar Inc.)中SeqMan 程序進行序列核對和組裝，得到胃型LYZc基因完整外顯子拼接序列，拼接好的序列經ORF Finder程序(http：//www.ncbi.nlm.gov/gorf/)確定開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，并翻譯成蛋白序列。編碼區SNP位點的數量、位置由SeqMan、Mega 7軟件確定和輸出[10]，各SNP位點的群體遺傳組成用PopGen 32軟件(version 1.31)計算，單倍型劃分用Phase v2.1軟件進行。采用PANTHER蛋白分析軟件(http：//www.pantherdb.org/)預測氨基酸替換對其功能的影響。

1.4.2 蛋白質理化特性及結構分析 水牛LYZ c相對分子質量和等電點、疏水性、跨膜區和信號肽采用在線軟件Compute pI/Mw tool、ProtParam tool、ProtScale、TMHMM server 2.0和SignalP 4.1 Server進行預測分析；采用ProtComp 9.0程序進行LYZ c蛋白的亞細胞定位；通過NCBI數據庫預測蛋白質的保守結構域；基于同源建模法利用在線服務器SWISS-MODEL預測LYZ c蛋白的三維結構。

2 結果與分析

2.1 外顯子序列拼接及群體變異分析

采用PCR產物直接測序技術對胃型LYZc的4個外顯子及其旁側序列進行測序，共得到1 014 bp的序列，由ORF Finder程序中確定其編碼區序列。將獲得的編碼區序列提交到NCBI數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源比對，確定為水牛胃型LYZc基因序列。

在水牛胃型LYZc基因編碼區中共發現6個SNP位點，分別為c.87G>T、c.228G>A、c.396C>T、c.423C>T、c.424G>A和c.438C>G，其中SNP87僅存在于河流型水牛中，其他5個SNP為河流型和沼澤型水牛共享。在河流型水牛中發現的SNP87位點，G等位基因趨于純合，處于Hardy-Weinberg平衡狀態。水牛中檢測到的5個共享SNP位點在兩類水牛中均以雜合狀態存在，等位基因頻率相一致，且均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態；這些位點除SNP228外，其他4個SNP均位于第4外顯子中。各SNP位點的群體遺傳分析結果見表2。

表2 水牛胃型LYZ c基因的群體變異信息Tab.2 The variation information of buffalo stomach LYZ c gene

注：W.野生型等位基因；m.突變型等位基因；P.Hardy-weinberg平衡檢驗概率。

Note：W.Wild-type allele；m.Mutant-type allele；Pvalue.The probability of Hardy-weinberg equilibrium.

2.2 單倍型劃分及比較基因組學分析

基于本研究水牛序列SNP位點信息，采用Phase v2.1軟件進行兩類水牛單倍型劃分，劃分出的單倍型及其頻率等信息見表3。為了揭示水牛LYZc基因的遺傳特征，采用水牛LYZc單倍型序列作為查詢序列在NCBI數據庫中進行同源搜索，獲得以下牛科物種的胃型LYZc基因序列進行比較分析：水牛序列1條，為：NM_001290888；普通牛序列10條，分別為：BG937730、BG938401、BG937779、BG938044、CK971540、DY056864、M26241、BG937795、M26244和BG937506；瘤牛序列1條：XM_019960836；牦牛序列1條：XM_005900300；野牛序列1條：XM_010841550；山羊序列1條：KC954667(圖1)。在河流型水牛中共確定5種單倍型，即River buffalo_hap1～hap5，其中River buffalo_hap1～hap4為本研究數據確定的單倍型；River buffalo_hap1和River buffalo_hap2的期望頻率高，為河流型水牛群體優勢單倍型。在沼澤型水牛群體內共確定2種單倍型，即Swamp buffalo_hap1～hap2，均為本研究數據確定的單倍型，且它們的期望頻率相同。河流型與沼澤型水牛間未發現共享單倍型。對已發表的其他牛科物種胃型LYZc數據進行分析，在普通牛中確定10種單倍型，即Cattle_hap1～hap10；在瘤牛、牦牛、野牛和山羊中均確定1種單倍型，分別為Zebu_hap1、Yak_hap1、Bison_hap1和Goat_hap1。

