拮抗菌XY1培養條件優化研究

張曉宇，高振峰，張新憲

（1.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所，山西 太原 030031；2.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801）

在農業生產過程中，每年因病蟲草害造成的經濟損失巨大[1-2]，目前，一般采用化學農藥進行防治，但由于化學農藥的大量使用，不僅對大氣、土壤、水體等造成了嚴重污染[3-4]，影響人們的身體健康，而且病原物的抗藥性也在增強[5-6]，給病害防治帶來困難。用有益生物防治各種作物病蟲害是生物防治的一大趨勢，近年來，利用拮抗微生物防治芒果炭疽病已取得一定的成效[7-8]。很多試驗證明，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的細菌可作為拮抗微生物，有效防治柑橘青霉病[9]、蒂腐病[10]及綠霉病[11]，桃、杏和李的褐腐病[12]，櫻桃褐腐病[13]。目前，用于病害生物防治的芽孢桿菌主要有短芽孢桿菌（Bacillus brevis），蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），短小芽孢桿菌（Bacillus pumillus）和多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）等，對多種病原菌引起的病害具有防病效果或抑制作用[14]。

本研究首次對從杏葉中篩選出的拮抗菌發酵條件進行優化，旨在為生物抑菌劑的制備奠定一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌株Pseudomonas aeruginosa XY1，梨鏈格孢菌Alternaria alternata和梨尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，由山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所采后病理實驗室分離提供。

1.1.2 培養基 LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1 000 mL；NB培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 mL；YSP 培養基：酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，蔗糖 20 g，蒸餾水1 000 mL；NYBD培養基：酵母膏 5 g，牛肉膏 8 g，葡萄糖 10 g，蒸餾水1 000 mL；CM培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏 3 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.3 主要儀器及試劑 賽多利斯CP224S型電子天平（德國）；DHP-9272型電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；LS-B50L型立式數顯壓力蒸汽滅菌鍋（江蘇江陰濱江醫療器械廠）；DHZ-D型恒溫搖床（太倉市實驗設備廠）；UV-5100B型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；PHS-3C型酸度計（上海精科雷磁儀器廠）。試劑均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體生長量測定 以不接種拮抗菌株的培養基液為空白對照，測定其在波長為600 nm時的發酵液OD值。

1.2.2 抑菌物質積累量的測定 采用抑菌圈法[15]，發酵液離心10 min（10 000 r/min）取上清，濾膜過濾后制成無菌濾液。無菌濾液與PDA培養基按照1∶50混勻，待培養基冷卻后，將直徑為5 mm的梨尖孢鐮刀菌和梨鏈格孢菌菌塊接入平板中心，空白對照以無菌水代替無菌濾液。25℃恒溫培養，待空白對照將要長滿培養皿時，測定病斑菌塊的直徑，并且計算抑菌率（%）。

1.2.3 種子液制備 挑取新鮮XY1單菌落，接種于20mLNB培養液中，30℃搖床培養 24h（160r/min），制得XY1種子液。

1.2.4 基礎培養液篩選 在NB，LB，CM，NYBD，YSP這5種滅菌基礎培養液中，按2%的接種量，接種XY1的種子液。28℃黑暗振蕩培養72h（160r/min），測定不同基礎培養液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質的積累量。重復3次。

1.2.5 培養液碳源篩選 分別用麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、糊精和葡萄糖代替上述優化基礎培養液中的碳源，將XY1種子液分別接種于培養液中（接種量為2%（V∶V））。28℃黑暗振蕩培養72 h（160 r/min），測定不同碳源培養液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質的積累量。重復3次。

1.2.6 培養液氮源篩選 將1.2.4和1.2.5篩選到的最佳培養液和最佳碳源為固定培養液和碳源，以蛋白胨、尿素、牛肉膏＋蛋白胨、酵母膏＋蛋白胨、牛肉膏＋酵母膏和胰蛋白胨＋酵母膏為氮源制得培養液，將XY1種子液分別接種于培養液中（接種量為2%（V∶V））。28℃黑暗振蕩培養 72h（160r/min），測定不同氮源培養液中XY1菌體生長量（OD600）和抑菌物質的積累量。重復3次。

1.2.7 其他培養條件的優化采用正交試驗法L16（45）對拮抗菌XY1發酵培養條件中的溫度、初始pH值、每250 mL三角瓶裝液量和接種量等條件進行5因素4水平優化[16]（表1）。在不同的發酵條件下培養成分相同的培養液，測定不同處理培養液的菌體生長量和抑菌物質積累量，同時進行正交試驗極差分析。

