糧棉輪作對土壤中養分及真菌多樣性的影響

趙存鵬，郭寶生，劉素恩，王兆曉，耿 昭，王凱輝，耿軍義

(河北省農林科學院 棉花研究所，農業部黃淮海半干旱區棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051)

棉花是我國主要的經濟作物，在農業生產中占有重要的地位。河北省中南部黑龍港流域地區是我國黃河流域棉花生產的優勢區域，但由于作物結構相對單一、重茬連作現象非常嚴重，導致土壤速效養分含量下降，理化性狀變差，土壤酶活性降低，微生物群落結構失衡[1-2]，從而使棉花體內的各種酶活性改變，生長發育受阻，枯黃萎病和棉鈴疫病快速蔓延，產量和纖維品質都受到了影響。

微生物是土壤中重要的有機體系，具有調節植物生長的養分循環，維持土壤中的碳氮循環，分解有機廢棄物等作用[3]。根系分泌物對微生物具有選擇作用，連作土壤可使微生物的物種多樣性和功能多樣性水平降低，給植物病原微生物生長繁殖創造了條件，并通過富集，使土傳病害加重[4-5]。不同的種植模式可以通過對土壤的理化性質、微生物的環境條件和作物間化感作用來改變土壤微生物的群落結構和功能[6]，土壤的群落特征比土壤有機質、養分含量等理化性狀能更敏感地對土壤的變化做出響應[7]。利用輪作的種植模式在大豆、馬鈴薯、黃瓜等作物上均發現土壤中的微生物活性有了明顯的改善[5，8-11]。

隨著近年來水利條件的逐步改善，冀中南棉區具備了種植糧食作物的條件，華北地區的光熱條件充足為棉花-小麥-玉米糧棉輪作兩年三熟提供了生態條件。合理倒茬輪作有利于提高該區域土壤生產能力，提高棉花的生物學產量及籽棉產量[12]，因此，在河北省中南部傳統連作棉區發展糧棉輪作兩年三熟種植模式，有利于提高復種指數，在實現穩定棉花生產的同時，大幅度提高河北省糧食的增產能力。

本研究為了提高傳統棉區糧棉綜合生產能力，開展了在連作棉田、棉花-小麥-玉米兩年三熟輪作種植模式下，土壤養分和微生物的變化研究，以期為冀中南連作棉田合理倒茬輪作、提高土壤產出率提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 試驗概況

試驗地在河北省南宮市棉花原種場長期定位試驗點進行，該試驗點地理位置為37°16′N，115°26′E，屬黃河沖積平原，地勢平坦，海拔為30 m左右。土壤類型為潮土。屬溫暖帶亞濕潤大陸性季風型氣候區，年平均氣溫13.1 ℃，無霜期203 d，年日照時數2 472 h，年平均降雨量476 mm。

試驗點自1976年成立以來，試驗地及周邊一直以種植棉花為主，特別是轉Bt基因棉花推廣以來，試驗地在試驗前的近20年間種植的均為抗蟲棉。試驗設有2個處理，即連作模式的棉田和糧棉輪作的小麥田、玉米田。每個試驗小區長70 m，寬10 m，面積為700 m2。每個處理3次重復，隨機區組排列。播種前一次施用復合肥為底肥，用量為N 225 kg/hm2，P2O5120 kg/hm2，K2O 180 kg/hm2。棉花蕾鈴期(玉米播種時)追施N 150 kg/hm2。

試驗自2013年開始，連作棉田于每年4月下旬播種棉花，10月下旬收獲；糧棉輪作兩年三熟試驗則是在收獲棉花后，馬上整地播種冬小麥，2014年6月收獲小麥播種玉米，2015年4月再種植棉花。種植棉花品種為冀2658，小麥品種為邢麥7號，玉米品種為聯創808。各種作物栽培管理按照相應的品種要求進行，作物秸稈均做還田處理。

