結核病分子病理學診斷技術臨床應用進展

宋婧 車南穎

結核病(tuberculosis，TB)已經存在數千年，仍然是全球十大死因之一，死亡率在傳染性疾病中排名第一，嚴重威脅人類健康[1]。病理學是診斷結核病的重要途徑，尤其在痰菌陰性肺結核和肺外結核等疑難患者的診斷中發揮了重要作用[2]。傳統的結核病病理學診斷主要依靠常規病理學及抗酸染色，可與其他常見的腫瘤和感染性疾病進行鑒別[3]；但與其他一些肉芽腫性疾病，例如非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)病的鑒別診斷中遇到很多困難。隨著分子生物學與病理學的相互交叉滲透，20世紀70年代利用分子生物學技術研究疾病病因、發病機制、形態變化及功能損傷規律的新分支學科——分子病理學誕生[2]。近年來，分子病理學技術發展迅速；在2017年發表的《中國結核病病理學診斷專家共識》中提出，分子病理學檢測是病理學確診結核病的主要依據。分子病理學可以有效解決結核病與NTM病的鑒別診斷，以及耐藥結核病的診斷等傳統病理學所無法完成的難題[4]。筆者從分子病理學診斷結核病、NTM病及耐藥結核病等3個方面對近幾年分子病理學診斷技術在臨床中的應用進展做一簡要綜述。

分子病理學診斷結核病

TB的早期診斷是臨床治療的關鍵，分子病理學技術是診斷TB快速、有效的方法。隨著分子生物學技術的不斷發展，新的PCR及其衍生技術的應用，進一步提高了TB病理學診斷的敏感度和特異度。

一、常用PCR技術

PCR是一種體外擴增特異DNA片段的技術，可在短時間內將一個或幾個結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)DNA拷貝擴增到百萬數量級。為了提高PCR診斷的敏感度和特異度，基于普通PCR的新型分子診斷技術大量涌現。實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR)通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時監測實現對起始模板定性及定量的分析；巢式PCR通過設計“外側”、“內側”兩對引物進行2次PCR擴增，提高了微量靶序列檢出的敏感度和特異度。董宇杰等[5]回顧性分析了胸腔鏡活檢獲取的36例結核性胸膜炎患者福爾馬林固定石蠟包埋組織標本(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)，25例經RT-qPCR檢測MTB-DNA陽性，敏感度為69.4%，GeneXpert檢測胸腔積液的敏感度僅為12.5%，活檢組織MTB-DNA檢測在結核性胸膜炎診斷中具有重要價值。穆晶等[6]分別用RT-qPCR與抗酸染色檢測93例骨關節結核FFPE標本，RT-qPCR檢測的敏感度(82.8%)明顯高于抗酸染色法(68.8%)。McKew等[7]結合65 kDa(相對分子質量為65 000)熱休克蛋白編碼基因(65-kDa Heat Shock Protein Gene,hsp65 gene)和插入序列6110(IS6110)用RT-qPCR檢測FFPE標本中的MTB，其敏感度(89%)優于新鮮組織固體培養(70%)。Seo等[8]對IS6110和MPB64序列設計引物用巢式PCR和RT-qPCR檢測FFPE標本的MTB，巢式PCR的敏感度高于RT-qPCR，能夠達到70%～87%，4種不同商業用試劑盒RT-qPCR陽性檢出率為31.3%～80.0%不等。巢式PCR的缺點是2次擴增中間有開蓋過程，存在污染風險，所以不適用于臨床檢測。RT-qPCR 只擴增1次，耗費時間短，且能對MTB起始模板進行定量分析，更適用于臨床檢測。

二、多重PCR技術

多重PCR技術是在同一個PCR反應體系中加入多對引物同時擴增DNA樣本的幾個不同靶區域片段，節約樣本，省時省力。Fukumoto等[9]開發了一種同時檢測病理組織標本中細菌和真菌的“多微生物實時PCR”診斷系統，能同時檢測68種細菌和9種真菌。在10例獲得性免疫缺陷綜合征患者尸檢時取肺部組織檢測，金黃色葡萄球菌是最常見的微生物(8例)，其次是銅綠假單胞菌(6例)、腸球菌(6例)和白色念珠菌(4例)。此外，在1例肺炎中檢測到MTB的潛伏感染?！岸辔⑸飳崟rPCR”診斷系統可用于檢測病理標本中的細菌和真菌，有助于明確診斷感染性疾病。國內也有學者利用多重PCR技術檢測TB患者FFPE組織標本，李子玲等[10]對結核分枝桿菌熱休克蛋白65(heat shock protein 65，hsp65)、IS6110和人類β2珠蛋白基因序列設計引物進行多重PCR擴增，結果顯示出較高的敏感度和特異度，且可以鑒別MTB和NTM。