用1 mol/LHCl和1 mol/L NaOH調節培養液的初始pH。3次重復。

表1 培養條件的正交試驗因素和水平

1.3 數據處理

采用Excel對數據進行整理和繪圖；采用SPSS 17.0進行正交試驗極差分析。

2 結果與分析

2.1 基礎培養液對發酵效果的影響

分別用5種不同培養液對拮抗菌株XY1進行72 h培養后，發酵液中的菌體生長量和抑菌物質產生量均存在差異。從圖1可以看出，NYBD培養液中XY1菌體生長量最大，CM培養液中XY1菌體生長量最少；比較這5種培養液的無菌濾液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率后發現，NYBD無菌濾液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率均比其他培養液抑菌率大（圖2）。基于以上試驗結果，選擇NYBD培養液作為拮抗菌XY1的基礎培養液。

2.2 碳源對發酵效果的影響

用6種不同碳源代替NYBD培養基中的葡萄糖，經72 h發酵培養，XY1的菌體生長量和抑菌物質累積量如圖3所示。從圖3可以看出，XY1菌體生長量在以葡萄糖為碳源的培養液中最多，其次是蔗糖，且二者在0.05水平上差異不顯著；比較不同碳源培養液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率可以發現，蔗糖培養液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為88.75%和90%。基于以上試驗結果，確定蔗糖為菌株XY1發酵最佳碳源。

2.3 氮源對發酵效果的影響

用蔗糖代替NYBD中的葡萄糖、用6種不同氮源代替牛肉膏和酵母膏，72 h發酵培養，XY1的菌體生長量和抑菌物質累積量如圖4所示。從圖4可以看出，XY1菌體生長量在以胰蛋白胨＋酵母膏和牛肉膏＋酵母膏為氮源的培養基中較大，且在0.05水平上差異不顯著；比較不同氮源培養液對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率可以發現，胰蛋白胨＋酵母膏培養液抑菌物質累積最大，對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為89.5%和83.54%。基于以上試驗結果，確定胰蛋白胨＋酵母膏為菌株XY1發酵最佳氮源。

2.4 正交試驗設計優化培養條件

表2 XY1最佳培養條件正交試驗結果

續表2

根據上述最佳碳源和氮源的試驗結果，按照正交試驗設計L16（45）表進行優化條件試驗。測定XY1在不同培養條件發酵液的菌體生長量、對鏈格孢菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率，采用綜合平衡法分析得到培養條件的最佳組合，結果列于表2。

根據平均數k的大小，當試驗指標為OD600時，最優水平組合為A3B3C2D4E2；當試驗指標為對鏈格孢菌抑菌效果時，最優水平組合為A2B3C4D1E2；當試驗指標為對尖孢鐮刀菌抑菌效果時，最優水平組合為A1B3C2D4E2。根據極差大小，當試驗指標為OD600時，各因素的主次順序為B＞A＞C＞E＞D；當試驗指標為對鏈格孢菌抑菌效果時，各因素的主次順序為B＞A＞D＞C＞E；當試驗指標為對尖孢鐮刀菌抑菌效果時，各因素的主次順序為C＞E＞B＞A＞D。根據綜合平衡法得到培養條件最佳組合是A2B3C2D1E2，即溫度25℃，初始pH值7.0，接種量1%，每250 mL三角瓶裝液量40 mL，發酵48 h。在此條件下，與優化前相比，拮抗菌XY1菌體生長量提高6百分點，梨黑斑病抑菌率提高9%，梨枯萎病抑菌率提高10.1百分點（表2）。

3 討論

本試驗系統地研究了拮抗菌株XY1發酵的影響因素，結果表明，菌株XY1發酵的最優培養基配方為：胰蛋白胨8 g，酵母膏5 g,蔗糖9 g，蒸餾水1 000 mL，初始pH值7.0；最優培養條件為：溫度25℃，初始pH值7.0，接種量1%、每250 mL三角瓶裝液量40 mL，發酵48 h。在此條件下，與優化前相比，拮抗菌XY1菌體生長量提高6百分點，梨黑斑病抑菌率提高9百分點，梨枯萎病抑菌率提高10.1百分點。

拮抗菌發酵條件的優化是菌株中試的基礎，鹿秀云等[17]研究結果表明，豆餅粉是拮抗細菌ST-87-14發酵培養基的最適氮源，蔗糖是最適碳源，同時，通過L9（34）正交試驗優化了發酵培養條件。朱宏建等[18]對辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）ND045發酵條件進行了優化，菌絲生長抑制率較優化前提高11.01百分點，達到82.61%。閆建芳等[19]對龜裂鏈霉菌（Streptomyces rimosus）GQ-17的發酵條件和培養基成分進行了優化。鄧振山等[20]研究結果表明，對番茄灰霉病菌拮抗菌D6和D10發酵條件優化后，菌株無菌濾液對番茄灰霉病菌的抑制作用增強。李紅亞等[21]研究表明，對棉花黃萎病拮抗細菌B.velezensis 6-61進行了發酵條件的優化后，菌株抗菌物質的產量高于通用培養基。姜云等[22]對篩選到的甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）菌株NJ13進行了發酵培養基配方和培養條件的優化。本研究通過對拮抗菌株XY1發酵條件的優化為后續生防菌劑開發奠定了良好基礎。

