胰腺癌人源性腫瘤組織異種移植模型的現狀與展望

吳斌 王曉光 管飛紅 鮑軼 鐘征翔

過去幾十年間，胰腺癌常用的臨床前模型是體外培養的腫瘤細胞或衍生于細胞的小鼠異種移植物，該模型存在長期離體培養引起生物學性質改變從而導致基因表達模式的改變[1]、體外培養的細胞缺失腫瘤微環境[2-5]、腫瘤細胞系傳代培養不能反映不同患者之間的異質性等不足。人源性腫瘤組織異種移植(patient-derived tumor xenografts, PDTX)模型的出現彌補了上述不足。胰腺癌PDTX模型的建立是將新鮮的胰腺癌腫瘤組織移植到免疫缺陷鼠體內的過程，它保留了原發腫瘤的相似性，在相對真實的腫瘤基質微環境中生長、傳代，高度保留了原始胰腺癌的異質性[6]，這種相似性不僅表現在基因來源、組織結構、生物學行為上，更表現為對藥物的反應具有很好的平行性和預測性。

一、胰腺癌PDTX模型建立

1．胰腺癌標本的來源：(1)來源于胰腺癌手術標本，包括胰腺癌患者原發灶的新鮮手術標本和轉移灶手術標本。來源于胰腺癌轉移灶PDTX模型移植率高，生長時間短，更容易發生轉移。Walters等[7]建立的PDTX模型中源自轉移灶的移植率為88%(7/8)，而來源于原發性胰腺腫瘤的為38%(14/37，P=0.01)，且前者建模時間更短[(3.4±0.3)月比(5.1±0.5)月，P=0.02]，在第1代小鼠中肝臟和腹膜轉移的發生率更高(67%比31%，P=0.002)。(2)來源于非手術活檢標本，如內鏡超聲下穿刺活檢標本(EUS-FNA)。胰腺癌患者只有少數具有手術切除機會，非手術治療的晚期患者得益于此方法獲得腫瘤組織標本，但其PDTX模型移植成功率較低，考慮可能與穿刺下難以獲得足夠的高質量的活組織有關[8]。(3)來源于循環腫瘤細胞。將患者血液中的循環腫瘤細胞分離出來培養并種植于免疫缺陷小鼠上，可保持患者腫瘤的異質性。此類模型也可稱之為人源性腫瘤異種移植模型，但以細胞形式移植入小鼠體內，相對于腫塊移植缺乏腫瘤基質作用。其優點在于為非創傷性獲得標本，不絕對依賴于手術。目前前列腺癌CTC-PDTX模型已經建立，在胰腺癌中則少有報道。

2．胰腺癌PDTX移植部位：(1)皮下移植模型：皮下移植技術難度較小，手術并發癥少，可通過游標卡尺直接測量腫瘤大小，動態評估藥物反應對腫瘤的生長抑制率。但皮下模型很難真實模擬胰腺腫瘤微環境和腫瘤生物學行為[7]，如缺乏腹膜和肝轉移。Rubio-Viqueira等[6]建立皮下胰腺癌PDTX模型，測定15個基因在移植物和原發腫瘤中的表達情況，僅3個基因表現出顯著的統計學相關性，表明皮下模型可能并不能準確反映患者腫瘤基因表達。(2)腎包膜下移植模型：腎包膜下被認為是理想的移植部位，其相對于皮下模型具有豐富的血流供應，腫塊生長迅速，有利于克服惡性腫瘤患者的時間窗問題[9-10]。Xue等[10]報道原發腫瘤組織移植在小鼠腎包膜下，移植成功率可達83%以上，且移植瘤保留了原始腫瘤的結構和分子特征及異質性。該移植方法目前在肺癌、前列腺癌、卵巢癌中應用較多，胰腺癌中報道較少。(3)胰腺原位移植模型：原位移植模型可表現出癌細胞和間質組織浸潤進入小鼠正常胰腺組織，閉塞正常胰腺小葉[7]。該方法能最佳模擬腫瘤的微環境和生物學行為，可真實重現腫瘤的生長及轉移情況。缺點在于移植技術要求高，移植成功率低，是一個更耗時、更高成本的過程，測量腫瘤大小也相當不便。某些研究組[11]利用熒光技術或者micMRI檢測腫塊大小，但是費用均非常高。多數研究[7,12-13]表明原位模型能極好地模擬原發腫瘤生長及轉移，但也有觀察到原位模型錯誤地預測臨床活動[14]，目前仍需要大量研究加以驗證。