三、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測技術

GeneXpert是由美國Cepheid公司開發的以半巢式實時熒光定量PCR技術為基礎，系統自動運行并同時檢測MTB和利福平耐藥性的診斷平臺。Polepole等[11]的研究評估了GeneXpert檢測FFPE標本診斷肺外結核的準確性，以病理組織學診斷為標準，組織抗酸染色、PCR和GeneXpert診斷淋巴結結核的陽性率分別為13%(95%CI：5%～27%)、41%(95%CI：27%～57%)和30%(95%CI：18%～46%)；診斷淋巴結結核以外的其他肺外結核，陽性率分別為12%(95%CI：2%～38%)、82%(95%CI：56%～95%)和35%(95%CI：15%～61%)，PCR檢測肺外結核FFPE標本的敏感度較GeneXpert更高。Pandey等[12]的研究表明GeneXpert對于大多數肺外結核新鮮組織標本和呼吸道(除痰外)標本的檢測具有潛在價值，選取腦脊液、胸膜腔積液、淋巴結組織、膿液，以及支氣管灌洗液等269份樣本，以培養為標準，GeneXpert檢測的敏感度和特異度分別為89%和95%；對于抗酸染色涂片陽性和涂片陰性樣本，GeneXpert檢測的敏感度分別為100%和77%，特異度分別為94%和96%。GeneXpert檢測新鮮組織標本效果更好，可能與FFPE標本制作過程中，福爾馬林固定液引起蛋白交聯導致DNA損傷、蠟塊組織保存時間過長等因素有關。

總之，分子生物學技術在結核病組織病理學診斷中的應用，大大提高了病理學診斷結核病的陽性率，在結核病的早期診斷中具有較好的臨床實用價值。

分子病理學診斷NTM病

NTM是分枝桿菌屬內除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[13]。近年來， NTM從臨床標本中的分離率有所增加。NTM病與TB的組織形態學相似，抗酸染色也很難區別，分子病理學實現了傳統病理學無法完成的NTM感染的診斷。

一、多重PCR技術

目前共發現154種NTM和13個亞種，僅少部分對人體致病。NTM可以侵犯人體肺臟、淋巴結、骨骼、關節、皮膚和軟組織等器官，并可引起全身播散性疾病[13]。16S rRNA和16S-23S rRNA基因內轉錄間隔區(ITS)、rpoB、hsp65等基因序列常被用來鑒別MTB和NTM。Kim等[14]觀察到MTB和NTM感染之間的組織形態學基本沒有差別，用多重PCR和RT-qPCR兩種MTB與NTM檢測試劑盒檢測154例分枝桿菌感染患者的FFPE肺組織標本，包括137例TB患者和17例NTM病患者(分枝桿菌培養結果為12例胞內分枝桿菌，2例膿腫分枝桿菌，1例鳥分枝桿菌，其余2例未鑒定出菌種)。多重PCR檢測NTM的敏感度略高于RT-qPCR，但兩種方法鑒別MTB與NTM差異無統計學意義。Sabeti等[15]報告的1例32歲患有終末期腎病的男性患者，手指病灶有皮下結節性病變，FFPE標本組織行抗酸染色涂片檢查陽性，PCR檢測結果為結核分枝桿菌復合群陰性，進一步用多重PCR鑒定出一種生長緩慢的NTM——M.haemophilum，該菌可在免疫功能低下的患者中引起皮下潰瘍性或結節性病變。在患者標本抗酸染色涂片檢查陽性、MTB-PCR檢測結果陰性時，應考慮與NTM病的鑒別診斷。

二、核酸探針雜交技術

核酸探針雜交技術的原理是與探針具有一定同源性和互補性的待測核酸分子在一定的條件下，可與探針通過氫鍵形成雙鏈分子。這種雙鏈分子經過核素、熒光物質或生物素標記后，可通過放射自顯影或顯色反應檢測出來[4]。德國Hain公司開發的以23S rRNA為靶基因鑒定NTM的試劑盒包括GenoType Mycobacterium CM和GenoType Mycobacterium AS，前者鑒定結核分枝桿菌復合群及常見的15種NTM，包括鳥胞內分枝桿菌、偶發分枝桿菌、膿腫分枝桿菌等，后者用于鑒定臨床少見的其他16 種致病NTM，如恥垢分枝桿菌、草分枝桿菌、胃分枝桿菌等[16]。國內深圳亞能生物公司開發的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒采用PCR-反向斑點雜交技術原理，試驗膜條上共有22個NTM探針位點，標本與相對應探針雜交顯色，即檢測到相應的分枝桿菌。北京博奧生物有限公司研發的分枝桿菌菌種鑒定芯片可以識別17種 NTM，Zhu等[17]用該芯片檢測150例MTB和67例 NTM臨床培養分離菌株樣本，生物芯片結果與16S rRNA測序結果一致；195例臨床痰標本中，116(59%)例培養陽性和79(41%)例培養陰性，生物芯片成功檢測到全部116例培養陽性樣品，同時檢測到1株培養陰性的MTB。Munkhdelger 等[18]報道利用PCR-反向斑點雜交技術在FFPE 標本中成功鑒定了多種NTM。核酸探針雜交技術較一般PCR具有更高的檢測通量，一次實驗可以檢測多個基因位點，從而鑒別多種NTM。