有報道稱，礦質元素及微量元素也可為拮抗菌株提供生長所需營養[23]，在今后的發酵培養基篩選時應重視礦質元素及微量元素的作用。

［1］王治明.番茄早疫病暴發成災原因及防治對策 [J].植物醫生，2009（5）：23-24.

［2］呂增芳.花椒樹蚜蟲危害嚴重的原因及防治建議[J].山西果樹，2010（1）：39-40.

［3］張小平.化學農藥對農業生態環境的污染及防治[J].生態經濟，2003（10）：166-168.

［4］周文強，樊慧梅.拮抗微生物在生物防治中的研究進展[J].遼寧農業科學，2005（5）：32-34.

［5］范永玲，任璐，劉秀英，等.番茄早疫病菌對3種殺菌劑的抗藥性監測[J].安徽農業科學，2008，36（26）：11431-11433.

［6］吳永官，陸少峰，黃思良，等.華南地區瓜類疫霉對甲霜靈的田間抗藥性[J].微生物學報，2011（8）：1078-1086.

［7］張榮意，譚志瓊，簡日明.芒果炭疽病菌生防細菌的篩選、鑒定及生防潛能的初步研究[J].熱帶作物學報，1998（3）：21-27.

［8］ BRAVO O N.In vitro effect of Bacillus sp.on growth，sporulation and germination of conidia and spores of new fungi[J].Fitopatologia Colombiana，1993（17）：62-72.

［9］詹喜.枯草芽孢桿菌對柑橘采后病害的生物防治及其機理研究[D].杭州：浙江大學，2006.

［10］陳麗鋒.柑橘采后蒂腐病菌生物學特性及其拮抗菌研究[D].武漢：華中農業大學，2007.

［11］郝衛寧，李輝，胡美英，等.柑桔綠霉病拮抗細菌的篩選、鑒定及其抑制效果[J].中國生物防治學報，2011，27（2）：284-288.

［12］ PUSEY P L，WILSON C L.Postharvest biological control of stone fruit brown rot by Bacillus subtilis[J].Plant Diseases，1984，68（2）：753-756.

［13］ UTKHEDE R S，SHOLBERG P L.In vitro inhibition of plant pathogens by Bacillus subtilis and Enterobacter aerogenes and in vivo control of two postharvest cherry diseases[J].Canadian Journal of Microbiology，1986，32（4）：963-967.

［14］ VERO S，MONDINO P，BURGUENO J，et al.Characterization of biocontrol activity of two yeast strains from Uruguay against blue mold of apple[J].Postharvest Biology and Technology，2002，26（1）：91-98.

［15］汪騰，段雅婕，劉兵團，等.兩株香蕉枯萎病拮抗菌在香蕉體內的定殖[J].基因組學與應用生物學，2011，30（3）：342-350.

［16］陳志誼，許志剛，高泰東，等.水稻紋枯病拮抗細菌的評價與利用[J].中國水稻科學，2000，14（2）：98-102.

［17］鹿秀云，李社增，栗秋生，等.玉米葉斑病拮抗細菌的篩選及其發酵培養基優化[J].中國生物防治，2006，22（Z）：47-53.

［18］朱宏建，歐陽小燕，周倩，等.一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分離鑒定與發酵條件優化 [J].植物病理學報，2012，42（4）：418-424.

［19］閆建芳，劉秋，趙柏霞，等.真菌廣譜拮抗菌GQ-17的鑒定、發酵液性質研究及發酵條件優化 [J].沈陽農業大學學報，2012，43（5）：534-540.

［20］鄧振山，侯改成，孫志宏，等.番茄灰霉病菌拮抗菌D6和D10發酵條件的優化及其抑菌效果[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），213，41（9）：73-77.

［21］李紅亞，李術娜，朱寶成.棉花黃萎病拮抗細菌B.velezensis 6-61拮抗蛋白發酵條件的優化 [J].中國農學通報，2011，27（21）：93-99.

［22］姜云，尹望，陳長卿，等.人參內生拮抗細菌NJ13的鑒定及發酵條件[J].農藥，2013，52（2）：97-101.

［23］石炳興，趙紅，劉春朋，等.抗生素AGPM搖瓶發酵條件的正交試驗[J].過程工程學報，2001（4）：442-444.