1.2 樣品采集與處理

分別于2016年4月(連作棉田整地施用底肥后棉花播種前)、6月(玉米播種后)、8月(棉花花鈴期)、10月(作物收獲后)采集地下5～25 cm耕層的土樣，每個小區采用Z字形取土法取8點，8點土樣混勻剔除植物殘體，用四分法保留500 g左右，一部分土樣自然攤晾，風干后過2 mm 篩用于土壤養分測定，另一部分鮮土樣保存于-80 ℃冰箱中，用于微生物多樣性分析，為了方便測序和數據分析將連作棉田標為字母MIANH，4，6，8，10月分別標為MIANH1、MIANH2、MIANH3和MIANH4；糧棉輪作模式土壤則標為XIAOM，4，6，8，10月分別標為XIAOM1、XIAOM2、XIAOM3和XIAOM4。

1.3 土壤養分測定

土壤全氮的測定采用凱氏定氮法；土壤速效磷的測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；土壤速效鉀的測定采用乙酸銨浸提-原子吸收火焰光度計法[13]。

1.4 土壤總DNA的提取和測定

使用美國MPBIO公司的FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒，依照試劑盒說明提取土壤總DNA。提取后的DNA溶液用超微量紫外分光光度計測定其純度和濃度，濃度>50 ng/μL的樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后檢查片段是否完整，檢查合格后存放在-80 ℃冰箱保存待測序。將凍存的土壤總DNA樣品干冰包裝送至北京百邁客生物科技有限公司，應用Illumina HiSeq 2500平臺進行高通量測序。

1.5 數據處理與分析

測序完成后對原始數據經過QIIME軟件進行拼接[14]，將拼接得到的序列進行質量過濾[15]，并去除嵌合體[16]，得到高質量的Tags序列。利用物種分類的 OTU(Operational taxonomic units)，在相似性97%的水平上對序列進行聚類[17]，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾OTU[18]。

物種注釋采用RDP Classifier[19]，置信度閾值為0.8(http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)。利用的數據庫為真菌 ITS：Unite[20](Release 7.0,http://unite.ut.ee/index.php)。

微生物多樣性分析采用alpha指數分析和Beta多樣性分析。利用Mothur軟件(v1.30)進行alpha分析[21]；基于R語言平臺繪制樣本主成分分析、主坐標分析以及環境因子與樣本組成相關性分析。組間差異顯著性分析采用LefSe (http：//huttenhower. sph.harvard.edu/lefse/)分析尋找在所有組間具有顯著性差異的物種(LDA值為4.0)，再利用Metastats (http://metastats.cbcb.umd.edu/)對組間的物種豐度數據進行t檢驗得到P值，并對P值進行校正得到q值；最后根據P值(或q值)篩選出導致2組樣品組成差異的物種。

2 結果與分析

2.1 不同種植模式下土壤養分變化

通過不同時期對不同種植模式試驗區土壤取樣分析表明，由于周年生產土地上作物生育期變化和作物類型變化及田間施肥澆水的變化，土壤中氮、磷、鉀的含量處于動態變化之中。在棉花和玉米收獲時，不同種植模式下，土壤中氮、磷、鉀類營養元素的殘留，更能反映出輪作后土壤養分變化趨勢。截止到10月下旬輪作結束后，輪作模式土壤全氮、速效磷殘留含量比連作棉田顯著增加，而速效鉀則差異不顯著(表1)。此外，糧棉輪作模式的土壤中在8月的全氮、速效磷、速效鉀含量顯著高于棉花連作的地塊，可能是由于小麥秸稈還田增加了土壤中養分的含量，速效鉀在全年的差異主要為棉花對鉀肥的需求量大于小麥、玉米對鉀肥的需求。根據分析不同輪作制度下土壤養分的殘留量認為，棉花-小麥-玉米兩年三熟輪作模式下，種植小麥、玉米后，可減少接茬棉花鉀肥施用量。

表1 不同種植模式下各樣地土壤養分含量Tab.1 The condition of soil nutrient under different cotton planting patterns

注：表中數據為平均值±標準差；同列數值后不同字母表示處理間差異達顯著水平(P<0.05)。表2-3，6同。

Note：Data areX± s; Values followed by different letters in a row are significant among treatments at the 0.05 level. The same as Tab.2-3,6.

