噬菌體裂解酶結構域重構及其裂解功能分析

張 輝，周 艷，包紅朵，楊振泉，朱如意，周晨露，張莉莉，王 冉，2

(1.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095; 3.揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225009)

噬菌體裂解酶(Bacteriophage lysin)是噬菌體在感染宿主末期表達的晚期蛋白，它通過水解細菌細胞壁的肽聚糖使子代噬菌體釋放，從而殺死細菌[1]。由于其殺菌高效、作用特異且不易產生耐受等特性，已成為新藥及抗菌制劑的優選[2-3]。目前有關金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和單核細胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下簡稱李斯特菌)噬菌體裂解酶報道不斷涌現，前期已有LysZ5用于豆漿及LysH5應用于牛奶的致病菌生物防控[4-5]，亦有將裂解酶用于動物模型治療眼內炎等的研究報道[6]，然而由于裂解酶具有種屬特異性，其結構域的特殊性，使酶作用范圍受到局限，因此不得不將其進行多功能設計，從而滿足其廣譜的需求。

裂解酶及其他水解酶具有特殊的結構域，其作用方式及模塊都有所不同，如肺炎球菌噬菌體裂解酶的Cholin-binding 結構域發揮重要催化功能[7]，而金黃色葡萄球菌及乳球菌以細胞壁水解功能為主[8-9]，李斯特菌噬菌體裂解酶則以酰胺酶為主[10]。雖然裂解酶因其結構功能的特性被分為不同類型，但其最根本還是以酰胺酶及內肽酶為主要作用形式。在這些酶中，有一類常見的蛋白家族CHAP (Cysteine，histidine-dependent amidohydrolase/peptidase)，在作為催化結構域時其表現為酰胺酶活性亦會表現出內肽酶的功能，在裂解過程中發揮重要作用。金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK及Φ11具有高度同源的N末端CHAP及酰胺酶結構域[11-12]，因此，將其CHAP作為主要催化基團，并加入特殊的細胞結合結構域(CBD)SH3b(Bacterial src homology 3)，將有望放大其裂解功能[6]。而針對李斯特菌噬菌體，與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶裂解功能類似，其也是通過催化切割 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺殘基將宿主細胞壁裂解，其裂解酶CBD不僅為種屬特異，甚至是血清或菌株特異[13]，因此，將其與金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的酰胺酶活性進行結合，其多功能活性將會同時作用于2種病原菌。針對前期研究報道，將金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187-KS和李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5進行結構域結合設計[6]，構建出能夠同時裂解2種致病菌的重構酶，并對該酶進行裂解鑒定和抑菌分析，為今后廣譜抗菌裂解酶的研制及開發提供新思路。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)、金黃色葡萄球菌 ATCC25923，用TSB在37 ℃培養；李斯特菌分離株Lm007(血清型2a)，用BHI在30 ℃培養；質粒pET 28a及質粒pET-LysZ5[5]，以上試驗材料均由江蘇省畜禽產品安全性研究重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TSB-YE、LB肉湯、瓊脂等購自北京陸橋技術有限責任公司；腦心浸液(BHI)購自美國BD公司；DNA Marker、限制性內切酶等分子生物學試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；BCA蛋白定量測定試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；Ni2+-NTA親合層析柱購自GE公司；PEG8000等生化試劑等購自汕頭市西隴化工廠有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 表達質粒構建 質粒ply187-KS序列參考文獻[7]合成并插入原核表達載體pET 28a相應酶切位點，即構成表達質粒ply187-KS，將裂解酶LysZ5 C末端CBD以LysZ5為模板PCR擴增并克隆至ply187-KS序列下游，構建出ply187KS-Z5重構酶融合表達質粒，PCR及測序鑒定其正確性。

1.2.2 重構酶質粒在大腸桿菌中的表達 將質粒ply187-KS及ply187KS-Z5分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)篩選陽性克隆，挑取克隆鑒定并通過IPTG進行小量誘導表達，通過IPTG在26 ℃誘導4 h，收集菌體并通過超聲波破碎，離心過濾上清，SDS-PAGE鑒定蛋白表達情況。

