杜仲內生真菌DZJ07的GFP 標記及在小麥植株中的定殖

丁 婷,顧雙月,蘇 博,王 其,陳小潔

( 1.安徽農業大學 植物保護學院,安徽 合肥 230036；2.安徽省作物生物學重點實驗室，安徽 合肥 230036)

植物內生菌(Endophyte) 指某一階段或全部階段生活于健康寄主植物的各組織或器官內部的真菌、細菌或放線菌[1-3]，且沒有引起明顯發病癥狀的微生物，在植物體這一特殊的環境中，內生菌與宿主協同進化，構成植物體內的微生態系統，并對宿主植物體產生有益的生物學作用，增強植物抗逆、抗病原真菌和細菌等能力[2]。相關報道表明，在植物病蟲害防治方面應用植物內生菌可有效增強植物的抗病性[4-15]。

禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)引起的小麥紋枯病是我國小麥生產上的一種典型土傳病害，病菌在小麥不同生育階段均能造成侵染，形成爛芽、苗枯、爛莖以及枯白穗等癥狀，嚴重影響小麥的長勢和產量, 近年來，利用植物內生菌進行小麥紋枯病的生物防治已成為研究的重點[16-22]。安徽農業大學植物保護學院小麥病害課題組從健康的藥用植物杜仲(Eucommiaulmoides.)莖分離到1 株炭疽菌屬(Colletotrichum)內生真菌菌株DZJ07，該菌株對小麥紋枯病菌有較強的拮抗作用,能夠在小麥根部進行有效定殖，通過誘導小麥植株苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶等防御酶活性的提高，提高小麥對紋枯病的抗病能力[3], 具有重要的理論研究和生產開發價值。為了進一步研究該菌株的內生性，安徽省作物生物學重點實驗室利用綠色熒光蛋白基因(gfp), 采用農桿菌介導轉化法,篩選具有拮抗活性的綠色熒光蛋白，標記轉化子，研究該轉化子在小麥植株中的定殖能力以及對小麥紋枯病的生防效果，為深入研究杜仲拮抗內生菌與小麥的互作提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試菌株、質粒和培養條件

本試驗供試植物病原真菌、內生真菌及質粒的特征及來源見表1。PCR膠回收試劑盒、Taq酶和大腸桿菌菌株Trans-1 感受態等分子生物學相關試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司；根據gfp基因編碼區序列設計引物：引物1(gfp-R 5′-CGCACTA

GTGTACAGCTCGTCCAT-3′)和引物2(gfp-F 5′-GGGGGATCCATGGTGAGCAAG-3′)，由上海(生工)生物有限公司合成，以gfp1305為模板，以引物1和引物2為上下游引物擴增gfp基因。生化試劑：草胺膦購自德國Dr.Ehrensorfer公司，其他生化試劑均為國產分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli)常規培養采用LB培養基，根癌農桿菌常規培養采用YEB培養基，真菌常規培養采用PDA培養基。試驗用抗生素濃度為卡那霉素50 μg/mL、羧芐青霉素50 μg/mL、噻孢霉素300 μg/mL、草胺膦200 μg/mL。

1.2 供試培養基

PDA培養基：削皮馬鈴薯200 g/L(沸水煮20 min左右過濾出湯汁)，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L；LB 培養基：酵母提取物 5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值調至7.0；YEB培養基：牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/L，七水硫酸鎂 0.9 g/L，pH值調至7.0～7.4；麥粒培養基：將小麥粒放在水里浸泡48 h后，取適量裝在組培瓶，放在滅菌鍋121 ℃ 60 min滅菌。

IM液體培養基：2.5×基本培養基 80 mL ，葡萄糖 0.36 g，甘油 1 mL，加ddH2O至終體積192 mL，滅菌冷卻到50 ℃左右后添加8 mL 1mol/L MES和4 mL 10 mmol/L AS；2.5×基本培養基：KH2PO43.625 g，K2HPO45.125 g，MgSO4·7H2O 1.250 g，NaCl 0.375 g，CaCl2·2H2O 0.165 g，FeSO4·7 H2O 0.006 2 g，(NH4)2SO41.250 g，加1 L ddH2O。