三、熔解曲線法

熔解曲線法是一種PCR后產物分析技術，野生型基因有特定的熔解溫度值(Tm)，而突變型基因因為DNA雙鏈結合能力下降導致相應的Tm值下降。Tm值下降的幅度與發生錯配的堿基數目、類型和位置有關，據此可以檢測出突變型和野生型。熔解曲線主要分為高分辨熔解曲線和熒光探針熔解曲線兩種方法。高分辨熔解曲線(high resolution melting，HRM)技術是PCR擴增技術與熔解曲線分析技術相結合，依靠高分辨溫度檢測PCR儀和新型飽和熒光染料制作熔解曲線實現基因序列分析的新技術[19]。Khosravi等[20]使用德國QIAGEN Type-it HRM PCR試劑盒檢測98株分枝桿菌臨床分離株，rpoBC操縱子進行實時PCR后進一步HRM分析，成功鑒定出88株(89.7%)分枝桿菌。Issa等[21]采用16S rRNA基因作為實時PCR中的靶標，進行HRM分析，區分出不同的分枝桿菌種類。基于探針的熒光熔解曲線分析(fluorescence melting curve analysis，FMCA)是將帶有熒光標記的探針-靶序列雜交體熱變性的溫度制作熔解曲線。張俊仙等[22]以DNA直接測序法為對照，應用FMCA法分析22種分枝桿菌標準株和11種非分枝桿菌標準株，結果與標準株DNA測序一致，成功地建立了FMCA鑒定方法。初步鑒定32株分枝桿菌臨床分離株的結果顯示，30株(93.8%)快速鑒定到種，2株鑒定到分枝桿菌屬，FMCA具有較高的敏感度。目前，熔解曲線法用于FFPE標本分枝桿菌鑒定的報道較少，未來還需做進一步的研究。

四、高通量測序

DNA測序技術近年在多個生物研究領域得到廣泛應用，其優點是通量高、速度快及準確性高，但操作復雜及較高的成本限制了其在臨床中的應用。Bao等[23]最近開發了一種使用16S rRNA PCR擴增和焦磷酸測序(PCR-Seq)快速檢測和鑒別FFPE標本中抗酸菌(acid-fast bacterium，AFB)的方法，包括結核分枝桿菌復合群、NTM、諾卡菌屬及其他的AFB，并進行了評估。116例FFPE標本抗酸染色涂片陽性，其中83例(72%)通過PCR-Seq鑒定出AFB類型，除識別出14例結核分枝桿菌復合群和3例麻風分枝桿菌外，還確定了另外19個AFB菌種。在過去的幾十年中，NTM和其他AFB(如諾卡菌屬)的感染逐漸上升，肺外組織FFPE標本中檢測出結核分枝桿菌復合群和NTM等AFB顯得越來越重要。

傳統鑒定NTM的方法操作復雜，需要2～3個月時間，且在多數情況下無法獲得明確的鑒定，可能會延誤 NTM的診斷和治療。分子生物學方法操作簡單、快速，一次檢測就可以獲得菌種鑒定結果，對NTM病的早期診斷具有重要價值。

分子病理學診斷耐藥結核病

根據2017年世界衛生組織的最新報告，2016年我國新發耐藥結核病患者5.8萬例，但發現并經實驗室確診的僅有1萬余例[1]。傳統的MTB藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)受生物安全、培養時間長等因素影響，不能滿足臨床快速診斷耐藥結核病的需求。目前，具有生物安全要求級別低、檢測時間短、敏感度較高等特點的耐藥結核分子生物學診斷方法日益受到重視。

