黑曲霉糖化酶基因克隆及在釀酒酵母中的表達

劉加愛，陳 蕾，林元山，張小鵑，鄒洪彬，張學文

(湖南農業大學 生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

糖化酶又稱葡萄糖淀粉酶或γ-淀粉酶，學名為α-1，4-葡萄糖水解酶(α-1，4-Glucanglucohydrolase)，是目前最重要的工業酶制劑之一[1]。糖化酶是水解淀粉產生葡萄糖的主要酶類，作為一種外切型糖苷酶，從淀粉鏈的非還原性末端切開α-1，4-糖苷鍵連接的非還原端，水解成葡萄糖單元。因此，糖化酶被廣泛地應用于食品、制酒、醫藥、有機酸、抗生素、氨基酸等發酵工業，是我國用量最大的酶制劑產品。

許多學者利用基因工程和分子生物學的手段對糖化酶基因進行了克隆、轉化及表達的研究[2-6]。通過基因工程改造該基因、改良工程菌株等，以提高酶的發酵生產效率或改善酶的適用性[7-10]。但未見黑曲霉糖化酶分泌性表達相關的報道。本研究利用RT-PCR從黑曲霉中克隆了其glaA基因cDNA，經過改造除去了其信號肽區的編碼序列后將其克隆到酵母pVT102U/α表達載體上乙醇脫氫酶(ADH1)強啟動子下游[11]，并與α因子信號肽αMFL融合，以實現糖化酶的高效分泌表達。α胞外信號肽能有效將蛋白質分泌到細胞外，可以更有效保證酶的向外分泌，使表達蛋白更易分離制備。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料 黑曲霉(Aspergillusniger)、受體菌大腸桿菌DH5α、釀酒酵母S78和質粒酵母表達載體pVT102U/α由湖南農業大學生物科學技術學院實驗中心保存。pMD18載體和基因操作相關的酶均購自TaKaRa公司。總RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒、基因操作相關的試劑盒購自北京天根生物技術公司。其他常規化學試劑為國產分析純產品。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL；酵母完全培養基YPD：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖；YSD培養基：以 YNB為基礎補加2%葡萄糖，再按質粒的基因標記補加營養缺陷所需的亮氨酸、腺嘌呤、肌醇、2% 瓊脂；YPS篩選培養基：2%可溶性淀粉，1%酵母粉，2%蛋白胨，2%瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 cDNA文庫的構建與篩選鑒定 TRIzol法提取黑曲霉總RNA，根據GenBank中已登錄的糖化酶基因序列設計并合成引物，軟件預測氨基酸序列(圖1)。通過RT-PCR技術得到糖化酶基因cDNA，試劑盒純化回收后與pMD18克隆載體16 ℃過夜連接，熱激轉化E.coliDH5α感受態細胞，在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。獲得重組質粒并測序。

1.2.2 重組表達載體的構建 由于表達載體自身帶有胞外信號肽α因子[12]，根據軟件預測的糖化酶基因信號肽位點和選用載體的酶切位點XbaⅠ、HindⅢ設計引物，從pMD18-glaA上擴增glaA除去信號肽后的編碼序列，用XbaⅠ和Hind Ⅲ雙酶切glaA和pVT102U/α，膠回收目的片段，16 ℃過夜連接后，熱激轉化E.coliDH5α感受態細胞，在LB/Amp抗性平板上篩選陽性克隆。試劑盒提取質粒，雙酶切后電泳檢測并測序。質粒構建過程見圖2。

1.2.3 重組表達載體LiAc法轉入釀酒酵母S78 挑取3～4 mm S78單菌落接種于5 mL YPD液體培養基，30 ℃，250 r/min過夜培養。以1∶100接種到50 mL YPD液體培養基，30 ℃，250 r/min，培養至OD值0.4～0.6。5 000 r/min，室溫離心5 min，將收集的菌體用1×TE洗滌。離心，將細胞重懸于2 mL LiAc/TE緩沖液中，室溫放置30 min。在EP管中混合新制備的酵母感受態細胞100 μL，10 μL carrier DNA和0.1～1.0 g pVT102U/α-glaA，700 μL 40% PEG4000，于 42 ℃熱激 7 min，轉化后的酵母懸浮液離心并重新懸于200 μL 1×TE緩沖液中，取50 μL涂布于YSD平板上[13]。30 ℃，培養3～4 d。

加粗字體為信號肽序列；普通字體為其編碼的氨基酸序列。The bold font is a signal peptide sequence；The ordinary font is encoded by the amino acid sequence.