固體M-100培養基(1 L)：M-100鹽溶液62.5 mL，葡萄糖10 g，KNO33 g，加ddH2O至1 L，瓊脂粉15 g；半固體M-100培養基的瓊脂的含量為1%。M-100鹽溶液(1 L)：M-100微量元素溶液8 mL，KH2PO416 g，Na2SO44 g，KCl 8 g，MgSO4·7H2O 2 g，CaCl21 g，加ddH2O至1 L；M-100微量元素溶液(500 mL)：H3BO330 mg，MnCl2·4H2O 70 mg，ZnCl2200 mg，Na2MoO4·2H2O 20 mg，FeCl3·6H2O 50 mg，CuSO4· 5H2O 200 mg，加ddH2O 500 mL。

表1 細菌、真菌和質粒Tab.1 Bacteria, fungi and plasmids

1.3 綠色熒光蛋白(GFP)表達載體pDHt-bar- gfp的構建

以gfp1305為模板，以引物1和引物2為上下游引物擴增gfp基因。PCR反應體系為：10×PCR緩沖液 5 μL、dNTP 4 μL、模板1 μL、gfp-R 2 μL、gfp-F 2 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL，加ddH2O至總體積為50 μL，以94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min為反應條件進行擴增。將PCR產物切膠回收，與pDHt-bar質粒分別進行雙酶切，對切膠產物分別回收并連接。雙酶切體系為：pDHt-bar/gfp24 μL、10×通用緩沖液3 μL、BamHⅠ 1.5 μL、SpeⅠ 1.5 μL，反應條件為：37 ℃溫浴過夜；連接體系為：pDHt-bar 2 μL、gfp6 μL、10×Buffer 1 μL、T4DNA 連接酶1 μL，16 ℃連接3 h。將全部連接產物轉至大腸桿菌Trans-1，隨機挑取單克隆子并進行驗證。

1.4 質粒pDHt-bar-gfp轉化生防真菌DZJ07及轉化基因的表達

1.4.1 質粒pDHt-bar-gfp轉入根癌農桿菌的感受態細胞[23]取0.5 μL pDHt-bar-gfp質粒加入置于冰上的根癌農桿菌感受態細胞中，混勻；液氮速凍后在37 ℃條件下溫育5 min，溫育完成立即冰浴；加入適量YEB培養基，28 ℃培養3 h，離心收集菌體；去掉上清后用適量液體YEB重懸菌體并均勻涂布在含有抗生素Carb和Kan 的YEB平板上，室溫培養。挑取轉化子并進行轉化子的驗證[23]，并將其菌液保存于-80 ℃。

1.4.2 根癌農桿菌與生防真菌DZJ07分生孢子孢懸液共培養 培養轉入pDHt-bar-gfp質粒的根癌農桿菌并制備生防真菌DZJ07分生孢子孢懸液，將孢子懸液調到1×106cfu/mL濃度，使其進行共培養[23]，操作方法：培養轉入pDHt-bar-gfp質粒的根癌農桿菌，離心收集菌體；用適量的IM液體培養基重懸菌體，并將菌液濃度調到OD660為0.15，搖床培養6 h左右；取培養好的根癌農桿菌菌液及制備好的孢懸液各100 μL 充分混合均勻，涂布于IM固體培養基平板，共培養2 d；加入適量含噻孢霉素和草胺膦的半固體M-100培養基培養3～4 d至抗性菌落出現；挑取疑似轉化子邊緣部分轉移到含噻孢霉素和草胺膦的M-100固體培養基上培養3～4 d，挑取抗性菌落(轉化子)，用試劑盒提取基因組并進行初步PCR驗證，取菌絲體在熒光顯微鏡下進行觀察，綠色熒光標記。

1.4.3 轉化子熒光觀察 將按照1.4.2方法獲得的多株轉化子以及原始菌株DZJ07分別接種于PDA 固體平板，光照培養箱28 ℃培養7 d后 觀察其菌落生長狀況；并在Leica DM5000B顯微鏡(Germany)下, 利用波長為450～ 490 nm 的激發光照射不同轉化子及原始菌株的菌絲，觀察熒光產生情況。