2.2 不同種植模式下土壤真菌測序結果及OTU分析

本研究24個樣品測序共獲得1 631 343條有效序列，平均每個樣品的測序深度為67 973條有效序列。在97%的相似度水平下，通過聚類得到各樣品的OTU個數，OTU越多，則證明菌群的多樣性越大。糧棉輪作模式下真菌群落的多樣性較棉花連作模式下豐富，OTU個數分別為783，750個。2種模式共有的相似菌群為693個，糧棉輪作模式土壤有90個特有菌群，棉花連作土壤有特有菌群57個。表2為各組各時期的測序結果，從表中可以得到連作棉田進行輪作后能夠增加土壤微生物菌群數量，特別是在6月，小麥收獲后，糧棉輪作的土壤微生物多樣性明顯大于棉花連作的土壤，為全年微生物最為活躍的時間點。

表2 不同種植模式下土壤真菌測序結果Tab.2 The results of fungi sequencing of soil under different cotton planting patterns

2.3 不同種植模式對土壤真菌的Alpha多樣性的影響

2種種植模式下，土壤真菌的Alpha多樣性指數存在明顯的差異(表3)。多樣性指數Shannon僅在6月棉花連作和糧棉輪作模式中差異達到顯著水平，其他時間在2種種植模式中差異均不顯著。6月的糧棉輪作模式中的ACE指數和Chao1指數均顯著高于棉花連作模式中的指數，同時糧棉輪作模式中Shannon指數又顯著低于棉花連作模式中的指數，這主要是由于在小麥收獲后，玉米剛播種，試驗田真菌的多樣性較大，但個體間的分配很不均勻造成的，說明種植作物的改變直接影響著真菌的種類和數量的變化。通過分析土壤養分與真菌群落的個數及Alpha多樣性指數的Pearson相關性(表4)可以得知，OTU數與土壤全氮、速效鉀的含量具有顯著相關性，Alpha多樣性指數也與土壤全氮、速效鉀的含量具有顯著相關性。

表3 不同種植模式下土壤中微生物 Alpha 多樣性指數分析Tab.3 Alpha diversity index of soil fungi under different cotton planting patterns

表4 OTU個數、Alpha多樣性指數與土壤化學性質 Pearson 相關性分析Tab.4 Pearson correlation coefficients between OTU number，Alpha diversity index and soil chemical

注：*. 0.05 水平具有顯著相關性。

Note：*.Correlation is significant at the 0.05 level.

2.4 不同種植模式對土壤真菌群落組成的影響

將OTU的代表序列與微生物參考數據庫進行比對可得到每個OTU對應的物種分類信息，進而在各個水平上統計各樣品群落的組成。圖1為2個種植模式下不同時間點土壤真菌微生物門水平的組成，主要包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)等，此外還有一部分真菌目前還未知。連作棉田中子囊菌門所占的比例為32.12%～64.21%，擔子菌門所占的比例為12.11%～23.38%，接合菌門所占的比例為5.19%～15.97%，壺菌門所占的比例為0.33%～1.19%，球囊菌門所占的比例為0.16%～2.15%；而輪作模式土壤中子囊菌門所占的比例為34.60%～45.03%，擔子菌門所占的比例為8.49%～22.10%，接合菌門所占的比例為3.99%～14.86%，壺菌門所占的比例為0.44%～1.88%，球囊菌門所占的比例為0.21%～1.51%。從圖中看，不同的種植模式在不同時間點的真菌微生物的相對豐度差異較為明顯。通過微生物組成與土壤化學性質Pearson相關性分析(表5)，可知子囊菌門、擔子菌門、壺菌門、球囊菌門與土壤的養分含量間沒有明顯的相關性，而接合菌門與土壤的養分呈極顯著的負相關。