一、核酸探針雜交技術

目前研究發現，MTB耐藥的主要機制是抗結核藥物作用位點的靶基因突變，如利福平(RFP)的rpoB81 bp(密碼子507～533)耐藥決定區(rifampin resistance determing region，RRDR)、異煙肼(INH) 的KatG和inhA-mabA啟動子基因突變等[24]。德國Hain公司的GenoType MTBDRplus試劑盒是世界衛生組織推薦的檢測MTB耐藥性的方法，能夠可靠地檢測與INH和RFP耐藥相關的常見突變。Schaumburg等[25]從14例TB患者FFPE組織標本中提取DNA，同時與基于培養的藥敏試驗結果比較，評估核酸探針雜交技術檢測MTB對RFP和INH的耐藥性，結果顯示出較好的一致性。國內譚景尹等[26]用PCR-膜芯片反向點雜交技術檢測FFPE標本中MTB的耐藥基因突變，在42例MTBIS6110基因陽性的標本中，檢出INH基因突變2例，RFP或Sm耐藥相關基因突變各1例，INH、RFP和EMB耐藥相關基因同時突變1例，與測序結果基本相符。FFPE標本提取DNA檢測INH和RFP耐藥性，較基于培養的藥敏試驗檢測周期短，早期即可為患者抗結核治療藥物的選擇提供指導。Guo等[27]開發和評估了檢測耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的快速生物芯片系統?？焖偕镄酒到y測定結果與DNA測序結果的一致率為100%。與傳統藥敏試驗相比，對于RFP耐藥性的檢測，快速生物芯片系統檢測臨床分離株的一致率為91.8%，檢測痰標本為94.6%；對于INH的耐藥性檢測，快速生物芯片系統檢測臨床分離株與傳統藥敏試驗的一致率為70.2%，檢測痰標本一致率為78.1%。整個生物芯片測定需要6 h，而作為結核分枝桿菌耐藥檢測金標準的表型藥敏試驗檢測方法需要2～3個月。但國內外關于該方法的報道大多數是用痰或者培養物等標本，對FFPE標本進行檢測的報道較少。

二、熔解曲線法

已有學者報道用熔解曲線法快速檢測新鮮組織MTB培養分離株的耐藥突變。Sharma等[28]用HRM在200例肺外結核患者新鮮組織培養分離菌株中檢測到22例MDR-TB患者(11%)，3例(1.5%)單耐RFP患者，8例(4%)單耐INH患者。同時HRM直接從組織中鑒定出另外4例培養陰性的MDR-TB患者。HRM檢測結果和測序的結果具有100%的一致性。Luo等[29-30]建立了熒光探針熔解曲線技術檢測MDR-TB的系統，用臨床分離株對一線抗結核藥物和二線抗結核藥物分別進行了驗證，并將檢測結果與測序結果比較，有較好的一致性。熔解曲線法操作簡單，結果容易判讀，在MTB藥敏試驗方面有較好的應用前景。

三、GeneXpert檢測技術

GeneXpert檢測技術針對rpoB81 bp RRDR設計引物和探針，檢測是否發生RFP的耐藥突變，是世界衛生組織推薦的快速診斷耐藥結核病的方法。Polepole等[11]用GeneXpert 技術檢測100例肺外結核患者的FFPE組織標本，包括淋巴結、腹部組織、滑膜組織、皮膚、睪丸組織等，檢出2例對RFP耐藥的淋巴結結核患者，1例對RFP耐藥的男性睪丸結核，14例是否對RFP耐藥不明確。Rindi等[31]用GeneXpert技術檢測14例具有TB組織病理學特征的FFPE標本和8例無TB組織病理學特征的健康組織標本，14例MTB-DNA均為陽性且對RFP敏感，對照組中均未檢測到MTB-DNA?？傊?，GeneXpert技術檢測FFPE標本中的MTB-DNA對RFP是否耐藥的報道較少，未來還需進行更多樣本量的研究以評估其診斷效能。

四、高通量測序

目前，常用的MTB耐藥基因檢測技術的缺點是檢測位點有限，不能一次檢出對所有常用抗結核藥物的MTB耐藥基因突變。而高通量測序能夠檢測所有已知的耐藥基因突變位點，也可以發現未知的耐藥基因突變。一項大樣本量多中心的研究結果顯示[32]，與傳統藥敏試驗結果比較，基因測序檢測MTB臨床分離株對RFP耐藥的敏感度為91%(靶基因為rpoB)，檢測對INH耐藥的敏感度為86%(靶基因為katG，inhA-fabG啟動子組合)，檢測對PZA耐藥的敏感度為54%(靶基因pncA)，檢測對Ofx耐藥的敏感度為85%(靶基因為gyrA和gyrB組合)，檢測對Mfx耐藥的敏感度為88%(靶基因為gyrA和gyrB組合)。基因測序可能成為監測MTB對抗結核藥物是否有耐藥性的重要工具。由于存在對技術人員要求高、檢測設備昂貴的問題，高通量測序難以在短期內廣泛用于臨床對MDR-TB的檢測。

早期診斷和及時進行規范治療是耐藥結核病防控的關鍵。目前，國內已有基于核酸探針雜交技術和熒光探針熔解曲線技術的耐藥檢測試劑盒可供臨床使用，但總體上可檢測的抗結核藥物不夠全面，且成本較高，需要進一步研究更經濟、高效、準確的方法用于耐藥結核病的診斷。