1.5 熒光轉化子的PCR 鑒定

采用植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根公司)提取熒光轉化子菌絲的DNA進行熒光轉化子的PCR鑒定。采用并建立如下的標準PCR擴增程序：94 ℃，5 min； 94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，2 min，34 個循環；72 ℃，10 min。用表2標準的PCR反應的擴增體系來完成。

表2 標準的PCR反應擴增體系Tab.2 Standard PCR reaction amplification system

1.6 轉化子的遺傳穩定性檢測

將轉化子接種至不含抗生素的PDA固體平板，28 ℃繼代培養10代后，重新轉接至含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA固體平板上，觀察菌體生長及其熒光產生情況。

1.7 熒光轉化子的拮抗活性測定

首先將原始菌株DZJ07、熒光轉化子及小麥紋枯病菌菌株分別接種到PDA固體平板上28 ℃培養7 d，備用。各熒光轉化子的拮抗活性測定采用平板對峙法[3]，同時以單接種病原菌平板為對照，每處理3個重復，置于25 ℃下黑暗恒溫培養。培養箱培養4～5 d，觀察并記錄結果，計算抑菌率。

1.8 熒光轉化子在小麥植株中的定殖檢測

1.8.1 熒光轉化子分生孢子液的準備 熒光轉化子接種于PDA培養基平板上，25 ℃下暗培養8 d，收集分生孢子，制備孢子懸浮液，通過血球計數法調整分生孢子懸浮液濃度為1.0×107cfu/mL。

1.8.2 麥種處理 揚麥158先浸泡于3%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，然后取出，將其用無菌水沖洗3～5遍后，置于無菌培養皿中，于25 ℃的恒溫培養箱內保濕催芽，待種子露白后，將其在熒光轉化子孢子懸浮液中浸泡5 h，取出備用。

1.8.3 小麥種植[3]小麥采用盆缽(高8 cm，上口徑7 cm,下口徑5 cm)種植，將熒光轉化子的麥粒培養物(篩選獲得的具有較佳拮抗活性的熒光轉化子接種在麥粒培養基上，放在28 ℃恒溫培養箱7 d即為麥粒培養物)與滅菌砂土按1∶5 (m∶V) 的比例混勻，制成菌土裝入盆缽中，播種按1.8.2方法催好芽的麥種，并于麥種表面覆蓋5 cm左右的菌土。以種植于裝有滅菌砂土盆缽中的小麥植株(麥種未經熒光轉化子孢子懸浮液浸泡)為陰性對照。每種處理均種植20盆，每盆5粒麥種，置于人工氣候培養箱(晝夜溫度18 ℃，相對濕度50%，晝夜各12 h)中培養。

1.8.4 熒光轉化子在小麥根際的定殖及數量檢測[3]于接種后第9，12，15，18，23，28，34天分別取不同處理組的小麥根系，參照齊永霞等[24-25]方法，利用梯度稀釋法，將獲得的母液依次稀釋至10-3，分別吸取濃度為10-3溶液100 μL涂布于含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA平板上，置于28 ℃恒溫培養箱內培養，每處理設置3個重復，48 h后觀察記載菌落數，計算平均每克根際土壤中的含菌量。

1.8.5 熒光轉化子在小麥植株的定殖及數量檢測[24]于小麥種植后第9，12，15，18，23，28，34天分別進行小麥植株的取樣以及熒光轉化子的數量檢測。樣品經下列方法處理：①根內定殖：小麥根系用流水沖洗干凈后，再用滅菌水反復沖洗，徹底去除根際土，根系首先用75%乙醇消毒3 min，后用無菌水沖洗3次。② 莖內定殖：小麥莖用75%乙醇消毒3 min，再用無菌水沖洗。定量稱取不同方法處理過的小麥根系、莖組織，于研缽中徹底研磨。研磨液稀釋至10-3，吸取10-3溶液100 μL涂布到已制備好的含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA 平板上。48 h后逐日觀察記載，觀察并計數平板上的菌落數。

于小麥種植后的第34天，取小麥根、莖組織(每1株苗為一個重復, 3次重復)，按照上述方法表面滅菌后，將小麥根、莖組織徒手切片，小心鋪展于載玻片上于激發光波段450～490 nm下進行綠色熒光觀察(萊卡DM5000B型號為DFC425C)。

