組織工程組織血管化的研究進展

賈智明　郭海林　陳方

組織工程技術近年來取得了巨大的進步，但是組織工程組織植入體內后產生的血管化不足，成為阻礙其臨床應用的主要瓶頸之一[1]。血管發生（Vasculogenesis）和/或血管新生（Angiogenesis）機制，是使構建的工程組織和器官內及時形成密集有序的血管網絡的基礎，是確保其在體內存活并發揮功能的必要條件[2]。由于目前組織工程組織血管化策略的不同，我們將分別進行綜述，并探討今后可能的發展趨勢。

1　將支架材料特殊處理以促進血管化

將支架材料經過特殊處理后，可刺激周圍組織或種子細胞分泌血管生成因子，并募集內皮細胞等，以發揮促血管化的功能[3]。

1.1　人工合成聚合物復合活性材料以促進血管化

Zhao等[4]發現，復合3.0%CuO的硼酸鹽生物活性玻璃微纖維可促進內皮細胞遷移、組裝血管和分泌VEGF，并上調成纖維細胞內血管形成相關基因的表達水平；體內實驗證實，這種支架材料可促進全層皮膚缺損的修復。Qin等[5]將復合了1%鍶的聚磷酸鈣支架與人牙髓細胞共培養，以聚磷酸鈣支架和羥基磷灰石支架作為對照，發現實驗組不但可促進牙髓細胞增殖，還可顯著刺激細胞分泌更多的VEGF和bFGF，提示復合1%鍶的聚磷酸鈣支架在誘導牙齒組織血管化方面具有一定的潛能。由于目前制造技術和材料本身的限制，如炎癥反應、降解產物毒性，人工合成聚合物支架與種子細胞或機體相互作用仍不足，體外尚不能構建成熟穩定的血管網絡，需要進一步優化。

1.2　改進天然生物材料以促進血管化

天然生物材料有著親近的側鏈和良好的生物相容性，易與宿主血管網絡整合。Wang等[6]使用脂肪酸對玉米蛋白多孔支架進行改性處理，體內實驗發現其生物相容性較佳，與未處理組相比在支架內形成了更為密集的微血管網絡，纖維化程度輕微。Chan等[7]使用Ⅰ型牛膠原蛋白制作成80μm孔徑的膠原支架，將其環繞于股動脈周圍，結果顯示此支架生物相容性較佳，可改善移植細胞的存活率，且支架內充滿股動脈分支小血管。有研究發現，纖維蛋白和Ⅰ型膠原復合物的組成比例、硬度和機械刺激可影響血管網絡的構建[8]。天然生物材料應用于組織工程血管化領域存在著自身的局限性，如膠原機械性能較差；纖連蛋白成本太高，機械應力過大不利于血管網絡形成[3]。目前的研究多致力于對天然生物材料進行改良、復合，或探索新的天然生物材料等，對促進工程組織血管化的影響[9-10]。

1.3　制備人工/天然材料復合物以促進血管化

大部分人工合成聚合物屬于生物惰性材料，但機械強度較大，重復性較好；天然生物材料具有良好的生物相容性，為血管形成提供了接近機體的微環境，但多缺乏機械強度。由兩者復合形成的支架材料能夠綜合各自的優勢并彌補不足，從而更好地促進血管化。Quinlan等[11]將生物活性玻璃/膠原-黏多糖支架用于骨組織工程，體外實驗顯示，生物活性玻璃顆粒直徑為100μm時，可顯著促進支架內的內皮細胞分泌VEGF，并促進內皮細胞成管；同時，該支架可促進成骨細胞的增殖和成骨作用。Koc等[12]以殼聚糖/羥基磷灰石復合支架構建組織工程化骨組織，同樣取得了不錯的效果。

1.4　使用脫細胞基質促進血管化

脫細胞基質含有組織特異性的血管網絡骨架和活性細胞因子，通過內皮細胞再覆蓋可形成功能性的血管通道。Gálvez-Montón等[13]將人心包來源的脫細胞基質覆蓋于梗死心肌上方，30 d后脫細胞基質內可見微血管網絡和神經纖維新生，同時左心室射血分數和心輸出量等心功能指標顯著改善，梗死面積顯著縮小。Iyyanki等[14]將復合脂肪干細胞的脫細胞真皮基質用于修補大鼠腹壁疝，術后4周時復合脂肪干細胞可顯著增加微血管密度和機械強度。脫細胞基質可在全器官組織工程領域發揮其獨特的優勢，值得進一步研究[15]。