圖1 不同種植模式下土樣中微生物門水平的組成Fig.1 Relative abundance of soil fungi at phylum level under different cotton planting patterns

表6為不同種植模式下土壤微生物綱水平的組成，從表中可以得知，座囊菌綱(Dothideomycetes)在連作模式中的相對豐度為2.20%～17.97%，4月時相對豐度最高，與其他時間點的差異達到顯著水平，在輪作模式中的相對豐度為5.16%～9.76%，各時間點差異不顯著。球囊菌綱(Glomeromycetes)在連作模式和輪作模式中4月的相對豐度較低分別為0.16%和0.21%，但在6月的相對豐度分別達到1.45%和1.50%，8,10月在連作模式中的相對豐度為2.14%和1.39%，而同期在輪作模式中的相對豐度為0.30%和0.23%，它們之間的差異達到顯著的水平，可能是種植玉米會減少球囊菌綱的豐度。

表5 微生物組成與土壤化學性質 Pearson 相關性分析Tab.5 Pearson correlation coefficients between soil chemical characteristics and microbial compositions

注：**.0.01 水平具有顯著相關性。

Note：**.Correlation is significant at the 0.01 level.

表6 不同種植模式下土樣中微生物綱水平的組成(8 組中至少有 1 組的相對豐度>1%)Tab.6 Relative abundance of soil microorganisms under different cotton planting patterns(At class level, at least one group in eight groups relative abundance>1%) %

2.5 不同種植模式對土壤真菌群落的聚類分析

通過聚類分析，將具有相似Beta多樣性的各樣本聚類在一起，各處理的結果顯示本研究主要聚類為兩大分支(圖2)，即不同的種植模式，各小分支也基本按照取樣的時間點進行聚類。采用Beta多樣性中主坐標分析法(Principal coordinates analysis，PCoA)分析結果如圖3，經分析計算得出PC1為28.92%，PC2為11.91%。不同種植模式下的土壤樣品被完全區分，表明連作棉田輪作后，土壤微生物菌群和數量發生較大變化。

圖2 不同種植模式不同時間點的Beta多樣性分析Fig.2 Beta diversity analysis of soil fungi under different cotton planting patterns of different times

橫、縱坐標為導致樣品間差異最大的2個特征值，以百分數的形式體現主要影響程度。Horizontal, vertical, to lead to difference between samples of the two largest eigenvalues, influence extent embodies mainly in the form of a percentage.

采用LEfSe(Line discriminant analysis(LDA)effect size)分析繪制進化分支圖(圖4)。通過分析表明，連作棉田實行與小麥玉米輪作種植后，土壤微生物菌群變化情況如下：在目水平上分別是散囊菌目(Eurotiales)、傘菌目(Agaricales)和糞殼菌目(Sordariales)，散囊菌目、傘菌目顯著減少，而糞殼菌目顯著增加。科水平上傘菌科(Agaricaceae)顯著減少，毛球殼科(Lasiosphaeriaceae)顯著增加。屬水平上分別為柄孢殼菌屬(Podospora)的數目顯著增加，白環蘑屬(Leucoagaricus)的數目顯著減少。

3 討論與結論

土壤中微生物的多樣性與植被變化有很大關系，植物凋落物或殘留物中碳氮的生化組成、可利用程度、土壤養分含量等均影響著土壤微生物的多樣性[22-23]。

國內外學者對作物連作問題進行了長期大量的研究，發現隨著連作年限增加，土壤容重相應增加，作物產量則會降低，土壤中真菌數量增加，細菌和放線菌數量減少，連作會使土壤有機質含量減少，有害生物逐漸累積，最終會抑制作物的生長[24-26]。適宜的作物輪作能夠減少連作障礙，改善土壤物理性質，促進土壤生物化學過程，提高土壤酶活性，改變土壤微生物區系，引起菌群組成結構發生變化，使土壤中微生物活性增強，有害微生物減少[27]。輪作會增加植物的多樣性，種植的作物及其殘茬對微生物的群落及其活性產生顯著影響[28-29]。

