三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)FABP基因克隆及其在卵巢發育過程中的表達特征研究*

嚴珂爾 母昌考, 王春琳, 李榮華, 楊春雷

(1. 寧波大學應用海洋生物學教育部重點實驗室 寧波 315211; 2. 浙江海洋高效健康養殖協同創新中心 寧波 315211;3. 象山鶴浦鎮人民政府海洋與漁業辦公室 象山 315733)

脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding proteins,FABPs)是一類小分子量的(14—15kDa)可溶性蛋白,在無脊椎動物中廣泛存在。FABP能與脂肪酸特異性結合, 是細胞內轉運脂肪酸相當重要的蛋白, 它能夠將脂肪酸從細胞膜運送到甘油三酯和磷脂合成或分解的位點, 主要調節脂類代謝。FABP最早是從沙漠蝗蟲中分離出來(Esteves et al, 2006), 現已發現9種組織特異性的胞內 FABP: 肝臟型、腸型、心臟型、脂肪細胞型、表皮型、回腸型、腦型、髓鞘型和睪丸型FABP。FABP參與了生物體的很多生命過程(Storch et al, 2009), 除了脂肪酸的攝取、轉運及代謝調節外,還有信號轉導、膜合成、酶活力的調節、參與免疫反應的調節作用(Fu et al, 2000)等。有大量研究表明, 脂類在蟹類性腺發育、生殖中起著極其重要的作用。蟹類的卵巢發育過程中, 尤其是卵黃合成期, 卵巢中積累了大量的脂類, 這些脂類將是后續胚胎發育重要的能量來源。三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)俗稱白蟹, 屬于甲殼綱、十足目、梭子蟹科, 是中國沿海的重要經濟蟹類, 其卵巢發育一般分為 6期(吳旭干等, 2007)。在三疣梭子蟹的卵巢中共檢測出34種脂肪酸, 而這些脂肪酸的數量和質量對胚胎發育具有很大的影響(Lautier et al, 1988)。在三疣梭子蟹中尚未見有關于脂肪酸代謝相關研究的報道。本研究以三疣梭子蟹為材料, 克隆獲得 FABP基因全長 cDNA,進行了組織表達特征研究并分析了卵巢發育過程中表達水平的變化, 初步探討三疣梭子蟹脂肪酸結合蛋白與卵巢發育的關系, 以及為三疣梭子蟹卵巢發育分子機制的解析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 組織取樣

實驗所用三疣梭子蟹由寧波鑫億鮮活水產有限公司提供。對梭子蟹低溫麻醉后進行活體解剖, 分別取卵巢、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、眼柄和血淋巴細胞等組織和細胞存于–80℃用于RNA抽提。其中不同發育階段卵巢通過定期取樣檢測后進行取樣, 其他組織均取自卵巢發育 IV期的雌蟹。每個組織均取 6只蟹。卵巢發育程度參考吳旭干等(2007)等的方法進行確定。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

RN A采用RNA isoTMPlus (TaKaRa)試劑盒按照操作說明書的方法進行抽提。取1μL RNA用于凝膠電泳檢測RNA的完整性。取1μL RNA進行微量紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度。cDNA的合成取2μg RNA采用TransScript第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。用于3′ RACE的cDNA采用3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase (TaKaRa), 按照說明書操作步驟合成。

1.3 三疣梭子蟹FABP基因cDNA全長克隆及測序

根據實驗室前期測序獲得的三疣梭子蟹FABP的EST片段, 利用primer 5.0軟件設計3′RACE特異性引物(表 1)。FABP 的 3′ RACE 特異性引物為 3′ FABP1和 3′ FABP2。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳并純化后連接到pMD18-T載體, 轉化至E. coliDH5α挑選陽性克隆進行測序(華大基因公司)。