二、胰腺癌PDTX人源性鑒定評價

目前已發表的研究主要從腫瘤形態結構、基因水平、蛋白表達及對藥物的反應性等方面鑒定、評價PDTX模型。

1．腫瘤形態結構：首先可用HE染色從病理上確診PDTX移植瘤為腫瘤組織。在形態上PDTX移植瘤結構和基質含量類似于原發性腫瘤，相比細胞系腫瘤模型能更好地重現原發腫瘤形態。然而，有研究發現PDTX移植瘤中也存在小鼠基質細胞浸潤人源腫瘤細胞，表明腫瘤-基質間相互作用不能完全忽略。

2．基因水平： Rubio-Viqueira等[6]報道12例PDTX模型中第3代移植物腫瘤與患者腫瘤K-ras基因狀態一致的有9例。Mattie等[15]報道了PDTX模型經歷8次傳代后K-ras和PIK3CA的突變頻率與原發腫瘤相似，表明PDTX在基因突變上與原發腫瘤保持相似性。此外，使用單核苷酸多態性陣列技術證明這些PDTX模型間保持了個體來源異質性，證明該模型具備用于個體化治療的前景。

3．蛋白表達水平：基因水平的一致性并不表明蛋白表達相同，可以通過蛋白質印跡法、免疫組織化學法、熒光原位雜交等手段加以驗證。Rubio-Viqueira等[6]用免疫組織化學法很好地證實了12例模型中第3代移植瘤與患者腫瘤DPC4蛋白表達一致。

4．藥效平行性： PDTX模型必須與患者具有相似的藥物反應性。早期部分研究記錄了幾種抗癌藥物單一療法在異種移植模型中的反應類似于臨床試驗[6,16-17]。但是藥物反應是一個非常復雜的過程，受許多因素影響，包括移植物、小鼠、環境等各方面因素，很有可能出現藥物反應的差異，甚至出現相反的結果[18]，這就需要對模型進行藥效平行性的鑒定。

三、胰腺癌PDTX模型的應用前景

1．發現新的胰腺癌藥物或治療方案：運用PDTX模型可以開發有潛力的治療藥物[6]以及方案。Villarroel等[19]用晚期胰腺癌患者術后標本建立移植動物模型，經過基因分析發現腫瘤組織對順鉑和絲裂霉素敏感、對吉西他濱耐藥，用絲裂霉素C化療，患者生存期超過36個月。Walters等[7]也發現EGFR/HER2的組合抑制劑拉帕替尼基本上不能抑制胰腺癌細胞系增殖，而在PDTX模型中，拉帕替尼和曲美比嗪治療比吉西他濱在抑制腫瘤生長上具有更顯著的作用，但是這些新藥或者新的治療組合還需要臨床上有效的驗證。Pérez-Torras等[12]認為胰腺癌作為一種多因素起源疾病，目前專門針對單分子靶點治療效率低下，可能受限于腫瘤中復雜的信號調控通路，因此抑制多種信號轉導途徑、重新定義分子和細胞靶標等策略在治療反應中起關鍵作用，胰腺癌PDTX模型為策略的指導提供了平臺。

2．預測胰腺癌患者預后：PDTX模型來源于人體原發腫瘤，具有更好的代表性，所以較傳統模型具有更好的預測性。研究表明[7]小鼠中建立第1代腫瘤的時間與患者生存期相關，第1代腫瘤生長至400～500 mm3所需時間，<4個月所對應的患者中位生存期僅6.3個月，而>4個月的為13.7個月，中位生存期為20.6個月患者對應的PDTX移植瘤則不能生長。由此推測在PDTX模型中較早發生轉移者，其對應患者更容易發生轉移，其預后也往往是不佳的。