表3 由本研究數據確定的水牛LYZ c基因各單倍型信息Tab.3 The haplotypes information of buffalo LYZ c based on the data in this study

各物種LYZ c核苷酸、氨基酸序列比對結果見圖1，2。各牛科物種胃型LYZc基因序列長度相同，均為444 bp，編碼147個氨基酸。將本研究數據與已發表的序列數據合并后，水牛的SNP位點數增加了3個，分別為c.196G>A、c.336G>C和c.351T>C。新增加的SNP位點均只存在于河流型水牛中，因此，共有4個SNP位點只存在于河流型水牛中(SNP87、SNP196、SNP336和SNP351)。水牛中異義替換為2個，分別為p.G66S和p.V142I，對應的SNP位點為SNP196和SNP424(圖2)。經采用PANTHER軟件預測表明，水牛中發現的p.G66S和p.V142I替換對胃型LYZ c功能沒有影響。水牛與其他牛科物種的種間核苷酸差異位點為c.42、c.132和c.348，但只有c.348相應的編碼氨基酸與其他?？莆锓N的不同(水牛：p.116Q；其他?？莆锓N：p.116H)。序列比對還揭示普通牛和瘤牛特有的核苷酸為c.13G和c.270T(圖1，2)。

由水牛胃型LYZc基因7種單倍型確定出3種蛋白變異體，即Buffalo 1～Buffalo 3。變異體Buffalo 1對應水牛LYZc基因River buffalo_hap1、River buffalo_hap3、River buffalo_hap4、Swamp buffalo_hap2單倍型；而變異體Buffalo 2則對應River buffalo_hap2、Swamp buffalo_hap1單倍型、變異體Buffalo 3則對應River buffalo_hap5單倍型。變異體Buffalo 1在水牛群體中出現頻率最高。由普通牛、瘤牛、牦牛、野牛和山羊LYZc基因單倍型分別各確定了4，1，1，1和1種變異體。水牛群體中發現有特異的氨基酸替換p.V142I。所有物種在第66位均出現Ser殘基。普通牛和瘤牛具有特異的氨基酸p.5V。各?？莆锓N間胃型LYZc核苷酸序列差異位點較多，但其編碼蛋白氨基酸序列差異較小(圖1，2)。

圖1 牛科物種胃型LYZ c基因單倍型序列核酸差異Fig.1 Nucleotide differences of haplotypes detected in stomach LYZ c among Bovidae species

圖2 ?？莆锓N胃型LYZ c變異體氨基酸差異Fig.2 Amino acid sequence differences among the variants of stomach LYZ c in Bovidae

2.3 水牛LYZ c變異體序列結構分析

水牛群體中的3種胃型LYZ c蛋白變異體的序列比較見圖3。水牛胃型LYZ c 3種變異體均具有N端的信號肽，切割位點位于第18和第19氨基酸殘基，其成熟肽包含129個氨基酸。生物信息學分析顯示，水牛3種胃型LYZ c變異體都含有1個屬于類溶菌酶超家族的LYZ1保守結構域，位于第19-145氨基酸殘基處，它們均不具有跨膜結構，為分泌到胞外發揮功能的親水蛋白。通過靶模板比對，構建水牛胃型LYZ c三維結構同源模型(圖4)。結果表明，水牛胃型3種LYZ c變異體成熟肽與普通牛胃型Lysozyme C-2成熟肽氨基酸序列長度相同，一致性分別為98.45%，97.67%和98.45%。

陰影表示信號肽序列；下劃線表示保守結構域。Signal peptide sequence is highlighted as shaded region；The region underlined indicates the putative conserved domain.