1.9 熒光轉化子對小麥紋枯病防治效果試驗

麥種及小麥種植方法均同1.8.2和1.8.3，試驗設5種處理，具體方法參照文獻[3]，每處理重復20盆，每盆5粒。播種后35 d 調查紋枯病的發病情況，計算病情指數和發病率。5種處理如下所示：

①陰性對照處理：將催過芽的麥粒(麥種未經孢子懸浮液浸泡)播種于裝有滅菌砂土的盆缽里。

②小麥紋枯病菌 + 原始菌株DZJ07處理：小麥紋枯病(麥粒培養基培養)、原始菌株與滅菌砂土按1∶1∶5(m∶m∶V)的比例混合均勻，播種催過芽的麥粒(麥種經原始菌株孢子懸浮液(1.0×107cfu/mL)浸泡)。

③小麥紋枯病菌 + DZJ07熒光轉化子處理 小麥紋枯病菌(麥粒培養基培養)、熒光轉化子與滅菌砂土按1∶1∶5(m∶m∶V)的比例混合均勻后，播種催過芽的麥粒(麥種經熒光轉化子分生孢子懸浮液(1.0×107cfu/mL)浸泡)。

④小麥紋枯病菌處理 小麥紋枯病菌和滅菌砂土按1∶5(m∶V)混合均勻，播種催過芽的麥粒(麥種未經孢子懸浮液浸泡)。

⑤小麥紋枯病菌+多菌靈處理 小麥紋枯病菌與滅菌砂土按1∶5(m∶V)混合均勻，多菌靈拌種處理的麥粒播種于盆缽中。

2 結果與分析

2.1 綠色熒光蛋白基因(gfp)表達載體pDHt-bar-gfp的構建

以gfp1305為模板，進行PCR擴增，擴增產物(約750 bp)回收并與pDHt-bar質粒分別進行雙酶切后進行連接。連接產物轉至大腸桿菌Trans-1，隨機挑取單克隆子，以gfp-F和gfp-R為上下游引物擴增gfp基因。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，顯示克隆轉化子PCR擴增產物中有750 bp大小的條帶產生，初步推斷重組質粒pDHt-bar-gfp構建成功。隨后，重組質粒pDHt-bar-gfp送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果確認綠色熒光蛋白(gfp)表達載體pDHt-bar-gfp的構建成功。

M.DNA Marker(2 000 bp)；1，2. gfp基因PCR擴增產物。M.DNA Marker(2 000 bp)；1，2.PCR amplification products of gfp.

2.2 杜仲內生拮抗菌DZJ07熒光轉化子的獲得

2.2.1 綠色熒光蛋白基因(gfp)表達載體pDHt-bar-gfp的轉化 重組質粒pDHt-bar-gfp轉入根癌農桿菌AGL-1，過夜培養挑取單菌落進行PCR驗證(圖2)，圖2中顯示有750 bp大小的基因條帶，驗證pDHt-bar-gfp成功轉入根癌農桿菌AGL-1。將含有重組質粒pDHt-bar-gfp的根癌農桿菌AGL-1與杜仲內生拮抗菌DZJ07分生孢子液共培養2 d，培養液涂布于M-100固體培養基平板上生長3～4 d，復篩后最終獲得7個熒光轉化子。參照1.4 的方法提取熒光轉化子和原始DZJ07菌株的基因組DNA，并進行PCR 擴增，結果顯示7個熒光轉化子均擴增出大小約750 bp 的條帶，而DZJ07沒有任何擴增產物，其中2個轉化子DZJ07-1、DZJ07-6的基因組PCR結果如圖3所示。選取熒光轉化子DZJ07-1 、DZJ07-6的擴增產物進行克隆，比對結果表明序列與gfp基因編碼區序列相同，由此可知，外源gfp基因已整合到基因組DNA中。

M.DNA Marker(2 000 bp)；1～8.pDHt-bar-gfp農桿菌AGL-1單菌落PCR擴增產物；9.pDHt-bar空質粒對照。M.DNA Marker(2 000 bp)；18.PCR amplification products of pDHt-bar-gfp transformant strains;9.pDHt-bar empty plasmid control.

M.DNA Marker (2 000 bp);1～2.轉化子DZJ07-1、DZJ07-6基因組PCR擴增產物；3.DZJ07 PCR擴增產物；4.TE水對照。

M.DNA Marker (2 000 bp);1-2.PCR amplification products of transformants DZJ07-1,DZJ07-6 genomic;3.PCR amplification product of DZJ07;4.TE water control.