進化分支圖由內至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統一著色為灰色，其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色。The cladogram radiation from inner to outer circle represents the from the phylum to species on the classification of the level;At different classification level, each small circle represents a classification at this level, and the size of the small circle is proportional to the relative abundance;Principle to be no significant difference of species uniform color is gray, the other differences between species according to the species abundance highest grouping staining.

特別是輪作使有益微生物如固氮菌等增加，有害微生物如腐霉菌和鐮孢菌等減少，土壤微生物活性增強。輪作微生物的數量大于連作，細菌和放線菌數量增多，真菌減少。輪作還提高了土壤微生物量碳氮比，改善土壤微生態環境，增加土壤微生物群落多樣性，在一定程度上消除連作障礙，避免土傳病害的發生，有利于提高作物產量和品質[30]。

隨著棉花向優勢區域集中發展，我國棉花連作問題日益凸顯，棉花連作對土壤微生物及養分影響等問題的研究工作已引起關注。首先棉花連作會造成土壤養分不均衡，一些研究結果認為土壤速效鉀含量隨棉花連作年限而明顯降低，多酚氧化酶隨連作年限增加呈現出下降趨勢[31]。本研究分析發現，不同作物對土壤中營養元素的吸收和利用存在偏好性。在棉花、小麥、玉米兩年三熟輪作模式下，種植小麥、玉米后，可減少接茬棉花氮、磷肥施用量，本研究合理解釋了“倒茬如上糞”這一農諺現象。

其次，棉花是受病蟲害為害較大作物，特別是枯、黃萎病和棉鈴疫病，呈普遍發生趨勢，這些病害主要由腐生和寄生真菌引起。Acosta-Martinez 等[32]發現，采用棉花-小麥-玉米輪作比連作更有利于提高土壤細菌多樣性，本研究通過土壤DNA高通量測序技術分析2種種植模式的土壤樣品，結果顯示，通過輪作能夠提高土壤真菌的多樣性并減少包含許多腐生和寄生有害真菌的散囊菌目菌群種類和數量。隨著微生物基因組數據庫的豐富，土壤DNA高通量測序技術能夠科學準確地反映土壤樣品微生物成分和含量，并且不需要進行土壤微生物的培養和分離。本研究還發現，連作棉田含有大量的傘菌科菌群，是由于棉籽殼和棉花秸稈碎渣可以作為傘菌科眾多食用菌良好的培養料。當前大部分棉田實行棉花秸稈粉碎還田，多年連作為傘菌科菌群的發展提供了較好的營養條件。糞殼菌屬、柄孢殼菌屬和糞盤菌屬菌群大多腐生于富含有機質的土壤和植物殘體上。本研究中這類菌群數量的增加，說明連作棉田輪作小麥、玉米等禾本科作物后，能夠增加土壤有機質，為糞殼菌屬、柄孢殼菌屬和糞盤菌屬菌群提供了較好的生長發育條件。綜合分析可以看出，通過棉糧輪作，土壤中的微生物優勢菌群發生明顯變化，減少了土壤中有害真菌數量，合理解釋了采用輪作后棉田病害較輕的現象。

通過以上一系列試驗分析得出如下結論：通過輪作制度能夠實現土壤養分的殘效利用并改變土壤養分結構，為茬口銜接節肥技術的實施提供了依據。棉糧輪作后明顯改變了土壤中微生物優勢菌群，有害菌群明顯減少。因此，開展合理的棉糧輪作有助于改良冀中南連作棉田土壤營養狀況，有利于增產增收、糧棉雙豐。

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