2.4 LYZ c蛋白序列差異分析

將水牛胃型LYZ c變異體氨基酸序列與已報道的普通牛胃型(S1、S2和S3)和非胃型(牛奶、腎、氣管和小腸)LYZ c氨基酸序列(Ensembl database ID：ENSBTAG00000011941、ENSBTAG00000026779、ENSBTAG00000000198、ENSBTAG00000026323、ENSBTAG00000046511、ENSBTAG00000026088和ENSBTAG00000046628)進行比較[8]，結果見圖5。水牛胃型LYZ c變異體與普通牛3種胃型LYZ c氨基酸序列一致性較高，與非胃型LYZ c序列差異較大。水牛與普通牛胃型LYZ c在氨基酸序列上的差異主要體現在第116，144位氨基酸的組成上，這2個位點對LYZ c蛋白的等電點影響較大。水牛3種LYZ c變異體第116，144位氨基酸與普通牛S1蛋白一致，分別為Gln(PI=5.65)和Glu(PI=3.22)，而普通牛S2蛋白在這2個位點分別為His和Glu，普通牛S3則分別為His(PI=7.59)和Gln。相比于普通牛非胃型LYZ c氨基酸序列，水牛與普通牛胃型LYZ c蛋白一樣，缺失了非胃型LYZ c蛋白第120-121位氨基酸之間的Asp-Pro肽鍵。

圖4 水牛胃型LYZ c變異體三級結構Fig.4 The tertiary structure of buffalo stomach LYZ c protein

水牛胃型與普通牛的胃型、非胃型LYZ c蛋白理化特性的比較見表4。胃型LYZ c蛋白的等電點較低，偏向于酸性，而非胃型LYZ c蛋白偏向于堿性。胃型LYZ c蛋白含有的正電荷和負電荷的氨基酸殘基數基本相同，而非胃型LYZ c蛋白含有正電荷的氨基酸殘基數普遍大于負電荷的氨基酸殘基。水牛和普通牛胃型LYZ c蛋白的理化特性差異較小，但水牛胃型LYZ c蛋白的等電點更低。所有LYZ c蛋白變異體均屬于穩定的親水蛋白。

圖5 LYZ c氨基酸序列比對Fig.5 Alignment of LYZ c amino acid sequences

基本理化特征Physicochemicalproperty胃型Stomach非胃型NonstomachB1B2B3S1S2S3牛奶Milk腎Kidney氣管Trachea小腸Intestinal氨基酸數147147147147147147148148147147Numberofaminoacids等電點(PI)6.806.806.806.806.877.559.928.149.419.65Isoelectricpoint分子量/kDa16.2816.2916.3216.2816.3016.3216.7816.4815.8816.39Molecularweight負電荷殘基151515151514101189(Asp+Glu)正電荷殘基15151515151526131923(Arg+Lys)不穩定系數24.6727.6630.2824.6728.6728.6722.8235.2415.3118.76Instabilityindex(II)平均疏水性-0.110-0.108-0.111-0.110-0.113-0.111-0.322-0.108-0.071-0.228GRAVY脂肪系數82.9383.6183.6182.9382.2482.9388.3183.1187.6281.56Aliphaticindex

注：B1～B3.水牛胃型LYZ c變異體；S1～S3.普通牛胃型LYZ c蛋白。

Note：B1-B3.Buffalo stomach LYZ c variants；S1-S3.Cattle stomach LYZ c proteins.

3 討論與結論

本研究通過分段測序，獲得了水牛胃型LYZc基因的編碼區序列。水牛胃型LYZc基因編碼區長為444 bp，編碼蛋白具有一個18肽的N端信號肽，成熟肽包含129個氨基酸。在水牛胃型LYZc基因編碼區共發現9個SNP位點，有4個存在于外顯子4中。河流型與沼澤型水牛共享5個SNP位點，共享的SNP位點具有相同的群體遺傳特征。分析表明，有2個SNP位點導致了氨基酸的替換，但它們對LYZ c蛋白的功能沒有影響。本研究確定胃型LYZc基因的c.42、c.132和c.348位核苷酸為水牛與其他牛科物種相互區分的核苷酸位點，在蛋白水平上只有第348位相應的編碼氨基酸與其他?？莆锓N不同，這些核苷酸位點可以作為水牛與其他物種間親緣分析的分子標記。在水牛中確定胃型LYZ c蛋白存在3種變異體，河流型水牛存在變異體Buffalo 1～3，沼澤型水牛中只有變異體Buffalo 1～2。經比較分析發現，水牛中的3種LYZ c蛋白變異體在氨基酸組成上只有1～2處差異，它們在理化特性、結構上的特征基本一致，揭示它們間的功能差異較小，也提示兩類水牛間LYZ c的功能差異較小。?？莆锓N胃型LYZc基因編碼區序列比對發現，雖然該區域SNP位點較多，但異義替換較少，LYZ c氨基酸序列一致性較高，其中普通牛和瘤牛一致性更高，這揭示牛科物種胃型LYZc基因具有較高的功能保守性。