1.5　應用3D打印技術構建含血管通道的特殊支架

3D打印技術是在斷層掃描的基礎上，通過計算機模擬出立體形態，并最終完成立體形態重建的新興技術。使用3D打印技術可精確地、個性化地定制靶組織或器官、含有血管通道的支架，以促進工程組織的血管化。Li等[16]使用3D打印技術構建磷酸鈣骨水泥復合介孔二氧化硅支架，具有特定的孔隙結構，可優化硅離子的釋放，在植入體內早期可促進周圍血管的長入。Bertassoni等[17]以瓊脂糖為基本結構，使用異丁烯酸酯凝膠、聚乙二醇酯和二甲基丙烯酸構建了一種含有微血管通道的支架，微血管通道可完成細胞物質交換，提供細胞生長空間，支持內皮細胞的黏附、增殖等。但是，由于原材料的選擇有限、制作時間較長、打印分辨率較低等原因，目前使用3D打印制作的支架和血管通道在生物相容性、血管支撐力、血管樹形成等方面尚不盡如人意，需要進一步改進。

2　添加血管生成相關細胞以促進血管化

血管生成相關細胞包括：①直接相關細胞，包括內皮細胞、周細胞和血管平滑肌細胞等；②間接相關細胞，包括內皮祖細胞（Endothelial progenitor cell，EPC）、間充質干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）和誘導多能干細胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）等，此類細胞可通過旁分泌促血管生成因子或直接分化為內皮細胞的方式促進血管化。為促進工程組織血管化，將支架材料復合血管生成相關細胞是一種可行的策略[18-19]。Buitinga等[20]將胰島細胞復合hBMSC和臍靜脈內皮細胞植入裸鼠皮下，與不含內皮細胞的對照組相比，其形成的組織微血管密度更高，可能是hBMSC和內皮細胞相互作用，而分泌了大量VEGF、bFGF等血管生成因子。因為內皮細胞來源較為局限，多取材于大動脈或者臍靜脈，增殖能力較差，且有研究發現單用內皮細胞在體內并不能形成成熟穩定的血管網絡。另外，由于干細胞分化為成熟內皮細胞的技術尚不成熟，EPC被認為是替代內皮細胞的理想選擇[21]。Zigdon-Giladi等[22]將復合人外周血EPC的β-磷酸鈣材料植入顱蓋骨再生裸鼠模型，發現形成的新生骨組織血管密度高于單純β-磷酸鈣材料組7.5倍。人外周血EPC可分化為成熟的內皮細胞，并形成微血管網絡與周圍的宿主血管相連接。脂肪微血管片段（Microvascular fragment）的發現也為組織工程血管化提供了新的細胞來源[23]，微血管片段不僅可釋放血管生成因子（A ngiogenic factor，AF），而且含有許多脂肪干細胞和EPC，其中的脂肪干細胞相對于使用傳統方法得到的脂肪干細胞具有更強的分化和促血管生成能力[24]。微血管片段具有正常的血管形態學結構，含有中央腔，周圍包繞有內皮細胞和壁細胞，僅需要相互連接便可形成微血管網絡，可大大縮短血管化所需時間[23]。有研究將微血管片段應用于肌肉和骨組織工程，取得了較好的血管化效果[25-26]。工程組織血管化需要多種細胞參與，最近的研究發現，周細胞、血管平滑肌細胞對于新生血管的穩定和功能化非常重要，且不同動、靜脈或者不同組織器官的內皮細胞存在形態學和功能學差異，應在后續研究中加以注意[3]。

3　添加血管生成因子或采用基因修飾方法以促進血管化

應用AF包被，或與支架材料共價結合，是促進工程組織血管化的常用策略。Kim等[27]將VEGF包被于介孔二氧化硅納米微粒，然后將其融合于Ⅰ型膠原海綿構建復合支架，體外檢測VEGF可持續釋放超過28 d。雞胚絨毛尿囊膜實驗顯示，該復合支架與未添加VEGF的支架相比，可誘導更多的血管生成。然而，單一的AF通常并不能有效誘導形成成熟的血管網絡，可能會導致血管瘺、出血等并發癥。血管生成是一系列血管生成因子復雜調控的動態過程，且不同的AF在血管生成過程中的作用及作用靶點不同，因此聯合有序地應用多種AF非常關鍵[28-30]。Jiang等[31]將包被有VEGF和bFGF納米微球的膀胱脫細胞基質用于膀胱缺損修補，結果顯示實驗組可顯著改善新生膀胱組織攣縮現象，且新生組織的尿路上皮細胞、肌細胞排列情況，以及微血管密度和成熟度均優于單獨應用VEGF或bFGF組。由于不同AF的藥物釋放動力學不盡相同，為了達到最佳的促血管化效果，目前AF的釋放方式有待精細調控。此外，尚不清楚不同AF組合應用，對促血管化的效果，有待進一步的研究探討。

基因修飾有利于促血管生成相關基因的長期穩定表達。Zhang等[32]將編碼Hif-1的腺病毒載體復合明膠海綿，治療牙槽骨缺損大鼠模型，體外檢測Hif-1可持續釋放21 d，與對照組相比，可顯著誘導新生骨形成和血管生成。Zeng等[33]將轉染miRNA-210的慢病毒載體立體定位注射至小鼠大腦，與未轉染組小鼠相比，實驗組內皮細胞增殖速度、新形成的微血管數目顯著增加。通過基因修飾進行血管生成因子的時間和空間調控是一個非常具有前景的血管化策略，但可能存在致癌風險，需要細胞篩選和精細調控，以使得釋放的AF維持在理想水平，且需要長期隨訪，觀察血管生成之后AF的繼續釋放對新生血管的影響[2]。