圖3熒光轉化子基因PCR驗證電泳圖
Fig.3GenomicDNAPCRconfirmationelectrophoresis

2.2.2 轉化子生長特性研究 轉化子于28 ℃培養7 d后，其菌落顏色、生長速度及菌絲和分生孢子形態等均與原始菌株DZJ07一致，可知，外源pDHt-bar質粒的插入對其生長和生物學特性沒有影響。熒光觀察表明，在激發光波長為450～490 nm的照射下，原始菌株 DZJ07菌絲不產生熒光，而7個抗性轉化子均能夠產生綠色熒光(圖4)，分別命名為DZJ07-1～DZJ07-7，結合上述轉化子的克隆擴增結果，可知綠色熒光蛋白(GFP)表達載體pDHt-bar-gfp的成功插入引起轉化子綠色熒光的產生。

圖4 標記GFP的炭疽菌DZJ07菌絲體的熒光圖Fig.4 Fluorescence of Colletotrichum gloeosporioides DZJ07 mycelium labeled with GFP

2.3 熒光轉化子的遺傳穩定性

參照1.6 的方法, 將所獲得的7個熒光轉化子DZJ07-1～DZJ07-7分別在不含抗生素噻孢霉素的PDA 固體平板上連續轉接10 次后，再接種至含噻孢霉素(300 μg/mL)的PDA固體平板上，各熒光轉化子不僅長勢正常，且能夠穩定的產生綠色熒光，從而表明表達載體pDHt-bar-gfp中的gfp基因和噻孢霉素抗性基因在轉化子中可穩定遺傳和表達。

2.4 熒光轉化子對小麥紋枯病菌的拮抗活性

熒光轉化子DZJ07-1～DZJ07-7對小麥紋枯病菌的拮抗活性檢測結果如圖5所示，由表3可知，轉化子DZJ07-5和DZJ07-6對小麥紋枯病菌的拮抗活性略強于原始菌株DZJ07，抑菌率均在50%以上；DZJZ07-1、DZJ07-2和DZJ07-7的拮抗活性比DZJ07稍弱，抑菌率在43.68%～46.11%；而熒光轉化子DZJ07-3和DZJ07-4的抑菌率相對較低，僅在35%左右。因此，在后續試驗中，選擇熒光轉化子DZJ07-6進行小麥植株定殖能力的研究。

A. 培養4 d的小麥紋枯病菌菌落； B.DZJ07與小麥紋枯病菌對峙培養4 d； C. 熒光轉化子DZJ07-6與小麥紋枯病菌對峙培養4 d。A. The colony characteristics of R. cerealis after 4 days; B. Confront antibiotic culture experiment in DZJ07 and R. cerealis after 4 days;C. Confront antibiotic culture experiment in the transformant strains DZJ07-6 and R. cerealis after 4 days.

表3 七個熒光轉化子對小麥紋枯病菌的抑菌率Tab.3 The inhibition rate of seven fluorescent transformants against wheat Rhizoctonia cerealis %

注：不同小寫字母表示0.05 水平上差異顯著(Duncan多重比較法)。表5同。

Note：Values with different small letters differ significantly at 0.05 level using the Duncan HSD test.The same as Tab.5.

2.5 熒光轉化子DZJ07-6在小麥中的定殖情況分析

小麥種植后的不同時間段，對經熒光轉化子DZJ07-6處理的小麥根際土壤、根和莖組織進行轉化子的分離檢測，結果表明(表4)，小麥生長的第9天可從根際土壤、根和莖組織中分離檢測到轉化子DZJ07-6；隨著小麥植株的生長，根際土壤中的熒光轉化子DZJ07-6數量呈現逐漸下降并趨于平穩的趨勢，截至取樣的第34天，小麥根際土壤中的DZJ07-6含量保持在2.72×106cfu/g ；熒光轉化子在小麥根、莖內的定殖則均呈現出先下降再上升并趨于平穩的趨勢，從第9天的最大值緩慢下降，取樣分離的第18，15天，根和莖組織中的熒光轉化子數量分別達到最低，分別為0.43×104，0.43×103cfu/g，隨后，根、莖組織中的熒光轉化子數量緩慢上升，截至取樣的第34天，小麥根、莖內的熒光轉化子數量分別為0.62×104,2.26×103cfu/g。相應的對照處理中，均無DZJ07-6菌株的存在(表4)。熒光顯微觀察結果如圖6所示，大量DZJ07-6可在小麥根表存活并大量繁殖，且生長34 d的小麥植株的根、莖組織中含有大量DZJ07-6的發光菌株，如圖6-A、C所示，而在對照的根和葉片橫切面中，均未觀察到標記菌株(圖6-B、D)。