哺乳動物典型的溶菌酶c是在中性pH環境下發揮功能，而反芻動物胃型溶菌酶c裂解胃中細菌的細胞壁，其發揮功能必須要適應酸性pH環境，并對胃中的消化酶具有抗性[3]。在這種適應的過程中，反芻動物胃型LYZ c的氨基酸序列發生了一些適應性改變。這些改變包括賴氨酸被精氨酸殘基替換，從而消除了胃中消化酶潛在的裂解位點，同時還失去了天冬氨酸-脯氨酸間的酸不穩定肽鍵[11-12]。胃型LYZ c的天冬氨酸殘基與酰胺基的含量與非胃型LYZ c相比偏低，同時它所含有的酸不穩定氨基酸殘基(天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)數量僅有18個，而非胃型LYZ c含有20～28個，這些特征保證了胃型LYZ c能在低pH環境下維持其功能。本研究預測水牛胃型LYZ c蛋白具有LYZ 1保守結構域，揭示它具有裂解細菌細胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4-糖苷鍵，消化微生物細胞壁的功能。水牛胃型LYZ c與牛奶和腎溶菌酶相比，其第120位的Asp被Glu替換，同時還缺失了121位的Pro，這樣就失去了非胃型LYZ c蛋白原有的天冬氨酸-脯氨酸二肽，提高了水牛胃型LYZ c對酸性環境的耐受力[13]。水牛除了具有普通牛胃型LYZ c蛋白的特點外(酸不穩定氨基酸殘基數為18個、不具有天冬氨酸-脯氨酸二肽)，水牛胃型LYZ c蛋白的第116位氨基酸為Gln，其等電點為5.65，而普通牛Stomach 3在該位點上為His，等電點為7.59；同時，水牛第144位氨基酸為Glu，等電點為3.22，普通牛Stomach 3在該位點上為Gln。因此，水牛胃型LYZ c蛋白的等電點(pI=6.80)比普通牛Stomach 3蛋白(pI=7.55)的更低，這可能會導致水牛胃型LYZ c蛋白更適合酸性環境。

許多研究表明，在相同的飼喂條件下，水牛粗纖維消化率要高于其他反芻動物[14-17]。水牛對粗飼料的高消化率，可能是由于水牛瘤胃內特殊的微生物生態系統造成的[18]。其可能具有更多的纖維素分解菌、真菌游動孢子以及較低的原蟲數量，導致水牛瘤胃微生物具有更高的蛋白質合成能力和氮循環利用能力[19-20]。水牛與普通牛胃型LYZ c蛋白之間最主要的差異是等電點不同，造成這種差異的原因可能與水牛瘤胃內特殊的微生物生態系統有關，推測胃型LYZ c與其瘤胃內的微生物經歷了長期協同進化的過程。

本研究在水牛胃型LYZ c內共發現9個SNP位點，定義了7種單倍型，確定了3種變異體，但它們的功能差異較小。河流型與沼澤型水牛在核苷酸水平盡管存在一定差異，但兩者的胃型LYZ c蛋白功能一致。水牛胃型LYZ c變異體不僅可以適應胃中的酸性環境，也可以在胃中裂解微生物細胞壁，這與其他?？莆锓N的胃型LYZ c蛋白具有相似性，但水牛胃型LYZ c蛋白等電點比普通牛更低，表明水牛胃型LYZ c蛋白更適應胃中酸性環境。水牛與牛科物種的胃型LYZ c蛋白氨基酸組成、結構和功能相近，揭示該基因在?？莆锓N中是由共同的祖先基因進化而來的，且受到了較高的選擇壓力。

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