4　預血管化方法以促進工程組織的血管化

預血管化是在上述三種血管化策略基礎上，在移植靶位置之前存在特定的體外或體內孵育血管網絡的階段。預血管化策略包括體外和體內兩種途徑。體外途徑主要指在體外培養血管生成相關細胞，形成微血管網絡后進行體內移植。體內途徑指將構建的工程組織先植入宿主體內血管豐富的部位，使得周圍血管長入組織，然后再將組織移植靶位置。

4.1　體外構建預血管化的工程組織

在體內移植之前，將內皮細胞等血管生成相關細胞植入支架材料，然后在特定的體外環境下孵育微血管網絡，以縮短工程組織移植體內后血管網絡形成的時間[21]。有研究將內皮細胞與其他細胞共培養構建細胞微球，經短期體外孵育即可形成含有密集微血管網絡的工程組織[34]。與單細胞相比，細胞微球含有更為緊密的細胞間聯系和細胞-細胞外基質聯系，具有更強的分化潛能，更能耐受缺氧環境，并具有更強的促血管化能力[21]。Sakaguchi等[35]將3層心肌細胞-內皮細胞共培養細胞片反復疊加于灌注有培養基的微通道膠原凝膠上方，其中的內皮細胞可組裝成微血管并向膠原凝膠內遷移，與膠原凝膠內的微通道建立連接，肉眼可見通過疊加細胞片構建的工程心肌組織同步收縮。Zhang等[36]利用微通道技術，構建含有可灌注微血管的心肌組織，并可與大鼠股動靜脈通過手術吻合。近年來，隨著微流控、大規模生物反應器等新技術的迅速發展，在體外構建復雜有序的微血管網絡正逐漸變成可能[37]。

4.2　體內構建含軸心血管的工程組織

體內預血管化以往常采用的方法是將支架置入體內血供豐富和容易操作的位置，如皮下或者肌肉“口袋”。盡管上述方法可使構建的組織血管化，但其移植到靶位置后仍需要較長時間與宿主血管連通，可能會造成細胞缺血死亡。因此，新的體內預血管化策略相繼出現，如動靜脈環路、含軸心血管的組織瓣技術等[21]。Tatara等[38]將聚甲基丙烯酸甲酯小室固定于肋骨膜上，室內填充成骨材料；在小室內骨組織新生的同時，骨膜血管網通過出芽方式長入新生骨組織內，從而獲得血管化的骨組織。由于肋骨膜血管網與鄰近的肋間動靜脈相互連通，從而構建出以肋間動靜脈為軸心血管的游離骨組織瓣，并成功地以此進行了下頜骨缺損修復。上述策略可使工程組織血管與靶點附近血管吻合，移植后可立即形成血流灌注。Kaempfen等[39]將種植有B MSC的脫細胞骨基質分別以3種方式修補兔節段性肱骨缺損模型：①直接原位移植；②被以腋動脈分支血管為軸心血管的肌肉瓣包裹后島狀移植至缺損處；③被以腋動脈分支為軸心血管的肌肉瓣包裹并體內孵育6周，然后再島狀移植至缺損處。結果發現，采用第3種方式構建的工程骨組織血管密度明顯高于另兩種。體內預血管化需較長時間才能實現最初的血管化，并可能導致機體創傷，微創、簡便、有效地體內預血管化是將來的研究方向。

5　展望

組織工程組織血管化已經取得了積極的進展，但對于較厚的復雜組織器官，血管化不足仍是亟待解決的難題。為實現工程組織及器官的充分血管化，單純地依賴一種血管化策略效果較差，根據不同的靶向器官組織，個性化地聯合應用多種血管化策略可能是今后的發展趨勢[3，21，40]。此外，今后還需通過長期觀察以探討新生血管的轉歸，從而驗證其有效性和安全性。iPSC、脂肪微血管片段、細胞片技術、微流控技術等的應用，為工程化組織的血管化研究提供了新的工具[21]。非編碼RNA、炎癥反應和血管生成主調控因子（如低氧誘導因子-1的調控）可能是影響工程組織血管化的主要機制，為組織工程血管化提供了理論基礎[41]。血管化的基礎是內皮細胞、壁細胞等血管生成細胞的組裝成管、穩定成熟，關鍵是細胞因子等微環境因素的調控。由于目前工程技術和細胞技術的限制，尚無理想的解決辦法，借助于體內軸心血管、利用體內微環境孵育血管化，或許是目前最佳的解決辦法。隨著工程學、生物學、臨床醫學等的密切合作和血管化策略的不斷進展，相信不久組織工程血管化不足的難題將會得到解決。

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