3．預測藥物療效及耐藥性：目前基于PDTX模型篩查敏感藥物僅限于科學研究，還未運用于臨床。預測藥物療效需要定義一個療效的標準，大多PDX模型的治療反應通常基于減緩的腫瘤生長動力學，而不是人類所需的腫瘤消退。然而在靶向治療中，應該定義藥物是否調節其在體內的靶標以及相關的生物學效應從而影響腫瘤生長。Li等[20]報道胰腺癌患者胸苷酸合成酶(TS)、二氫嘧啶脫氫酶(DPD)、乳清酸磷酸核糖轉移酶(OPRT)水平與 S-1治療相關， HER2與白蛋白紫杉醇治療反應相關，因此它們可作為相應治療的新的生物標記物。將PDTX技術與免疫治療技術結合，可用于腫瘤免疫治療、靶向藥物有效性和安全性的臨床前評價，如免疫檢查點抑制劑、CAR-T治療、溶瘤病毒、腫瘤疫苗等。

4．標本庫的建立：建立起不同胰腺癌患者來源的PDTX模型庫，是可傳代、活的標本庫，以供不同的研究使用。

四、胰腺癌PDTX局限性

PDTX模型移植瘤與其小鼠宿主之間的關系還需要深入探索，鼠癌細胞的傳代是否改變腫瘤細胞的基因型和表型也令學者擔憂[6]。如果移植瘤的生成和擴增在于小鼠，該模型可能不能反映人類胰腺癌的特征以及作為個體化治療工具的作用可能有限。但目前大部分研究認為在移植腫瘤中腫瘤細胞起主要的決定和維持作用[21-22]。移植于小鼠的人源性腫瘤可能會受小鼠體內微環境的影響，但這種影響的大小還需要實驗加以驗證。從已有的研究來看，傳代后的腫瘤組織與原代相似度達90%以上，表明這種影響存在，但作用不明顯。

PDTX雖然在臨床前試驗得到驗證，但目前PDTX模型構建需要的腫瘤標本主要局限于具有早期腫瘤的患者手術切除。對胰腺癌這類不易早期發現的惡性腫瘤，解決這個問題還需要提高胰腺癌的早期檢出率，使得更多的患者具有手術機會，從而得益于PDTX帶來的個體化治療。此外，PDTX模型僅能模擬可切除患者原發腫瘤的生物學行為及藥物反應，轉移性胰腺癌患者是否顯示不同的模式，還需要更多的實驗研究進行評估。建立PDTX模型需要較長時間，腫瘤移植潛伏期(從植入到異種移植腫瘤生長成型)可能從2個月到12個月。移植率通常取決于腫瘤類型、腫瘤侵襲性等因素， Li等[20]研究將3個月仍未達移植瘤目標大小的模型退出實驗，強調了模型建立的時效性。事實上，高移植率的患者通常具有高轉移風險以及較差的預后。若要將模型運用于指導用藥及預測預后，縮短模型建立周期也是將來需要面對的一個問題。

五、展望

精準、個性化是未來醫學的發展方向，精準醫學是根據患者獨特的遺傳和分子特征來指導治療，也稱為個體化醫學。目前臨床試驗療效取決于大樣本、多中心患者群體，其多無法提供個性化治療依據，精準醫學要求在患者存活期間利用能代表患者的模型探索最佳療法，而來源于患者的PDTX模型滿足了這一要求。美國國家癌癥研究所臨床試驗規劃會議建議開發新的臨床前腫瘤模型從而更好地預測人胰腺癌的預后，它指出PDTX模型可作為藥物篩選、生物標記物發展、擴展有關胰腺癌生物學知識強大的平臺[13]。但是胰腺癌PDTX研究處于起步階段，充滿挑戰。目前PDTX模型所用的小鼠為裸鼠或者NOD-SCID小鼠，裸鼠缺乏T細胞免疫,但是B細胞及NK細胞免疫依然存在，NOD-SCID小鼠缺乏T細胞、B細胞、NK細胞免疫，兩者均不能最好地模擬原發腫瘤所在人體內的免疫反應。此前研究人員曾運用基因工程小鼠建立胰腺的原位模型，優勢在于存在完整的免疫系統，但與其他基因工程小鼠模型一樣，局限于預定的特異性遺傳突變，很難反映人類胰腺癌的遺傳多樣性。期待個體免疫來源的移植瘤模型即腫瘤免疫雙人源化小鼠模型早日出現，使其真正發揮個體化“替身”作用，為胰腺癌患者尋找最有效的藥物以及個體化治療方案提供更好的依據。