表1 本研究所用引物序列及其Tm值Tab.1 The sequences of primers and their Tm

1.4 三疣梭子蟹FABP基因序列分析

將測序獲得的序列進行比對分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。全長序列 ORF的分析利用在線ORF Finder網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。將根據 cDNA序列推導的氨基酸序列利用 ExPASy網站(http://www.expasy.org/tools/)提供的分析工具進行蛋白質一級序列分析, 如理化性質、親疏水性等。信號肽分析采用 SignalP 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/), 結構域利用SMART網站來進行分析(http://smart.embl-heidelberg.de/), 同源性分析采用Cluster X多序列比對軟件, 系統進化樹采用Mega軟件包中的鄰接法(NJ)構建。

1.5 實時熒光定量PCR

本研究選用β-actin作為內參基因(表1), 根據擴增得到的三疣梭子蟹FABP基因全長序列, 設計實時熒光定量引物 FABP-qF和 FABP-qR, 運用實時熒光定量技術分析PtFABP在三疣梭子蟹不同組織和卵巢發育各階段的表達特征。熒光定量 PCR的擴增體系為 20μL, 其中包括 TransStart Tip Green qPCR SuperMix (2×) 10μL, 正向引物(10μmol/L) 0.4μL, 反向引物(10μmol/L) 0.4μL, Passive Reference Dye (50×)0.4μL, cDNA 模板 1.0μL, DEPC 水 7.8μL。反應程序為: 94 ℃ 3 0s; 94 ℃ 5 s, 60 ℃ 3 0s, 40個 循環; 95 ℃ 15s,60 ℃ 1.0min, 95 ℃ 1 5s 。熒光定量PCR檢測結果采用2–ΔΔCt方法進行分析(Livaket al, 2001), 數據均以平均值±標準差(mean±SD)表示, 經 SPSS19.0軟件進行方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 三疣梭子蟹FABP基因cDNA全長及序列分析

將測序結果進行分析和拼接后獲得總長為893bp的FABP全長cDNA序列(圖1), 包括289bp的5′端非編碼區(5′ UTR), 199bp 的 3′端非編碼區(3′ UTR)和405bp的開放閱讀框(ORF)。采用ProtParam tool 軟件預測FABP分子式為C664H1065N175O211S8, 分子量大小為15.13kDa, 理論等電點為5.92。

2.2 FABP基因編碼蛋白質及同源性分析

經過NCBI數據庫BLASTP比對, 發現FABP與Lipocalin超家族基因具有較高的同源性, PtFABP cDNA編碼 134個氨基酸, 蛋白分子量為 15.13kDa,其理論等電點為5.92。對編碼區進行分析, 未發現有信號肽, 說明三疣梭子蟹FABP可能不屬于分泌蛋白;其氨基酸親水性平均系數(grand average of hydropathicity)為–0.050, 屬于親水性蛋白。在線TMHMM 工具分析發現該氨基酸序列沒有跨膜結構,進一步說明該蛋白質應該屬于定位在細胞質基質或細胞器基質中的蛋白質, 不屬于膜蛋白或分泌蛋白。這些基本理化性質與現有脂肪酸結合蛋白的性質一致。SMART結構域分析發現, PtFABP包含有 1個Lipocalin蛋白家族典型的 129個氨基酸組成的多肽保守序列, 定位在6—134位氨基酸(圖1)。

利用NCBI BLASTP對三疣梭子蟹FABP基因編碼的氨基酸序列進行同源比對, 發現三疣梭子蟹FABP與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) FABP的相似性最高, 為 72%。其次是軟尾太平洋螯蝦(Pacifastacus leniusculus)、紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)、脊尾白蝦(Palaemon carinicauda)和擬穴青蟹(Scylla paramamosain)相似度分別為69%、69%、56%和53%。利用MEGA 6.0軟件進行系統進化分析(圖 3), 三疣梭子蟹的 FABP與中華絨螯蟹的FABP同聚一小支, 形成單獨的一體。

