腸道病毒 VP重組蛋白的純化與鑒定

王歡

【摘 要】近年來，腸道病毒71引發的手足口病發病率在我國呈上升趨勢，嚴重危害兒童健康。本研究利用已有的重組原核表達載體pET32a-VP1，在大腸桿菌BL21內誘導其表達VP1融合蛋白，使用鎳柱親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE結果表明重組蛋白表達且純化濃度較高，可用于今后的EV71抗原表位篩選與抗EV71病毒疫苗開發研究。

【關鍵詞】腸道病毒71；VP1；重組蛋白；純化

[Abstract] Recently， Hand-foot-mouth disease （HFMD） caused by Enterovirus 71 （EV 71） outbreak widely in China， which endanger childrens health. In this study， pET32a-VP1 was expressed in E.coli BL21 with the inducement of IPTG. The recombination protein was purified by Ni2+-NTA and indentified by SDS-PAGE， the result of which showed high purity of the recombination protein of VP1.It could provide the bases for research of EV71 epitope screening and new anti-EV71 vaccines.

[Key words] EV71； VP1； Recombination protein； Purification

柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7和腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）等腸道病毒是引起手足口?。℉and-foot-mouth Disease，HFMD）的主要病原體[1]，在我國，尤其以柯薩奇病毒A組16型（COX A16）與EV71最為常見。但感染除了引起HFMD外，EV71還能夠引起脊髓灰質炎樣麻痹、無菌性腦膜炎、腦干腦炎和等多種與神經系統相關的癥狀[2]。自1969年首次被分離以來，EV71病毒已在美國、澳大利亞、歐洲和東南亞等地內引起十多次暴發與流行[3-6]。我國自2008年3月以來，已在多個省份出現了HFMD的流行[7]，而且由于HFMD潛伏期長，癥狀不明顯，治療極易延誤，因此，開發相應疫苗類與快速診斷試劑是防控HFMD的主要方法。EV71病毒顆粒由二十面體的球形蛋白外殼和其中包裹的單鏈正義RNA組成，其中外殼蛋白由VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白組成[8]。研究表明，VP1、VP2、VP3上含有EV71的主要抗原決定簇[9]。本研究利用已構建完成的pET32a-VP1原核表達載體，進行了誘導表達，蛋白質純化與鑒定，以期為今后腸道病毒EV71疫苗的開發提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質粒pET32a-VP1與大腸桿菌BL21為本實驗室保藏，質粒提取試劑盒與Ni2+-NTA柱料購自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

VP1蛋白誘導表達將pET32a-VP1轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，在含有卡那霉素（50mg/mL）的LB平板過夜培養，次日挑取陽性菌落并接種于 100 mL 含有卡那霉素（50mg/mL）LB 液體培養基中，37℃，180 r/min過夜培養。以1%的接種量接種到1 L含有卡那霉素（50mg/mL）LB液體培養基中，37℃，180 r/min 培養。以比濁法檢測600nm下OD值，當 OD值為0.6時，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（0.2 mmol/L）進行誘導，16℃，180 r/min培養過夜。次日4℃，5000 r/min下離心收集菌體細胞沉淀。使用20 mL結合緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25 mmol/L，咪唑pH7.4）重懸菌體細胞，并加入抑肽酶（100 mg/L）與亮抑酶肽（100 mg/L），抑制蛋白酶活性。

鎳柱親和層析在1200 bar壓力下超聲波破碎細胞，4℃，12000 r/min離心，取上清液過鎳柱兩次。用1mL結合緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，25mmol/L 咪唑，pH7.4）洗滌柱子，重復兩次。用1mL洗脫緩沖液（25 mmol/L PBS，300 mmol/L NaCl，300mmol/L咪唑，pH7.4）洗脫目的蛋白，重復3次，收集洗脫液，進行SDS-PAGE 分析。

2 結果與分析

pET32a-VP1轉化后的大腸桿菌BL21經過誘導表達，細胞破碎，離鎳柱親和層析純化與SDS-PAGE檢測，電泳結果表明在接近40kDMarker處有目的蛋白條帶（圖1），與預期產物大小（42kD）一致，表明本重組蛋白表達量較高、雜蛋白含量少。

本研究在大腸桿菌BL21中經IPTG誘導表達重組pET32a-VP1蛋白，產物經過細胞破碎，鎳柱親和層析純化與SDS-PAGE鑒定，表明本重組蛋白表達量較高，雜質少，溶解性高。在本研究的基礎上，可以進一步進行腸道病毒EV71抗血清制備及其免疫原性分析等研究，從而為HFMD新型疫苗的開發提供前期基礎。

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