圖2 重組酵母表達糖化酶質粒構建流程圖Fig.2 The flow chart of yeast expression recombinant vector construction

1.2.4 S78轉化子的PCR鑒定與活性篩選 挑取YSD平板上的菌落溶于20 μL去離子水中，取10 μL用反復凍融法對酵母細胞進行破壁處理后，進行PCR擴增。擴增反應體系為25 μL，包括上下游引物各1 μL，12.5 μL Mix，3.5 μL菌液，其余用水補足，以未轉化的S78鑒定作對照。擴增程序：95 ℃預變性5 min；然后以94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min進行30個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。反應完成后，取20 μL反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

用接種環挑取菌P結果正確的S78轉化子點種于2%可溶性淀粉平板上，30 ℃，培養2～3 d。用碘液染色后，篩選出有透明水解圈的轉化子。通過計算水解圈與菌落直徑的比值挑選出比值最大的重組轉化子用于后期酶活的研究。

1.2.5 重組釀酒酵母S78的表達與SDS-PAGE電泳 重組釀酒酵母S78在YPD液體培養基中培養72 h后，離心后收集上清液。取20 μL樣品與5 μL 5×上樣緩沖液混合，沸水浴5 min后，離心取上清全部點樣。蛋白膠用考馬斯亮藍G250染色30 min，再脫色30 min[14]。

1.2.6 重組糖化酶酶活檢測 以2%可溶性淀粉為底物，采用DNS法[15]測定糖化酶的活性。取0.2 mL待測酶液，加入0.8 mL 2%可溶性淀粉溶液作為反應底物(用 pH值5.6，0.1 mol/L乙酸緩沖液配制)，70 ℃恒溫水浴鍋反應5 min。用0.5 mol/L NaOH溶液滅酶活。加入DNS試劑2 mL，沸水反應5 min后冷卻定容至20 mL，測定波長540 nm處光度值。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉糖化酶基因的克隆及檢測

根據NCBI數據庫中糖化酶基因的序列分析，glaA的長度為1 923 bp。提取黑曲霉總RNA后，通過RT-PCR技術，用高保真PfuDNA聚合酶擴增得到黑曲霉中糖化酶的cDNA序列約1.9 kb(圖3)，與理論相符。PCR產物經純化試劑盒純化回收后，與克隆載體pMD18相連轉入大腸桿菌E.coliDH5α感受態細胞，提取陽性克隆后，送至武漢生工公司測序。測序結果表明，與數據庫發表的glaA序列相似性為100%，證明已克隆得到黑曲霉糖化酶基因。

2.2 酵母重組表達載體pVT102U/α-glaA的構建與鑒定

glaA與 pVT102U/α連接轉化后，在LB/Amp抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養基中培養，提取質粒后經雙酶切，得到約1.9 kb的產物(圖4)。證明酵母重組表達載體pVT102U/α-glaA構建成功。

M.5.0 kb分子量標準；1.pVT102U/α-glaA雙酶切；2.未酶切pVT102U/α-glaA；3.pVT102U/α空質粒。M.5.0 kb DNA Marker；1.pVT102U/α-glaA digested with Xba Ⅰand Hind Ⅲ；2 .pVT102U/α-glaA without digestion；3.pVT102U/α plasmid.