2.3 FABP在三疣梭子蟹不同組織中的表達特征

qRT-PCR分析結果表明, FABP在雌性三疣梭子蟹(IV期)的肝胰腺、卵巢、肌肉等多個組織均有表達。在卵巢中表達最高, 在肝胰腺和眼柄中表達量次之,其余組織中表達量較低(圖 4)。而且在肝胰腺和卵巢中的表達量顯著高于鰓、肌肉等其他組織(P<0.05)。

2.4 FABP在三疣梭子蟹卵巢發育中的表達特征

不同發育階段卵巢中 FABP基因表達特征見圖5。在卵巢發育過程中, FABP的表達總趨勢是先增后降。從內源性卵黃合成期(Ⅰ期)發育至外源性卵黃合成期(Ⅲ期)FABP的表達量顯著增加, 增長率為 50%左右; 而發育到近成熟期(成期)表達量急劇增加, 分別為Ⅱ期和Ⅰ期表達量的 5倍和 10倍左右, 差異顯著(P<0.05)。從成熟期(Ⅴ期)開始表達量下降, 但是與Ⅳ期表達量差異不顯著(P>0.05), 產卵后(Ⅵ期)表達量繼續下降, 與Ⅴ期和Ⅳ期差異顯著(P<0.05), 但是與Ⅱ期和Ⅲ期的差異不顯著(P>0.05)。

圖1 三疣梭子蟹FABP全長cDNA 核苷酸序列和編碼區氨基酸序列Fig.1 The cDNA and amino acid sequences of gene encoding FABP from P. trituberculatus

圖2 不同物種FABP氨基酸多序列比對結果Fig.2 Multiple alignment of the FABP amino acid sequences from different species

3 討論

目前對于FABP的研究多見于植物、昆蟲和哺乳動物等, 在三疣梭子蟹中還未見報道。FABP屬于胞內脂質結合蛋白超家族, 具有參與脂肪酸的攝取和轉運, 調節脂類代謝、參與免疫反應的調節等功能(Tanakaet al, 2014)。FABP能夠與脂肪酸特異性結合,并將脂肪酸從細胞膜運送到甘油三酯和磷脂合成或分解的位點(Di Pietroet al, 2001)。它不僅能結合囊泡和脂質體中的脂肪酸, 還能結合線粒體膜和脂質單層中的脂肪酸。脂肪酸結合蛋白對長鏈脂肪酸有較強的親和力, 從而促進酯化反應, 促進甘油三酯的合成。本研究獲得三疣梭子蟹FABP的cDNA全長, 其編碼區氨基酸序列與中華絨螯蟹、紅螯螯蝦等物種的FABP氨基酸序列具有較高相似性, 相似度分別為72%和69%。對其序列進行分析, 發現該氨基酸序列具有一個 Lipocalin結構域, 與其他的脂肪酸結合蛋白一致, 說明是FABP基因家族成員之一。從進化樹結果分析發現三疣梭子蟹FABP先與甲殼動物FABP聚為一支, 再與昆蟲 FABP聚為一支, 這一結果符合生物在進化上的地位。

圖3 三疣梭子蟹FABP氨基酸序列系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of FABPs from P. trituberculatus and other species

圖4 PtFABP在不同組織中的相對表達量Fig.4 The relative expression of FABP gene in various tissues of P. trituberculatus

圖5 FABP在卵巢發育周期中的差異性差異Fig.5 The relative expression of FABP gene in ovarian development

脂肪酸是構成生物的基本物質, 是細胞膜磷脂的重要成分, 直接調節細胞膜的組成及蛋白質與膜內受體, 從而引起生理功能的變化(Das, 2006), 而脂肪酸結合蛋白對脂肪酸的吸收以及脂肪酸在細胞內的轉運具有及其重要的作用。組織表達研究顯示, 三疣梭子蟹FABP在肝胰腺的表達量較高, 可能與肝胰腺的功能有關, 因為肝胰腺是甲殼動物脂類儲存和對脂類進行加工的主要器官, 是脂類代謝的中心(Vogtet al, 1985)。FABP在中華絨螯蟹、日本沼蝦等甲殼動物肝胰腺中表達量也很高(丁志麗等, 2011)。FABP在眼柄中表達量中等, 因為甲殼動物眼柄中存在重要的內分泌系統, 它調控著甲殼運物的蛻皮、發育、生殖及體內的滲透壓等方面。而FABP還擁有調節細胞增殖和生長、調節基因轉錄和信號轉導、維持機體代謝內環境平衡的功能(陳軼霞等, 2012)。由此說明在眼柄這個組織內也可能存在需要FABP的生理途徑, 有待進一步實驗研究。