1.2.3 蛋白的純化及裂解活性鑒定 將表達正確的克隆接種LB中(Kan 50 μL/mL)，37 ℃過夜培養，次日以1∶100再次轉接至100 mL LB中，于OD600在0.5～0.8 h，加入1 mmol/L IPTG 進行誘導，并再次置于26 ℃搖振培養5 h；4 ℃，8 000 r/min離心10 min，PBS重懸，超聲波破碎細胞，離心收集上清，Ni2+-NTA親合層析柱純化表達蛋白。BCA法測定蛋白濃度，并對不同濃度蛋白進行平板點樣分析其裂解活性及裂解范圍。

1.2.4 MIC試驗 將酶蛋白從100 μg進行倍比稀釋，即100.000 0，50.000 0，25.000 0，12.500 0，6.250 0，3.125 0，1.562 5 μg分別加入100 μL菌液，置于37 ℃，分別在15，30，60 min測定其OD600，分析最小抑菌濃度。

1.2.5 生肉表面抑菌分析 將生牛肉切成4 cm × 4 cm 肉塊，表達用70%無水乙醇進行殺菌消毒，待表面干燥后，均勻滴加105cfu 金黃色葡萄球菌和105cfu 李斯特菌，同時設立單獨菌株對照及PBS空白對照；待菌液吸收后，再次分別滴加酶蛋白50 μg/100 μL(濃度以MIC結果為準)，作用1，2，3 h后，分別將肉切成小塊置于錐形瓶中，加入PBS振搖1 h，取上清檢測細菌數量。

2 結果與分析

2.1 重構酶的鑒定及表達純化

質粒通過限制性內切酶消化及PCR方法鑒定表明，構建的片段大小與預期相符，測序結果表明，所構建的質粒中重構酶序列正確。將質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，對鑒定正確的克隆進行小量誘導表達，表達結果表明所構建的重構酶Ply187KS-Z5在上清中為可溶性表達，蛋白大小約為58 kDa，Ply187-KS約37 kDa，二者均與預期相符(圖1)。

A.表達上清；B.純化蛋白；M.蛋白分子量；1.Ply187-KS；2.Ply187KS-Z5。A.Supernatant of whole expression strain; B. Purified protein;M.Protein Marker; 1.Ply187-KS;2.Ply187KS-Z5.

2.2 重構酶的酶活性檢測

對純化的裂解酶Ply187-KS及重構酶Ply187KS-Z5進行裂解活性鑒定，將純化蛋白均點樣于金黃色葡萄球菌 ATCC25923平板，作用8 h后觀察，重構酶Ply187KS-Z5及Ply187-KS均能裂解金黃色葡萄球菌，從圖2-A中可以看到明顯的抑菌圈，即結構域的重組并沒有影響裂解酶對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。同樣將重構酶作用于李斯特菌時(圖2-B)，其與裂解酶LysZ5均能產生透明的裂解圈，與此同時，Ply187-KS不能夠裂解李斯特菌，LysZ5對金黃色葡萄球菌無裂解作用。由此可見，重構酶Ply187KS-Z5能夠同時裂解金黃色葡萄球菌及李斯特菌。

A.金黃色葡萄球菌；B.李斯特菌。A.Staphylococcus aureus; B.Listeria monocytogenes.

2.3 MIC檢測最佳抑菌濃度

BCA法測定蛋白濃度，其純化蛋白濃度均高于1 mg/mL，純化效率較高。通過不同時間測定OD600表明，裂解酶Ply187-KS及重構酶Ply187KS-Z5的MIC分別為40，48 μg/mL。 因此，在應用中以其MIC為參照標準。

2.4 在食品中的抑菌效果評價

將裂解酶Ply187-KS及重構酶Ply187KS-Z5分別應用于生牛肉表面，分析其在表面的抑菌活性，結果裂解酶Ply187-KS在作用1 h 后，金黃色葡萄球菌降至1.72 log，重構酶Ply187KS-Z5能夠將其降至2.16 log；而在李斯特菌抑菌組中，Ply187KS-Z5能夠將其降至2.02 log，Ply187-KS無抑菌效果(圖3)。由此表明，重構酶Ply187KS-Z5能夠同時抑制金黃色葡萄球菌及李斯特菌在生牛肉表面的污染。