表4 小麥植株的根際土壤、根和莖組織中熒光轉化子DZJ07-6的平板分離Tab.4 Platelet separation of fluorescent transformant DZJ07-6 in rhizosphere soil, root and stem tissue of wheat plants cfu/g

注：表中所列數據是3個重復的平均值。表5同。

Note： The data listed in the table is the average of 3 replicates.The same as Tab.5.

A.熒光轉化子DZJ07-6的小麥莖組織； B.對照小麥莖組織；C.熒光轉化子DZJ07-6的小麥根組織 ；D.對照小麥根組織。A. Wheat stem tissue of fluorescent transformant DZJ07-6；B. Control wheat stem tissue；C. Wheat root tissue DZJ07-6 of transformant；D. Control wheat root tissue.

2.6 熒光轉化子DZJ07-6對苗期盆栽小麥紋枯病的防效

小麥播種35 d后統計各處理小麥的發病情況，結果見表5：小麥紋枯病菌組的小麥患病嚴重，病情指數為84.45%；小麥紋枯病菌 + 原始菌株DZJ07處理的小麥與小麥紋枯病菌 + DZJ07熒光轉化子組的小麥植株發病情況相似，病情指數分別為10.02%，10.87%，無顯著差異，說明熒光轉化子DZJ07-6對苗期小麥紋枯病的生防效果沒有因綠色熒光蛋白的標記和表達受到明顯影響。

3 討論

gfp標記的方法是研究靶標微生物與植物互作關系的重要手段。現階段報道的靶標微生物的gfp標記方法多為點擊轉化法，如楊秀榮等[26]利用點擊轉化法將含有gfpmut3a基因的質粒轉入生防枯草芽孢桿菌B579中獲得gfp標記成功的枯草芽孢桿菌B579-gfp并測定其定殖能力；李曉婷等[27]采用點擊轉化法將含有gfp基因的質粒pTRgfp轉入假單胞菌解磷細菌K3中，獲得gfp標記成功的菌株K3GFP并測定其解磷能力；黃貴修等[28]采用原生質體轉化法將gfp表達載體質粒pPKNTG轉入HND5菌株中，獲得穩定遺傳的熒光轉化子。而有關農桿菌介導轉化法在生防真菌gfp標記方面的應用則鮮有報道，僅有吳磊等[29]利用農桿菌介導法將紅色熒光蛋白基因DsRed轉入植物病原菌輪枝鐮孢菌株，觀察其在玉米自交系B73根部的定殖及生長規律以及Luo等[30]利用農桿菌介導法研究白僵菌代謝產物有絲分裂原活化蛋白激酶作用等方面的報道。本研究通過農桿菌介導轉化法，獲得了具有拮抗活性的杜仲內生真菌DZJ07綠色熒光標記轉化子，且插入的外源gfp基因和噻孢霉素抗性基因可在轉化子中穩定遺傳和表達。本試驗獲得的7個熒光轉化子中有2個轉化子的拮抗活性與原始菌株DZJ07相似，而其余的轉化子對小麥紋枯病菌的拮抗活性則顯著降低，究其原因可能是外源基因在微生物體內進行特性表達的同時，也會改變轉化菌株的代謝途徑，增強轉化菌株的代謝負荷，當轉化菌株和其他微生物共同生長的情況下，會處于不利地位，反映在生理特性上，即是轉化子拮抗活性的變化或生長特性等方面的改變。此外，試驗中熒光顯微鏡觀察熒光轉化子DZJ07-6在小麥植株中的定殖情況，發現其首先侵染玉米根系等組織，并在其中大量增殖，然后沿主根向地上部位莖組織侵染，在玉米莖部組織細胞間隙間擴展，截至取樣的第34天，小麥根、莖內的熒光轉化子數量分別為0.62×104，2.26×103cfu/g，說明熒光轉化子DZJ07-6在小麥植株中有較強的適應性，可以在小麥根、莖等組織中較好地定殖。