2.3 陽性克隆PCR與篩選結果

pVT102U/α-glaA通過熱激法轉入釀酒酵母S78菌株，YSD營養缺陷型培養基篩選。從轉化平板上挑取轉化子利用反復凍融法破壁后，進行Conoly PCR鑒定(圖5)。同時，將轉化子點種于YPS平板上，30 ℃培養3 d后，碘液染色觀察(圖6)。轉化子菌落附近出現了大小不一的透明水解圈，證實基因成功轉入釀酒酵母S78，并能分泌有生物學活性的酶。

2.4 表達產物的SDS-PAGE及電泳分析

SDS-PAGE分析可見，糖化酶分子質量大約為80 kDa。由于載體帶有胞外信號肽α因子(圖7)，不需要進行細胞破碎，可直接取發酵液離心后的上清液進行試驗。避免了破壁過程中蛋白結構的破壞，保證了外源蛋白的完整性。

M.5.0 kb分子量標準；1.菌落PCR產物。M.5.0 kb DNA Marker；1.Yeast colony PCR product.

A.酵母S78；B.轉入pVT102U/α-glaA的酵母S78。A.Yeast S78；B.Transformed yeast S78.

M.蛋白質分子質量標準；1～3.發酵24，48，72 h的粗酶液；4.空白對照。M.Protein molecular Marker ；1-3.Fermented 24，48，72 h of the crude enzyme solution respectively；4.CK.

2.5 重組酵母糖化酶活的測定

經搖瓶發酵培養，每24 h取樣測定糖化酶酶活大小。如圖8所示重組釀酒酵母發酵72 h，酶活達到最大值28.86 IU/mL(圖8)。由圖9可知，重組糖化酶在pH值6條件下，酶活力最大；由圖10可知，重組糖化酶的最適反應溫度為60 ℃，隨著溫度的升高，酶活力有所下降。

3 結論與討論

目前，糖化酶的工業化生產仍然受到很大的制約，其最主要的原因就是雖然黑曲霉是優良的生產糖化酶的菌株，但野生黑曲霉菌株產酶水平較低，體現在淀粉水解時間比較長，發酵周期也受到其制約。楊麗娟等[16]采用基因改造的方法，將改造后的菌株與出發菌株生產糖化酶的產量及活性進行測定，發現酶活有所提高。本研究選用的pVT102U/α載體是優良的酵母分泌型表達載體，最大的一個特點就是其具有乙醇脫氫酶(ADH1)啟動子，是在酵母中表達的強啟動子，活性受乙醇抑制，有利于利用酵母輕發酵高效表達糖化酶基因。在本試驗中，發酵時間以72 h為最佳，延長搖瓶發酵時間明顯降低酶的活性，可能就是由于72 h后乙醇的產生對啟動子活力的抑制引起的。這也說明在利用ADH1啟動子表達蛋白時，控制發酵時間很重要。王海燕等[17]構建了ADH1啟動子和終止子引導表達的載體，使α-淀粉酶基因和糖化酶基因高效共表達，與酵母表達常用的甲醇誘導啟動子相比，發酵過程不需要甲醇誘導表達[18]，解決了產物商業化的問題，在食品醫藥方面將有很好的應用。克隆除去糖化酶基因自身信號肽，并與載體上的胞外信號肽α-MFL融合，將蛋白質分泌到細胞外，可以提高目標蛋白的分泌活性，使表達蛋白更易分離制備，避免了細胞破碎分離純化酶過程造成破壞。

圖8 不同發酵時間的糖化酶酶活Fig.8 Glucoamylase activity in fermentation liquid in different fermentation time

圖9 不同pH值條件下的糖化酶酶活力Fig.9 Glycosylase activity in fermentation liquid at different pH

圖10 不同溫度條件下的糖化酶酶活力Fig.10 Glycosylase activity in fermentation liquid at different temperature

重組釀酒酵母在YPD培養基中搖瓶發酵72 h，一般發酵酶活為28.86 IU/mL。在高溫(60 ℃)和最適pH值6條件下，產生的糖化酶酶活最高為39.98 IU/mL，比同類研究的酶活高出較多[19-20]。本試驗采用普通搖瓶發酵，存在著通氣不佳，影響了菌體的高密度生長及表達。因此，如果采用發酵罐發酵，通過調整通氣量、溫度、培養時間等，對重組酵母菌株的發酵條件進行進一步優化，可能進一步提高酶活和表達效率。

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