圖3 重構酶在生肉表面的抑菌效果分析Fig.3 Inhibition activity of reconstruction lysin on raw beef

3 討論

針對金黃色葡萄球菌高度耐藥以及食源性李斯特菌污染及對化學消毒劑的抵制[14-16]，應用噬菌體裂解酶已有報道，然而裂解酶具有高效特異的特征，如何使其能作用快、范圍廣更能滿足不同需求，就需要進行相應的完善。先前的研究中提到裂解酶在多次使用后并不產生抗性[17-18]，通過其結合結構域作用于細胞壁，水解細胞壁最終摧毀細胞，作用高效且不易產生抗性。研究首次利用金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Ply187 N端的內肽酶活性，在其C端引入金黃色葡萄球菌 SH3b區域(Cell wall-binding domain，CBD)及李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5的C末端CBD區域的 191 aa，嘗試獲得能夠同時裂解金黃色葡萄球菌及李斯特菌的重構裂解酶，分析結構域重構是否與全長擁有同樣的裂解效果，從而改善多種酶融合導致的表達效果不高或失敗等問題[6]。

針對其融合蛋白表達活性分析表明，酶蛋白均有部分可溶性表達，通過表達純化，能夠獲得毫克級的蛋白量，先前有研究證實裂解酶抑菌量可達102～108cfu/mg[19]，而在研究中其抑菌總量可大于106，表明其良好的殺菌活性。在平板中，重組裂解酶蛋白能夠在菌毯表面形成透明裂解圈，在作用1～3 h后，在金黃色葡萄球菌及李斯特菌平板均能觀察到抑菌圈逐漸清晰，由此表明，重組酶蛋白能夠有效抑制2種菌的生長。對其酶活性分析表明，Ply187-KS針對金黃色葡萄球菌較Ply187KS-Z5更佳，這有可能是蛋白分子量較高后導致的反應活性降低，而對李斯特菌Ply187KS-Z5亦有良好的裂解活性。MIC結果表明，2種蛋白最小抑菌濃度有所不同，其中Ply187-KS較重構酶抑菌工作濃度低。此外，將Ply187-KS及李斯特菌噬菌體裂解酶LysZ5進行等量混合并同時作用2種菌后，其抑菌效果良好，但其用量較重構酶高(分別為 60，80 μg/mL)。研究亦證實，Ply187-KS并不會在多次使用后作用力降低，即不產生抵制現象，從而免除了蛋白類抑菌制劑產生耐受等隱患[6]。由此可見，裂解酶結構域重構可以作為多功能酶蛋白構建的新方法[20]，而把裂解酶蛋白進行有效配比亦能獲得的復合裂解效果也將是獲得廣譜抗菌的新途徑。此外，亦有將多肽等小分子進行聯合構建等方法使酶譜擴大[21]，同樣早期還有將酶與抗生素聯用等發揮協同抗菌等的研究[22]，這些不僅能放大酶的作用同時也會降低抗生素的用量，都將會給裂解酶產品的開發提供依據。

將重構酶進行抑菌應用效果分析，在作用1 h后，能夠分別抑制金黃色葡萄球菌及李斯特菌的生長，Ply187-KS及Ply187KS-Z5均能夠抑制金黃色葡萄球菌，作用效果相當，但同時也能夠有效抑制2種病原菌的生長，目前還沒有將2種菌進行重構的報道，從而表明其在廣譜活性研發方面，結構域的重組將具有良好的開發潛力。目前，已有嵌合裂解酶如ClyS、P128等進入了臨床試驗階段，美國Contrafect公司也推出針對金黃色葡萄球菌的酶產品CF-301，因此，通過結構域的重新結合將有可能獲得更為高效的多功能酶產品。

由于裂解作用高效，在30 min就能夠發揮效果，且在抑制菌的過程中自身亦會隨著時間的增加而降解，因此，無殘留不易產生抗性。面對目前的耐藥現狀，裂解酶顯示其較抗生素優越的特征，在未來抗菌藥物開發過程中都具有潛在的價值，而結構域重構能夠使酶獲得多重功能且不影響其活性，必將成為新型功能酶合成的全新方式。

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