甲殼類動物的卵巢包含有大量的長鏈不飽和脂肪酸(PUFA), 豐浪(2011)研究在中華絨鰲蟹卵巢快速發育期, 高不飽和脂肪酸(HUFA)是必需的脂肪酸,一旦截斷了外源的供給, 會制約卵巢發育。而HUFA在對蝦卵巢發育以及胚胎發育中也起著重要作用(Alava et al, 1993)。成永旭等(2000)證實了中華絨螯蟹在卵巢的快速發育期內(9月初至12月初)需要積累大量的脂肪, 在卵巢積累脂肪的過程中, 中性脂在卵巢中的含量、中性脂和磷脂的含量都有明顯的增加,但中性脂與磷脂在總脂的比值基本穩定。Liu等(2008)提出了一種在卵黃合成時期多不飽和脂肪酸運輸到卵巢積累的模式, 而FABP作為胞內長鏈脂肪酸的運輸者, 可以將脂肪酸定位到胞內, 起到十分重要的作用。Ravid等(1999)發現短溝對蝦(Penaeus semisulcatus)卵巢中的脂肪酸含量隨著發育的進行而不斷的增加, 直到發育成熟為止。在十足類甲殼動物卵巢發育過程中, 尤其是卵黃發生期, 卵巢積累了大量的脂肪酸, 這些脂肪酸一般是由肝胰腺轉運至卵巢的(Wen et al, 2001), 最后成為卵細胞中儲存的重要的能源和結構物質。中華絨螯蟹FABP基因在卵巢中的表達量在從階段一(8月)到階段 3(11月)逐漸上升, 并且在階段三(11月)達到最大值, 隨后階段 4(1月)有顯著性下降(鞏亞男, 2010)。擬穴青蟹FABP從未發育期、發育早期、發育期、成熟期到成熟期具有不同的表達水平, 在成熟期之前有較高的表達量, 表明脂肪酸結合蛋白可能參與卵巢發育的過程(Zeng et al, 2013)。本研究中, qPCR結果顯示三疣梭子蟹卵巢中FABP的表達量與卵巢的發育程度成正相關, 隨著卵巢的發育, FABP表達量呈現先增加在下降的趨勢。從內源性卵黃合成期(Ⅰ期)發育至近成熟期(至期)FABP的表達量顯著增加, 并在Ⅳ期達到最大值。Ⅳ期屬于梭子蟹卵巢快速發育期, FABP的表達量急劇上升與這個階段大量脂肪酸的積累相一致。隨著卵巢發育進入成熟期(Ⅴ期), 脂肪積累速度降低, 從而FABP的表達量隨著下降。產卵后, 卵巢隨即進入下一個卵巢發育周期, PtFABP的表達量也逐漸恢復到卵巢發育早期的水平。由此可以說明PtFABP可能通過調節脂肪酸代謝, 從而參與卵巢發育的調控。

4 結論

本研究克隆獲得了三疣梭子蟹FABP基因的全長cDNA 序列, 組織差異表達分析顯示, 三疣梭子蟹FABP在各個組織內均有表達, 其表達水平在卵巢最高。在三疣梭子蟹卵巢發育前期FABP基因的表達量持續增加, 且在Ⅳ期達到最高值, 之后逐漸下降。這表明FABP在三疣梭子蟹的卵巢發育過程中起著重要作用, 并為后期胚胎的發育儲存能量。