表5 五種不同處理的小麥紋枯病的發生情況Tab.5 Effect of DZJ07 mycelia on morbidity of Rhizoctonia cerealis

植物內生菌及其代謝產物已成為生防研究的熱點和重點。內生菌能否在土壤或寄主植物中進行有效定殖，對其生防作用的發揮有著重要的作用。目前，利用gfp標記法可對生防菌在植物體及其根際的定殖、擴展和消長規律進行深入研究。如魏春燕等[8]將固氮菌DX120E進行了綠色熒光蛋白基因標記，并對其在甘蔗植株內的定殖進行了分析；田兆豐等[31]對枯草芽孢桿菌Kct99進行了gfp標記，并對其在甘藍根部的定殖方式進行了分析，研究了生防枯草芽孢桿菌的抗病機理。本研究利用綠色熒光蛋白gfp對杜仲拮抗內生真菌DZJ07進行標記，發現外源gfp基因的插入對生防菌的生物學特性以及生防特性無不良影響，DZJ07綠色熒光標記轉化子與原始菌株在菌落形態、生長速度、拮抗活性等方面均有較好的相似性，而且質粒的遺傳穩定性較好，本試驗結果為進一步開展生防菌、病原菌及寄主植物三者之間的互作研究提供了理論基礎。此外，生防微生物的防治效果易受環境因素的影響，本研究僅研究了DZJ07熒光轉化子對小麥紋枯病的溫室防效，而其在其他不同氣候條件下如田間環境中是否依然可以在小麥植株中有效定殖，是否還會對小麥紋枯病有較好的防治效果，這些還有待于深入研究。

[1] Stone J K, Bacon C W, White J J. An overview of endophytic microbes：endophytism defined microbial endophytes[M]. New York： Marcel Dekker, 2000： 3-29.

[2] 胡桂萍，鄭雪芳，尤民生，等.植物內生菌的研究進展[J].福建農業學報, 2010, 25(2)： 226-234.

[3] 丁 婷，孫微微，韓亞惠，等.杜仲內生真菌DZJ07在小麥根際定殖及對根部酶活的影響[J].核農學報, 2015, 29(6)： 1149-1157.

[4] Istifadah N, Saleeba J A, Mcgee P A. Isolates of endophyticChaetomiumspp. inhibit the fungal pathogen Pyrenophora tritici-repentisinvitro[J]. Canadian Journal Of Botany-Revue Canadienne De Botanique, 2006, 84(7)： 1148-1155.

[5] Dingle J, Mcgee P A. Some endophytic fungi reduce the density of pustules ofPucciniareconditef.sp tritici in wheat[J]. Mycological Research, 2003, 107(3)： 310-316.

[6] Istifadah N, Mcgee P A. Endophytic chaetomium globosum reduce development of tan spot in wheat caused by pyrenophora triticirepentis[J]. Australasian Plant Pathology, 2006, 35(4)： 411-418.

[7] 徐玲玲，單慶紅，郭 斌.植物內生菌研究進展及應用展望[J].安徽農業科學, 2013, 41(13)： 5641-5643, 5709.

[8] 魏春燕，邢永秀，莫 遙，等.綠色熒光蛋白基因標記的固氮菌DX120E在甘蔗植株內的定殖[J].作物學報, 2014, 40(6)： 1132-1139.

[9] Tian T, Qi X C, Wang Q, et al. Colonization study of GFP-taggedBacillusstrains on wheat surface(in Chinese)[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2004, 34(4)： 346-351.

[10] Kong H G, Choi K H, Heo K R, et al. Generation of a constitutive green fluorescent protein expression con-struct to mark biocontrol bacteria using P43 promoter fromBacillussubtilis[J]. Plant Pathology Journal, 2009, 25(2)： 136-141.

[11] Peng W, Tan Y J, Huang Y C. Colonization of gfp taggedPaenibacilluspolymyxastrain around tomato roots(in Chinese) [J]. Chinese Journal of Biological Control, 2008, 26(3)： 307-311.

[12] Hao B Q, Ma L P, Qiao X W. Colonization ability of plant growth promotingBacillusB96-Ⅱ-gfp labeled with GFP(in Chinese)[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2010, 18(4)： 861-865.

[13] Zhang Y, Che J M, Liu P, et al. Colonization ofBacilluscereusANTI-8098A in tomato plants and its biocontrol characteristics to bacterial wilt disease(in Chinese) [J]. Chinese Journal of Biological Control, 2011, 27(2)： 221-227.

[14] Fan X J, Qiu S X, Wu X P, et al. EndophyticBacillussubtilisstrain BS-2 labeled with green fluorescent protein gene(in Chinese) [J]. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2007, 13(4)： 530-534.

[15] Singh M K, Kushwaha C, Singh R K. Studies on endophytic colonization ability of two upland rice endophytes,Rhizobiumsp. andBurkholderiasp., using green fluorescent protein reporter[J]. Curr Microbiol, 2009, 59： 240-243

[16] Han Y P, Chen X L, He Z T, et al. Progress, problem and prospect of wheat sharp eyespot research[J]. Journal of Triteceae Crops, 2001, 21(1)： 81-84.

[17] Harman G E. Myths and dogmas of biocontrol： changes in peiceptions derived from research onTrichodermaharzianumT-22[J]. Plant Diseases, 2000, 84(4)：377-393.

[18] Howell C R. Mechanisms employed byTrichodermaspecies in the biological control of plant diseases： the history and evolution of current concepts[J]. Plant Diseases,2002,87(1)：4-10.

[19] 石明旺，茹振剛，牛立元，等.不同小麥品種對小麥紋枯病抗性及產量損失測定的研究[J].河南職技師院學報, 2000, 28(1)： 15-18.

[20] 王玉正，袁永蘭，趙百靈，等.山東省小麥紋枯病危害損失及防治指標研究[J].植物保護學報, 1997, 24(1)： 44-48.

[21] 陳健華，張熾昌，徐東方，等.小麥紋枯病的研究進展[J].現代農業科技, 2011(S1)：69-70.

[22] Wen C Y, Wang K X, Wang M, et al. Colonization trends of endophytic bacteria EBS05 in wheat and its control effect on wheat sharp eyespot[J]. Acta Phytophylacica Sinica, 2011, 38(6)： 481-486.

[23] 林擁軍，張啟發.農桿菌介導的水稻轉基因研究[D].武漢： 華中農業大學, 2001.

[24] 齊永霞，陳方新.球孢白僵菌在玉米根際的定殖及對根際微生物的影響[J].熱帶作物學報, 2013, 34(5)： 962-966.

[25] 古麗君，徐秉良，梁巧蘭，等.生防木霉對草坪土壤微生物區系的影響及定殖能力研究[J].草業學報, 2013, 22(3)： 321-326.

[26] 楊秀榮，田 濤，孫淑琴，等. GFP 標記生防細菌 B579 及其定殖能力檢測[J].植物病理學報, 2013, 43(1)： 82-87.

[27] 李曉婷，董彩霞，楊興明，等.解磷細菌K3的GFP標記及其解磷能力檢測[J].土壤，2010, 42(4)：548-553.

[28] 黃貴修，時 濤，劉先寶，等.臂形草內生真菌HND5的GFP標記及其抑菌作用[J].中國生物防治, 2010, 26(3)： 320-326.

[29] 吳 磊，王曉鳴，徐榮旗，等.利用紅色熒光蛋白標記的輪枝鐮孢研究病原菌對玉米根系的系統侵染和定殖[J].作物學報, 2011, 37(5)： 793-802.

[30] Luo X D, Keyhani N O, Yu X D, et al. The MAP kinase Bbslt2 controls growth, conidiation, cell wall integrity, and virulence in the insect pathogenic fungusBeauveriabassiana[J]. Fungal Genetics and Biology, 2012, 49(7)： 544-555.

[31] 田兆豐，劉偉成，董 丹，等.生防枯草芽孢桿菌Kct99的GFP標記及其在甘藍根部的定殖示蹤[J].華北農學報, 2012, 27(6)： 53-57.