丁志麗, 陳立僑, 禹 娜等, 2011. 日本沼蝦脂肪酸結合蛋白基因全長 cDNA的克隆及其在卵巢不同發育階段的表達.見: 2011年中國水產學會學術年會論文集, 廈門

豐 浪, 2011. 高不飽和脂肪酸(HUFA)對三疣梭子蟹卵巢發育、內分泌激素以及組織生化組成的影響. 上海: 上海海洋大學碩士學位論文

鞏亞男, 2010. 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)雌蟹脂肪酸結合蛋白(Es-FABP)基因的克隆及組織表達分析. 上海: 華東師范大學碩士學位論文

成永旭, 堵南山, 賴 偉, 2000. 中華絨螯蟹卵巢快速發育期內脂類積累以及對抱卵的影響. 水產學報, 24(2): 113—118

吳旭干, 姚桂桂, 楊筱珍等, 2007. 東海三疣梭子蟹第一次卵巢發育規律的研究. 海洋學報, 29(4): 120—127

陳軼霞, 駱學農, 王紅寧, 2012. 脂肪酸結合蛋白及其生物學功能. 生命的化學, 32(6): 502—506

Alava V R, Kanazawa A, Teshima S I et al, 1993. Effect of dietary phospholipids and n-3 highly unsaturated fatty acids on ovarian development of kuruma prawn. Nippon Suisan Gakkaishi, 59(2): 345—351

Das U N, 2006. Essential fatty acids: biochemistry, physiology and pathology. Biotechnology Journal, 1(4): 420—439

Di Pietro S M, Santomé J A, 2001. Structural and biochemical characterization of the lungfish (Lepidosiren paradoxa) liver basic fatty acid binding protein. Archives of Biochemistry and Biophysics, 388(1): 81—90

Esteves A, Ehrlich R, 2006. Invertebrate intracellular fatty acid binding proteins. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 142(3—4): 262—274

Fu Y C, Luo N L, Lopes-Virella M F, 2000. Oxidized LDL induces the expression of ALBP/aP2 mRNA and protein in human THP-1 macrophages. Journal of Lipid Research,41(12): 2017—2023

Lautier J, Lagarrigue J G, 1988. Lipid metabolism of the crab Pachygrapsus marmoratus during vitellogenesis.Biochemical Systematics and Ecology, 16(2): 203—212

Liu R Z, Li X D, Godbout R, 2008. A novel fatty acid-binding protein (FABP) gene resulting from tandem gene duplication in mammals: transcription in rat retina and testis. Genomics,92(6): 436—445

Livak K J, Schmittgen T D, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod. Methods, 25(4): 402—408

Ravid T, Tietz A, Khayat M et al, 1999. Lipid accumulation in the ovaries of a marine shrimp Penaeus semisulcatus (de haan). Journal of Experimental Biology, 202(13): 1819—1829

Storch J, McDermott L, 2009. Structural and functional analysis of fatty acid-binding proteins. Journal of Lipid Research,50(S): S126—S131

Tanaka M, Furuhashi M, Okazaki Y et al, 2014. Ectopic expression of fatty acid-binding protein 4 in the glomerulus is associated with proteinuria and renal dysfunction.Nephron Clinical Practice, 128(3—4): 345—351

Vogt G, Storch V, Quinitio E T et al, 1985. Midgut gland as monitor organ for the nutritional value of diets in Penaeus monodon (Decapoda). Aquaculture, 48(1): 1—12

Wen X B, Chen L Q, Ai C X et al, 2001. Variation in lipid composition of Chinese mitten-handed crab, Eriocheir sinensis during ovarian maturation. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 130(1): 95—104

Zeng X L, Ye H H, Yang Y N et al, 2013. Molecular cloning and functional analysis of the fatty acid-binding protein(Sp-FABP) gene in the mud crab (Scylla paramamosain).Genetics and Molecular Biology, 36(1): 140—147